Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Общая характеристика метода ион-парной высокоэффективной жидкостной хроматографии 9
1.2. Общая характеристика метода ион-парной тонкослойной хроматографии 29
1.3. Факторы, влияющие на параметры удерживания сорбатов 31
1.4. Модели удерживания в ион-парной хроматографии 44
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть. 54
ГЛАВА 3. Изучение хроматографического поведения кислотных и основных производных бензола в водно-органических подвижных фазах методом ВЭЖХ 64
3.1. Влияние природы и концентрации органического модификатора 64
3.2 Влияние природы и кислотности буферного раствора 77
3.3. Влияние ионной силы и природы ионов фонового электролита 84
3.4. Математическое моделирование оптимальных условий хроматографирования сорбатов 92
ГЛАВА 4. Хроматографическое поведение сорбатов в присутствии ион-парных реагентов 96
4.1. Влияние природы и концентрации ион-парных реагентов 96
4.2. Влияние длины углеводородного радикала и природы полярной группы ион-парного реагента 108
4.3. Изотермы сорбции сорбатов в отсутствие и присутствии ИПР. Расчет энергии сорбции 111
4.4. Совместный эффект ион-парного реагента и электролита 115
ГЛАВА 5. Изучение хроматографического поведения сорбатов методом ТСХ 122
ГЛАВА 6. Практическое применение метода ион-парной ВЭЖХ в растворах ПАВ и электролитов 134
6.1 .Определение сульфацил - натрия в глазных каплях 134
6.2. Определение стрептоцида растворимого в жидких лекарственных формах 136
6.3.Определение бензойной кислоты в безалкогольном напитке «Колокольчик» 139
Выводы 142
Литература 144
Список сокращений 165
Приложение
- Общая характеристика метода ион-парной тонкослойной хроматографии
- Влияние природы и кислотности буферного раствора
- Влияние длины углеводородного радикала и природы полярной группы ион-парного реагента
- Определение стрептоцида растворимого в жидких лекарственных формах
Введение к работе
Высокоэффективная жидкостная хроматография занимает особое место среди физико-химических методов анализа, поскольку при относительно простом аппаратурном оформлении сочетает функции, как разделения, так и определения веществ в их смеси. Как и в любом другом методе химического анализа, проблемы повышения эффективности разделения и, следовательно, селективности определений остаются актуальными. Это объясняется сложностью объектов анализа, многообразием типов межмолекулярных взаимодействий между компонентами хроматографической системы, а также многофакторной зависимостью самого хроматографического процесса.
Одним из эффективных приемов повышения селективности разделения способных к ионизации сорбатов является ион-парный вариант ВЭЖХ. В зависимости от своей природы ион-парные реагенты модифицируют как подвижную, так и неподвижную фазы, но наиболее существенно меняют свойства сорбатов. Из литературы известно, что особенно сильно влияет на селективность разделения введение в ПФ длинноцепочечных гидрофобных противоионов, способных образовывать достаточно устойчивые ионные пары с разделяемыми соединениями. При разделении катионов, такими ион-парными реагентами являются анионы алкилсульфатов и алкилсульфонатов, а при разделении анионов - катионы тетраалкиламмония. Несмотря на распространенность и эффективность ион-парного варианта ВЭЖХ, его возможности в полной мере не изучены. Так, недостаточно исследовано взаимное влияние природы разделяемых компонентов и ион-парного реагента, концентрации и гидрофобных свойств ИПР, а также совместного действия ИПР и электролитов, практически всегда присутствующих при анализе сложных объектов. В связи с этим, постановка системных исследований, направленных на изучение действия этих факторов, и оптимизацию хроматографического процесса является актуальной.
Диссертационная работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ Грант № 01-03-32649.
Целью настоящей работы стало выявление закономерностей хроматографического разделения, обусловленных влиянием концентрации и гидрофобности ИПР и анионных, катионных и амфотерных сорбатов, присутствием электролитов и совместным влиянием гидрофобных ИПР и электролитов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить хроматографическое поведение исследуемых соединений в водно-органических подвижных фазах при варьировании природы и концентрации растворителя, фонового электролита и рН буферного раствора и выбрать оптимальные условия для ион-парного взаимодействия с противоионами ПАВ;
установить закономерности хроматографического разделения ионных сорбатов в присутствии различных ИПР и сильных электролитов и их совместном действии;
выявить влияние ИПР на распределение веществ между неподвижной и подвижной фазами и оценить энергию сорбции на неподвижной фазе;
- оценить влияние электролитов и ИПР на подвижность
соединений в методе ТСХ, сравнить их с результатами, полученными
для ВЭЖХ, и применить их для разработки методик определения
лекарственных препаратов и консервантов.
Научная новизна работы
- установлены закономерности влияния концентрации, гидрофобности ИПР и природы сорбируемых веществ в отсутствие и присутствии сильных электролитов на удерживание и селективность разделения кислотных и
7 основных производных бензола в условиях ОФ ВЭЖХ; показано, что совместное действие ИПР и электролитов сопровождается синергетическим эффектом; установлена линейная зависимость между удерживанием и логарифмом коэффициента распределения (гидрофобностью) производных бензола в системе н-октанол - вода;
- выявлено влияние ИПР на распределение сорбатов между НФ и ПФ и
оценена энергия сорбции производных бензола на НФ;
- исследовано влияние ИПР и электролитов на подвижность
соединений в методе ТСХ; показано, что закономерности разделения
исследуемых сорбатов в присутствии ИПР и электролитов в колоночном и
планарном вариантах жидкостной хроматографии идентичны;
- показана возможность применения методов обращено-фазовой ион-
парной ВЭЖХ и ТСХ для повышения эффективности и селективности
разделения и определения сульфаниламидных препаратов и консервантов.
Практическая значимость работы
Результаты изучения влияния сильных электролитов и ИПР на удерживание ионных сорбатов, эффективность и селективность их разделения могут быть использованы для прогнозирования условий хроматографирования других соединений аналогичной природы.
Разработаны методики определения сульфацил - натрия и стрептоцида растворимого в лекарственных формах, бензойной кислоты в безалкогольных напитках, характеризующихся широким диапазоном определяемых концентраций и точностью определения.
Показаны преимущества применения ПФ на основе ион-парных реагентов и сильных электролитов по сравнению с водно-органическими подвижными фазами для определения бензойных кислот и сульфаниламидных препаратов методом ТСХ.
8 На защиту выносятся
оптимизация хроматографического разделения кислотных и основных производных бензола методом ОФ ВЭЖХ в водно-органических подвижных фазах;
закономерности хроматографического разделения сорбатов в условиях ион-парной ОФ ВЭЖХ при варьировании ионной силы раствора, гидрофобности и концентрации ион-парного реагента;
оценка влияния электролитов и ИПР на подвижность ионных соединений в методе ТСХ и сравнение с действием указанных факторов в методе ОФ ВЭЖХ;
методики разделения и определения лекарственных препаратов и консервантов методами ОФ ион-парной ВЭЖХ и ион-парной ТСХ.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на: Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998 г.); II Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 1999 г.); VI конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2000» (Новосибирск, 2000 г.); ГХ Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии «Современное состояние и перспективы развития теории адсорбции» (Клязьма, 2000 г.); Международной конференции молодых ученых (Самара, 2000 г.); Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001 г.); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002 г.); Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002 г.)
Общая характеристика метода ион-парной тонкослойной хроматографии
Одним из эффективных приемов в ТСХ, также как и в ВЭЖХ, улучшающих разделение сложных смесей, способных к ионизации сорбируемых веществ, является применение в составе ПФ ион-парных реагентов [151-159]. Анализ известных работ показывает, что метод РШ ТСХ применяется в вариантах как предварительного импрегнирования пластин [151,152], так и их динамического модифицирования в процессе элюирования [153-155]. Таким образом, сорбат распределяется между ПФ и НФ и изменение селективности обусловлено различной устойчивостью и гидрофобностью ионных пар, которые определяются длиной углеводородного радикала ионов ПАВ. Характерными особенностями метода, влияющими на качество разделения сорбатов, являются полярность ПФ и концентрация ион-парного реагента. Авторы [153] описывают разделение фенольных соединений (диолов, бифенилов, производных нафталина) методом ИП ТСХ на Силикагеле и Сепароне С is- Отмечено, что при увеличении содержания воды до 30% в водно-метанольной ПФ подвижность изомеров уменьшается, и селективность разделения улучшается. С целью улучшения селективности разделения в ПФ добавляли ИПР, причем наилучшие результаты были достигнуты при использовании анионного ПАВ - ДДС. Присутствие ПАВ уменьшало поверхностное взаимодействие между гидрофобной поверхностью и водной составляющей элюента, что позволило увеличить содержание воды в ПФ от 30% до 40%). В результате улучшилось разделение исследуемых реагентов и значительно сократилось время анализа. Таким образом, увеличение полярности ПФ дает возможность одновременно разделить органические изомеры различной полярности на неполярной НФ.
Для разделения переходных металлов [156] рекомендовано применять бромид ЦТМА. Эффективность разделения в водно-этанольных смесях улучшается при введении ЦТМА, что позволяет отделить ионы ртути (II) от ионов кадмия (II) цинка (II) и кобальта (II). Вариант ион-парной ТСХ на силикагеле, импрегнированном бромидом ЦТМА, предложен для разделения 17 ионных пищевых красителей [151]. Авторами работы использовались ПФ, содержащие метанол - ацетон - 0,1М раствор ЦТМА. Данный метод хроматографирования отличается экспрессностью. В работе [158] изучено хроматографическое поведение 9 пищевых красителей на пластинах покрытых Лихросорбом RP-2, RP-8 и RP-18. В качестве ПФ применялись 0,1-1,0%раствор бромида тетрагексиламмония или 0,5% раствор цетримида в вводно-метанольной смеси (85:15). Авторами оценено влияние природы и концентрации противоиона в ПФ и длины алкильного остатка, присоединенного к силикагели на разделение пищевых красителей. Кроме, перечисленных работ описано применение метода для разделения алкил - и диалкилпроизводных анилина [152] в присутствии ионов ДДС, красителей в присутствии ЦТМА [154,155], а также ионов редкоземельных элементов [157]. Обзор литературных данных показывает, что метод ИП ТСХ распространен в анализе лекарственных препаратов [63,66,74,159]. Анализ работ, проведенный, в разделе 1.1 и 1.2 показывает, что на удерживание сорбатов в ИП ОФХ влияет большое число факторов: природа и концентрация органического модификатора в подвижной фазе, природа, концентрация и общая гидрофобная поверхность ИПР, ионная сила и рН элюента, природа неподвижной фазы и сорбируемых веществ, температура колонки. Рассмотрим результаты проведенных исследований более подробно. В ион-парной ОФ ВЭЖХ присутствие органического модификатора является обязательным, так как определяет элюирующую силу ПФ и растворимость образующейся ионной пары [1,3]. В основном используются водно-органические смеси, содержащие метанол и ацетонитрил (табл. 1 приложения). Они обладают высокой растворяющей способностью, однако большей вязкостью, чем индивидуальные компоненты, что может приводить к ухудшению разделения в процессе их хроматографирования [4,163]. Используемые концентрации растворителей разнообразны: от 5 об% до 80 об%. Присутствие органического растворителя приводит к двум основным эффектам: уменьшению диэлектрической проницаемости среды ПФ и адсорбции его молекул на поверхности НФ [1]. Установлено, что в ИПХ при больших концентрациях модификатора независимо от природы растворителя, удерживания сорбатов уменьшается. В основе этого эффекта, по-видимому, лежат конкурирующие процессы сорбции растворителя, ион-парного реагента или образующейся в ПФ ионной пары за место на поверхности НФ [1,2,4]. В работах [38-50] также подтверждается, что увеличение содержания органических модификаторов в ПФ приводит к монотонному уменьшению параметров удерживания соединений. Так, для хроматографирования хелатов металлов [90-95] использовали водно-метанольные и водно-ацетонитрильные смеси. Значения коэффициента ёмкости (К) всех комплексов значительно уменьшаются с увеличением содержания органического компонента ПФ.
Зависимость 1/К7 от концентрации органического растворителя в ПФ нелинейна. Отклонение от линейности особенно сильно проявляется в области малых концентраций органического модификатора (5-10об.%). Оптимальное объемное соотношение воды и органического растворителя выбирают по лучшему разрешению пиков и с учетом того, чтобы коэффициент емкости последнего пика не превышал 10-15 [90]. Введение ацетонитрила 30-45об.% приводит к уменьшению полярности ПФ, что вызывает уменьшение времен удерживания комплексов и ухудшение разрешения пиков. При разделении смеси, состоящей из витамина С, РР, витаминов Вь В2 и Вб, на колонке с Сепароном Cis [109,110] сильное влияние органического растворителя в ПФ на удерживание связывали с изменением значений рКа и рКв кислот и оснований, а также с их взаимодействием с компонентами ПФ. В работе [111] исследовано поведение жирорастворимых витаминов А, Дз, Е, К3 в режиме ОФ ВЭЖХ с целью подбора условий их определения в промышленных объектах. В качестве ПФ применяли смеси воды и изопропанола, с содержанием органического компонента 50-80об.%. Установлено, что с уменьшением содержания воды происходит уменьшение удерживания витаминов на НФ. На основании анализа полученных результатов авторами предложена математическая модель разделения, выведено уравнение селективности, отражающее влияние различных факторов. Кислотность элюента влияет на степень ионизации обоих компонентов ионной пары: анализируемого вещества и ИПР [1,3,4,9]. Как показано в разделе 1.1 этот фактор особенно существенен при разделении ионов слабых электролитов [35,38,40-43] и ионизированных форм хелатов
Влияние природы и кислотности буферного раствора
При исследовании влияния кислотности среды значения рН выбирали, учитывая рК диссоциации соединений кислотного характера и рК протонирования - основного (табл. 3.4 - 3.6), так как перевод вещества в диссоциированную (протонированную) форму является важным для ион-парного варианта хроматографирования. В соответствии с этим хроматографическое поведение бензойных кислот изучали в интервале рН 3-6, создаваемым ацетатно-аммиачным и цитратным буферными растворами [195,196]. В случае бензол сульфокислот использован диапазон рН 2-5. Зависимости К от рН подвижной фазы для бензойных кислот приведены на рис 3.12-3.15, из которых видно, что с ростом рН как в ацетатно-аммиачном, так и в цитратном буферных растворах, параметры удерживания сорбатов уменьшаются, что свидетельствует об усилении переноса ионизированных форм частиц полярной ПФ и уменьшении сродства к неполярной НФ. Для подтверждения характера зависимостей К от рН, установленных экспериментально, рассчитаны теоретические зависимости К - рН, описываемые уравнением [1,12] [Н+] где Ка - константа диссоциации кислоты, [ІҐ] - концентрация ионов водорода в ПФ, К0 - удерживание нейтральной молекулы, К1.] - удерживание диссоциированной формы.
Сопоставление экспериментальных результатов с расчетными показывает достаточно хорошее их совпадение общего характера изменений К от рН. Установлено, что наиболее эффективным элюентом является ацетатно-аммиачный буферный раствор с рН 5,0, который и использовался для проведения дальнейших исследований. На рис 3.16-3.17 представлены графические зависимости К - рН для бензолсульфокислот в ацетатно аммиачном и нитратном буферных растворах. Рис.3.17. Зависимости удерживания бензолсульфокислот от рН 1-ТСК, 2-БСК, 3-СК, Стек =СБСК =3,0104М, Сск =3,0 10-5 М ПФ: метанол - нитратный буферный раствор (1:9), НФ: Силасорб С18 Найденные зависимости отличаются от данных, представленных на рис.3.12-3.15 и требуют более глубокого исследования. Для дальнейших исследований в качестве оптимальной выбрана ПФ на основе цитратного буферного раствора с рН 4 - 5. Изменение коэффициентов емкости нитроанилинов в широком интервале рН показано на рис. 3.18, из которого видно, что уменьшение кислотности среды приводит к монотонному возрастанию удерживания соединений в следствии увеличения содержания в растворе нейтральной формы, что согласуется с данными представленными в табл. 3.5. 81 В более кислой области провести исследования не удалось, поскольку, применение обращенно-фазовых сорбентов на основе силикагеля допустимо лишь в интервале рН 3 - 8 [3]. В кислой области происходит отщепление привитых к силикагелю групп, а в сильнощелочной среде - гидролиз силанольных групп силикагеля. К1 5 аммиачный буферный раствор (6:4) НФ: Силасорб d8 Наиболее сложным является интерпретация результатов хроматографирования амидов сульфаниловой кислоты вследствие их амфотерности и одновременного существования в растворе разных форм: протонированной, молекулярной и диссоциированной (табл. 3.6). Изучение влияния рН было проведено для ацетатно-аммиачного и фосфатного буферных растворов, выбранных согласно [75,167]. Установлено, что независимо от природы буфера зависимость удерживания амидов сульфаниловой кислоты от кислотности среды имеет вид параболы, что, возможно, соответствует переходу одной формы в другую с изменением рН раствора подвижной фазы (рис.3.19). В качестве оптимальных для этих систем выбраны две ПФ: ацетатно-аммиачный буфер с рН 4 и фосфатный буферный раствор с рН 7. Первая ПФ соответствует преимущественному преобладанию протонированной формы, вторая - диссоциированной. Результаты проведенного исследования для всех анализируемых соединений обобщены в таблице 3.7. Основанием выбора оптимальных условий хроматографирования явилось удовлетворительное разрешение и симметричность пиков. С целью оптимизации разделения исследуемых соединений в ПФ добавляли неорганические соли, варьируя ионную силу раствора. Влияние концентрации электролита оценивали в широком интервале значений д=0,3 -2,1, с учетом собственной ионной силы буферного раствора.
Добавки электролитов вводили за счет уменьшения водной составляющей в подвижной фазе. На рис. 3.20. представлены хроматограммы и зависимости удерживания бензойных кислот от концентрации электролита в ПФ. Как видно из приведенных данных, с повышением концентрации КС1 имеет место возрастание параметров удерживания исследуемых соединений, что может быть объяснено высаливающим действием электролита и усилением сорбции бензойных кислот на неполярной неподвижной фазе [180,199]. Как видно из приведенных данных при возрастании концентрации электролита удерживание всех кислот увеличивается приблизительно на 300 - 400 мкл. Порядок элюирования согласуется с изменением гидрофобных свойств этих кислот (табл. 3.1). Более гидрофобные БК и НБК сильнее связываются с неполярной НФ, чем АБК и ГБК. Повышение ионной силы раствора приводит также к некоторому улучшению эффективности и селективности разделения АБК и ГБК, имеющих близкие параметры удерживания (табл. 3.8). Оценено влияние ионной силы, создаваемой добавками хлорида калия на параметры удерживания бензол-, толуол-, и амино- сульфокислот. Результаты представлены на рис. 3.21 и 3.22. Как видно из представленной зависимости, изменение параметров удерживания исследуемых соединений согласуется с ранее полученными экспериментальными данными и свидетельствует об усилении связывания кислот с гидрофобной НФ при возрастании концентрации фонового электролита в подвижной фазе. Результаты оценки эффективности и селективности разделения «критической» пары СК - БСК при варьировании концентрации хлорида калия (табл. 3.9) показывают, что с ростом ji значения этих параметров увеличиваются, что приводит к лучшему разрешению хроматографических пиков.
Влияние длины углеводородного радикала и природы полярной группы ион-парного реагента
В выбранных условиях оценено влияние длины углеводородного радикала на параметры удерживания сорбатов. Установлена линейная связь (табл. 4.4) между длиной углеводородного радикала ПАВ и коэффициентами емкости всех соединений, которая представлена на рис 4.15-4.18. Влияние этого фактора на хроматографическое поведение бензойных кислот изучено на примере хлорида ЦП и бромида ЦТМА. Зависимости К от концентрации хлорида ЦП приведена на рис. 4.19. Сравнивая рис.4.7. и 4.19. можно отметить, что природа полярной группы не оказывает существенного влияния на хроматографическое поведение бензойных кислот. Эффективность и селективность разделения «критической пары» не меняется. Дальнейшим этапом изучения хроматографического поведения исследуемых веществ стало построение изотерм сорбции в присутствии и отсутствие ПАВ.
Расчет концентраций вещества, распределившегося между ПФ и НФ, проводили по уравнению: где Cs - концентрация сорбата на поверхности НФ, мМ С« - предельная концентрация сорбата на поверхности НФ, мМ Ст- концентрация сорбата в ПФ, М b - коэффициент, характеризующий состояние сорбционного равновесия (Ь=1). При построении изотерм использовали только ее линейную часть, так как эта область соответствует ион-парным взаимодействиям с ПАВ. На рис.4.20, 4.21 представлены изотермы сорбции аминобензойной кислоты и стрептоцида в отсутствие и в присутствии ПАВ. Как видно из сравнения этих данных в присутствии ПАВ угол наклона изотерм растет, что свидетельствует об увеличении коэффициента распределения веществ между неподвижной и подвижной фазами: Ст - концентрация вещества в ПФ. Это свидетельствует об увеличении сродства сорбатов к НФ и находит подтверждение при расчете энергий сорбции в отсутствие и присутствии ПАВ. соединений от рН ПФ в отсутствие и в присутствии ион-парного реагента, при постоянной ионной силе, примеры, которых представлены на рис 4.22-4.23. Значения энергии сорбции бензойных кислот и сульфаниламидов в условиях ион-парной и обращенно-фазовой ВЭЖХ приведены в табл. 4.5-4.6, из которых видно, что в присутствии ПАВ наблюдается возрастание A(AG), приводящее к улучшению разделения сорбатов. Видно, что порядок элюирования бензойных кислот согласуется с изменением энергии сорбции. В присутствии ПАВ наблюдается возрастание энергии сорбции, что свидетельствует об улучшении разделения бензойных кислот в ион-парном варианте по сравнению с обращено-фазовом вариантом ВЭЖХ. Дальнейшим этапом исследования стало изучение хроматографического поведения сорбатов на примере бензолсульфокислот под действием двух факторов - ионной силы и ИПР. Исследование этих факторов проводили двумя способами: первый - варьировали только концентрацию ПАВ при постоянной концентрации электролита, и второй -варьировали только концентрацию электролита при фиксированной концентрации ПАВ. Результаты представлены на рис 4.24.и 4.25. Сравнение данных, представленных на рис 3.24 и 4.25,4.26 показывает, что в присутствии хлорида ЦП наблюдается увеличение параметров удерживания бензолсульфокислот и их сдвигов с увеличением концентрации электролита. Так, в отсутствии ЦП AVR (СК) = 170 мкл, AVR (ТСК) =200 мкл. В присутствии ЦП AVR =320 мкл и 450 мкл для СК и ТСК соответственно. Для характеристики эффективности и селективности разделения критической пары рассчитаны коэффициент селективности, разрешение, число теоретических тарелок, приведенные в табл. 4.7. Аналогичным образом изучено хроматографическое поведение бензолсульфокислот при варьировании концентрации хлорида ЦП в присутствии КС1. Результаты хроматографирования бензолсульфокислот при постоянной ионной силе приведены на рис. 4.26,4.27 и в табл. 4.8.
Сравнение результатов, представленных на рис 4.9 и 4.26 показывает, что в присутствии фиксированной концентрации сильного электролита и переменной концентрации ЦП коэффициенты емкости имеют практически те же значения, что и в отсутствие электролита. Однако, направленность изменения параметров удерживания сохраняет свой характер. Сдвиги в параметрах удерживания также не изменились и составляют 350 и 450 мкл для СК и ТСК соответственно. Увеличение концентрации КС1 на фоне К ПАВ практически не влияет на эффективность разделения, Сравнительный анализ сдвигов в удерживании показал, что влияние ПАВ выражено сильнее, чем электролита (табл. 4.9), а суммарное их действие сопровождается
Определение стрептоцида растворимого в жидких лекарственных формах
В мерные колбы объемом 25мл, вносят 0,25-1,25 мл стандартного раствора стрептоцида растворимого С = 50 мг/мл. Разбавляют до метки дистиллированной водой. Хроматографическую колонку регенирируют 500 мкл ацетонитрила. Затем пропускают через колонку 800 мкл подвижной фазы, состоящей из 5 мл ацетонитрила, 10,62 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора рН 7,4, 0,38 мл 1-10" М хлорида цетилпиридиния и 4 мл 2,5М хлорида калия. Подвижную фазу предварительно фильтруют через мембранный фильтр и дегазируют в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Хроматографирование проводят в следующих режимах: - объём ПФ: 500 мкл; - скорость элюирования: 100 мкл/мин; - длина волны детектирования: 280 нм; - объём пробы: 6 мкл; На рис. 6.2 представлен градуировочный график для определения стрептоцида растворимого. Для определения стрептоцида растворимого в лекарственных формах отбирают аликвотную часть (2-4 мл) препарата и помещают в мерную колбу объемом 25мл, доводят до метки дистиллированной водой. Далее проводят операции, аналогичные построению градуировочного графика. Определение содержания стрептоцида проводят по градуировочному графику. Полученные результаты представлены в табл. 6.3-6.4,
Правильность определения подтверждали фармакопейным титриметрическим методом [70,72]. Результаты, полученные в ходе титриметрического определения, обработанные статистически, представлены в табл. 6.4. Обработка результатов двух методов по F- и t - критерию показала отсутствие систематической ошибки. Бензойная кислота и ее натриевая соль допущены в качестве консервантов для некоторых пищевых продуктов [36]. В связи с тем, что условно допустимая доза бензойной кислоты для человека составляет 5-10 мг/кг массы тела, существуют ПДК этого консерванта в пищевых продуктах. Так, в мармеладе, пастиле, повидле - 700 мг/кг, в рыбных консервах и плодово-ягодных соках 1000 мг/кг [205,206]. В количествах, превышающих допустимые для консервирования дозы, бензойная кислота может вызывать тошноту, рвоту, жжение в желудке, головную боль, учащение сердечной деятельности, что приводит к необходимости контроля ее содержания. Нами разработана ВЭЖХ - методика определения бензойной кислоты в безалкогольных напитках с использованием ПФ, содержащих ИПР и электролит. В мерные колбы вместимостью 25 мл вносят 0,1-0,5 мл стандартного раствора бензойной кислоты С = 150 мг/мл. Разбавляют до метки дистиллированной водой. Хроматографическую колонку предварительно регенирируют 900 мкл ПФ, состоящей из смеси изопропилового спирта с водой (1:1). Затем пропускают 600 мкл подвижной фазы для анализа, состоящей из 1мл изопропанола, 4,8 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора рН 5, 0,6 мл 1-10" бромида ДДТМА, 3,6 мл 2,5М хлорида натрия до получения стабильной нулевой линии.
Хроматографирование проводят в следующих режимах: - объём ПФ: 500 мкл; - скорость элюирования: 100 мкл/мин; - длина волны детектирования: 254 нм; - объём пробы: 6 мкл; Для определения бензойной кислоты в напитке отбирают аликвотную часть 2-3 мл, помещают в мерную колбу объемом 25 мл, доводят до метки 1. Изучено влияние природы и концентрации органического растворителя, ион-парного реагента и сильных электролитов на удерживание и хроматографическое разделение производных бензойной кислоты, бензолсульфокислот, амидов сульфаниловой кислоты и изомеров нитроанилина в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ. Показано, что влияние органического растворителя на удерживание определяется характером взаимодействия сорбата с модифицированной неподвижной фазой. Введение в подвижную фазу гидрофобных ИПР и сильных электролитов во всех случаях увеличивает удерживание указанных сорбатов. Найдены оптимальные условия разделения указанных соединений (рН, концентрация органического растворителя, ИПР, электролита). 2.
Выявлены закономерности влияния концентрации ИПР, сильного электролита, органического растворителя на удерживание исследуемых соединений в ОФ ВЭЖХ: увеличение концентрации спирта, ИПР, электролита в ПФ и длины углеводородного радикала ИПР увеличивает удерживание сорбатов, между коэффициентами емкости сорбатов и длиной углеводородного радикала ИПР существует линейная зависимость; увеличение концентрации электролита и ИПР увеличивает эффективность и улучшает селективность разделения сорбатов, а их совместное применение сопровождается синергетическим эффектом; изменение удерживания определяется не только гидрофобностью ИПР, но и сорбата. Показано, что между логарифмом коэффициента распределения в системе н-октанол - вода, характеризующим гидрофобность горбата, и его удерживанием существует линейная зависимость.
3. Построены изотермы сорбции и рассчитано изменение свободной энергии сорбции кислотных и основных производных бензола на ОФ сорбентах. Рассмотрена возможность использования математических моделей при характеристике влияния различных факторов на хроматографическое поведение систем. 4. Проведено сравнение разделения производных бензола методом ион-парной ВЭЖХ и ТСХ на силикагеле в условиях динамического модифицирования НФ. Установлено, что введение в ПФ электролитов и гидрофобных РШР при разделении методом ТСХ также увеличивает удерживание сорбатов. Показано, что между величиной Rf и коэффициентом емкости в ВЭЖХ существует обратно пропорциональная зависимость. 5. Разработаны методики определения сульфацил - натрия в глазных каплях и стрептоцида в жидких лекарственных формах, а также бензойной кислоты в безалкогольных напитках методом ион-парной обращенно-фазовой ВЭЖХ. Показана возможность применения ион-парной ТСХ для экспрессного разделения бензойных кислот и амидов сульфаниловой кислоты в их смесях.
