Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы определения стероидных гормонов, флавоноидов, сапонинов и аминокислот (обзор литературы) 14
1.1. Общая характеристика исследуемых БАВ 14
1.2. Нехроматографические методы анализа БАВ 17
1.3. Хроматографические методы анализа БАВ
1.3.1. Тонкослойная хроматография 25
1.3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 32
1.3.3. Тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматография в организованных средах 39
Глава 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Объекты исследования 45
2.2. Техника эксперимента в тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии 52
2.3. Методика хроматографирования. Расчет параметров эффективности и селективности 53
2.4. Расчет коэффициентов распределения в системах вода -мицелла ПАВ - НФ и вода - циклодекстрин - НФ 56
2.5. Методики получения водно-спиртовых извлечений биологически активных веществ из лекарственных препаратов синтетического и растительного происхождения, пищевых продуктов 60
Глава 3. Влияние природы и концентрации органического растворителя на хроматографическое поведениесорбатов 62
3.1. Тонкослойная хроматография 62
3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 76
Глава 4. Хроматографическое поведение исследуемых биологически активных веществ в мицеллярных подвижных фазах 80
4.1. Тонкослойная хроматография 80
4.1.1. Водно-мицеллярные подвижные фазы 80
4.1.2. Мицеллярные подвижные фазы, модифицированные органическим растворителем и сильным электролитом
4.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 101
4.3. Количественные характеристики разделения в МПФ 104
Глава 5. Хроматографическое поведение сорбатов в водных циклодекстриновых подвижных фазах, модифицированных органическими растворителями и электролитами 110
5.1. Влияние природы и концентрации циклодекстринов ПО
5.2. Совместное влияние циклодекстринов, органических растворителей и сильных электролитов 117
5.3. Количественные характеристики разделения сорбатов в циклодекстриновых подвижных фазах 126
Глава 6. Практическое применение методов тсх и вэжх в модифицированных подвижных фазах на основе пав и циклодекстринов 131
6.1. Определение степени чистоты кортикостероидных гормонов 131
6.2. Хроматографическое определение прогестерона в лекарственных препаратах «Депо-провера» и «Дюфастон» 133
6.3. Количественное определение флавоноидов в лекарственных объектах и пищевых продуктах 1 6.3.1. Определение кверцетина и рутина в лекарственных объектах методом нормально-фазовой тонкослойной хроматографии 137
6.3.2. Определение кверцетина и рутина методами обращенно-фазовой тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии 141
6.4. Количественное определение сапонинов в лекарственных растениях и пищевых продуктах 147
6.5. Хроматографическое определение аминокислот в лекарственных препаратах методом нормально-фазовойтонкослойной хроматографии 152
6.5.1. Определение аминокислот в препарате «Нефрамин» 152
6.5.2. Определение аминокислот в препарате «Гидролизин» 153
6.5.3. Результаты количественного определения триптофана и
лейцинав препарате «Гидролизин» 154
Выводы 156
Список литературы 158
Приложение
- Тонкослойная хроматография
- Методика хроматографирования. Расчет параметров эффективности и селективности
- Высокоэффективная жидкостная хроматография
- Высокоэффективная жидкостная хроматография
Введение к работе
Актуальность. Биологически активные вещества (БАВ) разной природы - стероидные и тритерпеновые гормоны, полифенолы, сапонины, аминокислоты, фторхи-нолоны, хинолоны и др. в последнее время вызывают возрастающий интерес в связи с участием во многих физиологических и биохимических процессах в живых организмах и широким применением в медицине, фармацевтике, пищевой промышленности, животноводстве и других областях. Широкий ассортимент выпускаемых на их основе коммерческих продуктов, а также разнообразные источники БАВ растительного происхождения требуют разработки простых, доступных и эффективных методов их разделения, идентификации и количественного определения в различных сложных объектах. Одним из таких методов является жидкостная хроматография (ЖХ). Разнообразие природы и свойств БАВ предполагает возможность регулирования эффективности и селективности их разделения с помощью комбинирования различных по природе неподвижных (НФ) и подвижных фаз (ПФ), например, водно-органических, ми-целлярных или циклодекстриновых. Несмотря на то, что разделению БАВ методом жидкостной хроматографии посвящено большое число публикаций, полной предсказуемости влияния природы различных модификаторов ПФ до настоящего времени не имеется. Развитие таких исследований позволяет оптимизировать разделение конкретных БАВ в данном конкретном объекте, а также увеличить базу хроматографиче-ских данных для лучшего понимания общих закономерностей разделения БАВ. Данная работа является частью плановых госбюджетных исследований кафедры аналитической химии и химической экологии, а также выполнялась в соответствии с проектом РФФИ № 12-03-00450а.
Цель работы состояла в оценке влияния поверхностно-активных и циклодекстриновых модификаторов водных и водно-органических подвижных фаз на хро-матографическое разделение и определение стероидных гормонов, флавоноидов, сапонинов и аминокислот.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить хроматографические свойства индивидуальных соединений и их смесей методами ТСХ и ВЭЖХ в водно-органических, мицеллярных и циклодекстриновых ПФ и выявить факторы, влияющие на селективность и эффективность разделения на конкретных НФ;
изучить влияние природы и концентрации поверхностно-активных веществ (ПАВ) и циклодекстринов (ЦД) на подвижность и разделение исследуемых соединений методами ТСХ и ВЭЖХ на нормальной и обращенной фазах;
рассчитать и сравнить количественные характеристики эффективности и селективности разделения БАВ для исследуемых комбинаций НФ и ПФ и выявить лучшие хроматографические системы;
рассчитать количественные характеристики, характеризующие солюбилиза-цию БАВ в мицеллы ПАВ и полость циклодекстринов, и установить их взаимосвязь с гидрофобностью исследуемых веществ;
разработать методики хроматографического разделения и определения БАВ в лекарственных препаратах синтетического и растительного происхождения, пищевых продуктах.
Научная новизна:
- установлены закономерности и выявлены факторы, влияющие на удержива
ние и хроматографическое разделение исследуемых БАВ методами ТСХ и ВЭЖХ в
водно-органических, мицеллярных и циклодекстриновых ПФ, позволяющие прогнозировать пути оптимизации разделения и определения компонентов сложных смесей БАВ на некоторых нормальных и обращенных неподвижных фазах;
выявлены зависимости, характеризующие влияние концентрации и природы мицелл ПАВ в водной и водно-органической ПФ на подвижность и хроматографиче-ское разделение различных классов БАВ методами ТСХ и ВЭЖХ на нормальной и обращенной фазах;
установлены зависимости, характеризующие влияние концентрации и природы циклодекстринов на подвижность и хроматографическое разделение исследуемых БАВ в водной и водно-органической ПФ методом ТСХ на различных НФ;
рассчитаны параметры, характеризующие эффективность и селективность хроматографического разделения исследуемых БАВ методами колоночной и планар-ной ЖХ для исследованных комбинаций ПФ и НФ;
рассчитаны три типа коэффициентов распределения сорбатов, характеризующих равновесные процессы солюбилизации в мицеллы ПАВ и полость циклодекстринов, позволяющие оценить вклад гидрофобности сорбатов и прогнозировать порядок их элюирования методом ТСХ в нормально-фазовом и обращенно-фазовом режимах хроматографирования;
найдены оптимальные условия разделения БАВ, принадлежащих к различным классам.
Практическая значимость. Полученные результаты позволяют расширить возможности метода жидкостной хроматографии при разделении различных классов БАВ, используя для динамической модификации водные и водно-органические ПФ, мицеллы ПАВ и циклодекстрины. Установлено, что применение мицеллярных и циклодекстриновых подвижных фаз приводит к значительному увеличению числа теоретических тарелок, уменьшению высоты, эквивалентной теоретической тарелке, повышению селективности и улучшению разрешения в хроматографических системах, повышению чувствительности определения сорбатов. На основе результатов проведенных исследований:
разработаны методики оценки степени чистоты и разделения стероидных гормонов методами тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии с мицеллярными подвижными фазами, а также методики определения прогестерона в лекарственных препаратах "Депо-провера" и "Дюфастон";
разработаны методики определения кверцетина и рутина в лекарственных препаратах растительного происхождения методом нормально-фазовой ТСХ (софора японская, прополис сухое вещество и настойка), а также в лекарственных препаратах, овощах, ягодах, фруктах и растениях методами обращенно-фазовой ТСХ и ВЭЖХ (аскорутин, шелуха лука, цедра мандарина, яблоко красное, яблоко зеленое, смородина черная, черника, петрушка, свекла, эхинацея, клевер красный);
разработаны методики количественного определения олеаноловой и глицир-ризиновой кислот в лекарственных препаратах растительного происхождения (корни солодки, настойка солодки), в пищевых продуктах (свекла столовая, слива, баклажан, картофель) методом обращенно-фазовой ТСХ;
разработаны методики идентификации и количественного определения тирозина, лейцина, триптофана в лекарственных препаратах "Нефрамин" и "Гидролизин" методом нормально-фазовой ТСХ в циклодекстриновых ПФ.
На защиту автор выносит:
- результаты изучения хроматографических свойств исследуемых БАВ в вод-
но-органических подвижных фазах;
закономерности поведения сорбатов в водных и модифицированных мицел-лярных подвижных фазах;
закономерности поведения сорбатов в водных и модифицированных цикло-декстриновых подвижных фазах;
количественные характеристики, характеризующие солюбилизапию БАВ в мицеллы ПАВ и полость пиклодекстринов и их взаимосвязь с гидрофобностью исследуемых веществ;
результаты применения ПФ на основе водных и модифицированных мицел-лярных растворов ПАВ и пиклодекстринов для оценки степени чистоты, разделения и количественного определения биологически активных веществ в лекарственных препаратах растительного и синтетического происхождения и пищевых продуктах.
Апробация результатов исследования. Основные результаты работы доложены на X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва (Клязьма), 2006), International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Moscow, 2006), Всероссийских научно-практических конференциях «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции» (Саратов 2007, 2008), 10і Analytical Russian-German-Ukrainian Symposium «ARGUS' 2007 - Nanoanalytics» (Saratov, 2007), VI - IX Всероссийских конференциях молодых ученых с международным участием «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2007, 2010, 2011, 2013), Международной научно - практической конференции «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, 2009), I Всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, 2009), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2010), Всероссийской конференции «Хроматография - народному хозяйству» (Дзержинск, 2010), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), III Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011), VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев -2012» (Санкт-Петербург, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Химия биологически активных веществ» (Саратов, 2012), Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием (Краснодар, 2012), Конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской, учебно-методической и воспитательной работы за 2012 год (Саратов, 2013), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ - 2013» (Москва, 2013), Втором съезде аналитиков России (Москва, 2013).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 33 работы: 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 15 статей в сборниках, 13 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 171 странице, включая введение, 6 глав, выводы, список литературы, содержащий 184 ссылки, приложение. Работа содержит 68 рисунков и 48 таблиц.
Тонкослойная хроматография
Гормоны. Для количественного анализа гормонов наиболее часто применяют следующие группы методов: химические [19, 20], биологические [21, 22], иммунологические [2, 23], методы сатурационного анализа [24]. Данная классификация в значительной мере условна и, по существу, большинство методов являются комбинированными. Например, радиоиммунологическое определение гормонов представляет собой разновидность сатурационного анализа, подобно радиорецепторным методам, но в отличие от последних оно проводится с использованием специфических антисывороток, что объединяет радиоиммунологический анализ с чисто иммунологическими методами.
Так, в работе [2], предложена методика определения микрокомпонентов стероидов в плазме крови с применением иммуносорбента, меченного ферментом, а авторы работы [23] разработали экспрессную методику иммунофильтрования для детектирования тестостерона в пробах сыворотки крови. Важным этапом практически всех химических методов является измерение физических характеристик гормонов или продуктов их химических превращений. При этом о количестве гормона судят по величине светопоглощения, интенсивности флуоресценции, изменению электрохимических свойств растворов [19, 20], физических характеристик электронного или ионного поля в детекторах газовых хроматографов и т.д.
Биологические методы базируются на учете специфического биологического действия гормонов при тестировании на животных или «in vitro» [25]. Эти биологические эффекты оцениваются по изменению массы органов, гистологического строения, физиологических и биохимических реакций. Сравнительно недавно появилось немало удачных модификаций тестирования тропных гормонов и гипоталамических рилизинг-факторов в биологических системах «in vitro» (ткани, гомогенаты, клеточные суспензии) с последующим радиоиммунологическим или флуориметрическим определением гормонов, секреция которых изменяется под влиянием тестируемых препаратов. В работе [26] представлены данные по применению флуоресцентного биосенсора для определения стероидного гормона тестостерона в объектах окружающей среды без предварительных пробоподготовки и концентрирования с помощью промышленных иммунохимических средств.
В последние годы прослеживается отчетливая тенденция к постепенному вытеснению традиционных биологических, иммунологических и некоторых химических методов радиоиммунологическими и радиолигандными, прежде всего для клинических целей [2]. Эти методы оказались более чувствительными, менее громоздкими, особенно при наличии коммерческих наборов, более воспроизводимыми и достаточно специфичными.
Флавоноиды. Основными нехроматографическими методами определения полифенольных соединений являются прежде всего спектрофотометрические [27-36], люминесцентные [37-39] и электрохимические [40-48] методы, а также капиллярный электрофорез [49-53].
В работе [30] разработаны методики фото- и спектрофотометрического определения рутина в нейтральных и щелочных средах, установлены спектральные характеристики рутина. Установлено, что наиболее интенсивный максимум в УФ-спектре рутина наблюдается при длине волны 267 нм (по литературным данным [31], 264 нм), фотоколориметрический максимум поглощения находится при длине волны 364 нм, что соответствует литературным данным [31]. Проведена экстракция рутина растворителями разных гомологических рядов (алифатические спирты и алкилацетаты нормального строения), рассчитаны коэффициенты распределения и степень извлечения рутина в изучаемых системах. Установлено, что максимальная степень извлечения рутина наблюдается при экстракции амиловым эфиром уксусной кислоты (90 %). Предложенная методика экстракционно-фотометрического определения рутина позволяет определять его содержание в лекарственных препаратах в интервале концентраций от 0,25-10"5 до 5,0-10"5 М.
Значительное количество исследований посвящено определению флавоноидов метод дифференциальной спектрофотометрии с использованием комплексообразующих ионов алюминия [32, 33, 54-58] и меди [59], т.к. эти реакции являются наиболее селективными при определении фенольных соединений в лекарственных препаратах синтетического и растительного происхождения.
Так, авторами работы [54] разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в плодах черемухи обыкновенной. Относительная погрешность определения не превышала ±5,4%. Выделение флавоноидов из сырья проводили путем экстрагирования образцов 50%-ным этанолом при нагревании на водяной бане. Установлено, что оптимальным условием для выделения суммы флавоноидов из растительного сырья является двукратная экстракция (по 45 мин.) 50%-ным этанолом при соотношении сырья и экстрагента 1:30. Показано, что максимум поглощения водно-спиртовых экстрактов из плодов черемухи обыкновенной наблюдается при длине волны 365 нм. Для отделения флавоноидов от сопутствующих веществ использовали реакцию комплексооборазования с раствором хлорида алюминия (А1С13). Для предотвращения гидролиза флавоноидов реакцию комплексообразования проводили в присутствии 33%-ной уксусной кислоты. При изучении стабильности продуктов реакции суммы флавоноидов черемухи обыкновенной с 2%-ным раствором АІСІз во времени установлено, что оптическая плотность достигает максимума через 30 мин и остается стабильной в течение 8-10 мин.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве фиалки трехцветной представлена в работе [55]. Как и в [54], при проведении анализа с целью улучшения воспроизводимости результатов пробы подкисляли уксусной кислотой для переведения флавоноидов и сопутствующих веществ в недиссоциированную форму. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Были изучены оптимальные условия проведения фотометрической реакции, установлено, что максимальная оптическая плотность достигается при использовании 2,0 мл извлечения с 5,0 мл 5%-ного раствора хлорида алюминия в 70%-ном этаноле. Устойчивое окрашивание достигается через 30 мин и сохраняется в течение 1,5 ч. Установлено, что содержание суммы флавоноидов составляет 2,2-4,1%.
Авторами работы [37] разработана методика определения кверцетина в лекарственных растениях (шишках хмеля, расторопше, шелухе лука) и в настойках (боярышника, эвкалипта, прополиса, цветков софоры, календулы), основанная на использовании собственной твердофазной люминесценции кверцетина, усиливающейся в присутствии иттрия (III). Показано, что в присутствии иттрия (III) интенсивность люминесценции кверцетина возрастает в 90 раз. Исследована сорбция комплекса на различных сорбентах: цеолитах (СаА, NaA), фосфате алюминия, силикагеле, Sephadex. Максимальная люминесценция комплекса наблюдается на фосфате алюминия, модифицированном ионами иттрия (III) и на селикагеле. Установлено, что интенсивность комплекса на фосфате алюминия возрастает в 2,5 раза в присутствии лаурилсульфата натрия и в 3 раза в присутствии триоктилфосфиноксида.
Широкое распространение в анализе флавоноидов получили электрохимические методы в связи с возможностью окисления флавоноидов на различных электродах. При этом используются различные варианты вольтамперометрии [42-44].
Методика хроматографирования. Расчет параметров эффективности и селективности
Как показано выше, жидкостная хроматография широко используется при решении разнообразных аналитических задач, связанных с определением биологически активных веществ в сложных многокомпонентных смесях. Известно, что основным приемом эффективного разделения и определения является варьирование состава ПФ и природы НФ. В этой связи особое значение получило направление, связанное с применением в составе подвижных фаз мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ) [146-148, 150] и циклодекстринов (ЦД) [149, 150]. Установлено, что водные растворы ПАВ и ЦД способны модифицировать ПФ, а ПАВ и НФ, в результате чего последние приобретают качественно новые свойства, а метод жидкостной хроматографии - новые аналитические возможности [148, 151, 152]. Подвижные фазы, содержащие мицеллы ПАВ, называют мицеллярными подвижными фазами (МПФ) [151], а основными переносчиками разделяемых веществ являются прямые и обратные мицеллы ПАВ, избирательно солюбилизирующие гидрофобные и гидрофильные, нейтральные и заряженные вещества. Уникальной способностью ЦД является образование комплексов включения «гость-хозяин», в которых полость циклодекстрина выступает в роли «хозяина» для широкого круга органических и неорганических молекул и ионов, образуя соединения за счет гидрофобного, дисперсионного взаимодействий и водородной связи [149]. Избирательность включения определяется соответствием размера полости циклодекстрина размеру молекулы-гостя, а также эффективностью связывания субстрата с внутренней поверхностью полости ЦД. Однако в мировой литературе по ТСХ и ВЭЖХ имеется всего несколько публикаций по применению мицеллярных и циклодекстриновых ПФ в анализе биологически активных веществ [152, 155]. Авторами работы [153] разработаны методики одновременного определения стероидов эндо- и экзогенного происхождения с использованием компонентов организованных сред (мицелл додецилсульфата натрия, (3-циклодекстрина, сульфо-р-циклодекстрина, мочевины) методами обращенно-фазовой ВЭЖХ, капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) в биологических жидкостях. Пределы обнаружения составляют 50 и 500 нг/мл без концентрирования, 3,0-5,0 и 5,0-10 нг/мл с концентрированием для методов ОФ ВЭЖХ и МЭКХ соответственно. Продолжительность разделения 30 и 10 мин, общая продолжительность анализа (с учетом пробоподготовки и кондиционирования колонки или капилляра) 80 и 90 мин для методов ОФ ВЭЖХ и МЭКХ соответственно. Определение методом ОФ ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе НРР 4001 (Чехия) с насосом высокого давления и УФ-детектором (254 нм) в режиме изократического элюирования. В качестве элюентов использовали 29%-ный раствор ацетонитрила в бидистиллированной воде с добавлением Р-ЦД и 40%-ный раствор ацетонитрила в бидистиллированной воде с добавлением додецилсульфата натрия. Использование компонентов организованных сред в составе анализируемых проб, элюента или буфера позволило увеличить селективность разделения стероидов при их одновременном хроматографическом или электрофоретическом определении.
В работе [121] представлена методика разделения стероидных гормонов в ЦД ПФ. Исследовано влияние Р-циклодекстрина, введенного в состав подвижной фазы ацетонитрил - вода в качестве комплексообразующего агента, на изменение параметров удерживания стероидных гормонов в режиме ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием (254 нм). Найдено, что максимальным является влияние концентрации циклодекстрина на изменение удерживания более гидрофобных аналитов и показано, что введение Р-ЦД в состав ПФ позволяет существенно сократить время анализа и увеличить селективность разделения компонентов сложных смесей органических соединений.
Авторами работы [154] был разработан метод прямого определения кортикостероидов в мазях и кремах с использованием МЖХ. Изучено поведение 7 кортикостероидов (будесонида, дексаметазона, гидрокортизона и др.) в ПФ, содержащих додецилсульфат натрия и модификаторы (пропанол, бутанол, пентанол) на колонке С18 (125 мм 4.6 мм). Показано, что время удерживания кортикостероидов снижается по сравнению с водно-органическими фазами, а воспроизводимость возрастает.
Авторами работы [156] методом ТСХ на пластинах Сорбфил изучено влияние природы и концентрации мицелл поверхностно-активных веществ и ионной силы раствора на хроматографическое поведение 17 аминокислот. Было установлено, что с увеличением концентрации ДДС подвижность аминокислот растет, причем увеличивается также величина ARf, т.е. улучшаются как эффективность, так и селективность разделения. Наилучшее разделение лизина и аргинина происходит при концентрации ДДС в ПФ в интервале 0,02-0,04 М. А увеличение ионной силы раствора вызывает более заметные изменения в величине R/ аминокислот в мицеллах катионного и неионного ПАВ, чем в мицеллах анионного додецилсульфата натрия, что должно быть следствием их более эффективной солюбилизации в мицеллах первых двух типов ПАВ.
Для разделения гистидина и триптофана методами ТСХ и ВТСХ [157, 158] на силикагеле, импрегнированном водными растворами додецилсульфата натрия, хлорида цитилпиридиния, бромида цетилтриметиламмония и тритона Х-100 в качестве ПФ использовали смеси борная кислота - фосфорная кислота (50:50) (рН 2,3), борная кислота - фосфорная кислота - угольная кислота (50:50:8,6 ) (рН 5,38) и борная кислота - фосфорная кислота - угольная кислота (50:50:23 ) (рН 9,04). Показано, что лучшие результаты были получены в первой ПФ. Введение органических растворителей в МПФ значительно понижает подвижность аргинина, лизина и орнитина и практически не влияет на подвижность гистидина и триптофана. Следует отметить, что четкого разделения аргинина (R/ = 0,07), лизина (Rf= 0,03) и орнитина (Rf= 0,09) не наблюдалось.
Все большее значение приобретают методы разделения и определения оптических изомеров аминокислот. При проведении биохимических исследований, в разработке и исследовании фармацевтических препаратов и продуктов питания необходимы как аналитические, так и препаративные методы разделения, поскольку D- и L-аминокислоты отличаются не только по физико-химическим, но и по биологическим свойствам. Предложено несколько вариантов метода ВЭЖХ для решения поставленной задачи, из которых наиболее распространенным является метод определения оптической чистоты немодифицированных а-аминокислот на неподвижных хиральных фазах (НХФ). В качестве селекторов в таких НХФ выступают циклодекстрины, краун-эфиры и др. [159-162]. Высокоселективным классом НХФ для прямого разделения энантиомеров а-аминокислот являются сорбенты с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками [163]. Особенностью макроциклических гликопептидных антибиотиков является большое число центров распознавания в их молекулах и, как следствие этого, сложный характер закономерностей удерживания и распознавания энантиомеров аминокислот.
Для разделения производных триптофана, эффективными оказались водные растворы а-ПД [164]. Обнаружена зависимость Rf растворённых веществ от концентрации а-ЦД как на микрокристаллической, так и на нативной целлюлозе (Gel 300). С увеличением концентрации а-ЦД подвижность всех энантиомеров триптофана увеличивается. Исключением является 4-метил-(Д)-триптофан, концентрационная зависимость Rf которого имеют максимум. Однако применять нативную целлюлозу нецелесообразно из-за малого значения ARf (0,02) между D-и L-энантиомерами. На микрокристаллической целлюлозе величина ARf варьировала от 0,07 до 0,19. В работе [165] отмечено, что введение добавок электролита увеличивает подвижность веществ, а повышение температуры увеличивает ARf.
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Введение органического растворителя и сильного электролита в водные мицеллярные ПФ оказало определенное влияние и на хроматографическое поведение аминокислот.
Зависимость подвижности аминокислот от концентрации ацетонитрила представлена на рисунке 4.13. Установлено, что при малом содержании ацетонитрила (до 5 об.%) наблюдается незначительное повышение подвижности сорбатов, которое носит монотонный характер. Дальнейшее увеличение концентрации растворителя 15 об.% не изменяет значения R/ веществ и не улучшает формы зон аминокислот, что видно из рисунка 4.14.
Результаты влияния ионной силы раствора представлены на рисунках 4.14, 4.15. Установлено, что в МПФ, содержащих ДДС с концентрацией 6,0-10 2 М, с увеличением ионной силы подвижность всех аминокислот монотонно возрастает. Однако этот рост не превышает 0,1 значения R/ соединений. Вероятно, увеличение подвижности сорбатов происходит за счет усиления их солюбилизации в мицеллы ДДС вследствие сорбции электролита на НФ и усиления десорбции аминокислот с поверхности сорбента.
Основным положительным результатом введения электролита в мицеллярные ПФ является существенное улучшение формы зон сорбируемых веществ, представленное на рисунке 4.14, б. Этот вывод подтвержден расчетом параметров эффективности и селективности разделения (таблица 4.10).
Из данных, представленных в таблице 4.10, видно, что в МПФ, модифицированной сильным электролитом, эффективность и селективность разделения значительно улучшаются. Так, при и. = 0,10-0,15 N для всех аминокислот увеличивается почти в 5 раз, достигая своих максимальных значений; значения Н соответственно уменьшаются в 5 раз. Увеличивается также и селективность разделения примерно в 2 раза. Дальнейшее повышение ионной силы (п. = 0,20) в ПФ несколько снижает эффективность и селективность разделения. Установлено, что наибольшая компактность и разрешенность зон наблюдаются для ПФ: ДДС (6,0-10"2 М) - КС1 (ц = 0,15).
Как и для водно-органических ПФ (глава 3, параграф 3.2), выбранные оптимальные системы в ТСХ были подтверждены результатами исследований некоторых гормонов и флавоноидов методом ОФ ВЭЖХ, представленными на рисунках 4.16 - 4.20.
Данные рисунков 4.16 1.20, полученные методом ВЭЖХ, подтвердили позитивное влияние ПАВ на определение и разделение исследуемых БАВ. Установлено, что в отличие от водно-органических ПФ в мицеллярных ПФ хроматографические пики БАВ, в частности гормонов и флавоноидов, стали более узкими и симметричными. Так, фактор асимметрии (Fass) прогестерона в водно-ацетонитрильной ПФ имел значение равное 3,68, в мицеллярной ПФ - 1,04; в водно - 2-пропанольном элюенте для кверцетина - 0,51, для рутина - 0,62, а в модифицированной мицеллярной ПФ Ftm = 0,78 и Fass = 0,95 соответственно для первого и второго веществ. Установлено, что в МПФ параметры удерживания исследуемых веществ также изменились. Время удерживания прогестерона (?й=8,36 мин) увеличивалось по сравнению с ПФ, содержащей ацетонитрил, в два раза (tR = 4,19 мин); кверцетин, как более гидрофобное вещество, сильнее удерживался неполярным сорбентом и хроматографировался с tR = 9,97 мин, рутин менее гидрофобен, поэтому его значение tR меньше и составляло 4,77 мин (рисунки 3.15, 3.16), а в водно-пропанольной-2 ПФ - 9,55 и 4,45 мин, соответственно, что согласуется с закономерностями ОФ ВЭЖХ и мицеллярной хроматографии [182]. Найдено, что с повышением концентрации ДДС в ПФ время удерживания флавоноидов увеличивается и достигает своего максимума при концентрации ДДС 2,5-10"2 М (рисунок 4.19). Дальнейшее повышение концентрации ПАВ уменьшает значение tR веществ и увеличивает размывание хроматографических пиков.
Таким образом, лучшей модифицированной МПФ в ВЭЖХ для разделения и определения стероидных гормонов является ПФ ДДС (2,5-10"2 М) - ацетонитрил (70:30), для флавоноидов пропанол-2 - ДДС (2,0-10"2 М) в уротропиновом буферном растворе (рН = 6,5) (30:70).
Параметры эффективности и селективности разделения кверцетина и рутина представлены в таблице 4.11. Данные таблицы 4.11 показывают, что, как и в ТСХ, в ВЭЖХ с увеличением содержания ДДС в ПФ до 2,0-10"2 М эффективность разделения флавоноидов повышается почти в 2,5 раза, селективность изменяется незначительно.
Для описания равновесных процессов, протекающих на поверхности сорбента и в растворе в мицеллярной тонкослойной хроматографии, мы воспользовались моделью, предложенной Армстронгом и Ноумом [148] (глава 2). Согласно представлениям Армстронга, в МТСХ, как и в ТСХ с применением циклодекстриновых ПФ, сорбат распределяется не только между неподвижной и подвижной фазами, но и дополнительно внутри самой подвижной фазы - между водой и мицеллами ПАВ (рисунок 4.21). Существование второго равновесия отличает МЖХ от жидкостной хроматографии с водно-органическими элюентами. В соответствии с этими представлениями хроматографическое поведение сорбата в мицеллярной подвижной фазе определяется тремя коэффициентами распределения, представленными в уравнениях (12-21).
На рисунках 1-8 (приложение) приведены зависимости подвижности исследуемых веществ от концентрации ПАВ в водных и модифицированных мицеллярных подвижных фазах (таблицы 1, 2, приложение). На основании полученных данных и по формулам (12-23) главы 2 были рассчитаны величины коэффициентов распределения KMW, KSW& МПФ (таблицы 4.12, 4.13).
Анализ таблиц 4.12 и 4.13 показывает, что в водных и модифицированных мицеллярных ПФ процесс переноса сорбатов в мицеллы ПАВ в ПФ преобладает над процессом их сорбции на НФ. Величины коэффициентов распределения зависят от природы НФ, гидрофобности сорбатов и наличия модификаторов в ПФ (органического растворителя и сильного электролита).
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Как видно из рисунка 5.7, повышение концентрации ацетонитрила в водной (3-ЦД подвижной фазе до 10 об.% значительно понижает подвижность дексаметазона и преднизолона. Такое поведение БАВ может быть объяснено конкурирующим включением молекул органического растворителя в полость ЦД и вытеснением стероидного гормона из полости ЦД, что препятствует образованию комплекса «гость - хозяин» с молекулой сорбата [149, 150]. Установлено, что величина R/ гидрокортизона незначительно повышается при введении ацетонитрила в (3-ЦД ПФ, а хроматографическая зона прогестерона остается на стартовой линии. Напротив, добавление органического растворителя в циклодекстриновую ПФ способствует разделению дексаметазона на 4 зоны, однако хроматографическая картина при этом становится более размытой (рисунок 5.8). 1 2 3
При введении в водно-циклодекстриновую ПФ растворителя (до 10 об. %) независимо от его природы сначала наблюдается уменьшение подвижности зоны рутина практически до 0,1, а затем ее постепенное увеличение до содержания органического растворителя в ПФ 40-50 об.% (рисунок 5.9, а). Из рисунка 5.9, б видно, что подвижность кверцетина растет более существенно, чем рутина. Во втором случае она увеличивается при содержании органического растворителя в ПФ от 10 об.% (рисунок 5.9, б).
Согласно рисунку 5.9, природа растворителя мало влияет на установленные закономерности, поскольку подвижность хроматографических зон исследуемых флавоноидов увеличивается по мере насыщения ПФ как протонными, так и апротонными растворителями.
Установлено, что наиболее перспективной является циклодекстриновая ПФ на основе бутанола-1, так как в данной ПФ наблюдается незначительное движение хроматографической зоны кверцетина: в других ПФ он оставался на старте. Поэтому эту ПФ далее модифицировали введением уксусной кислоты, способствующей нахождению флавоноидов в молекулярной форме. Установлено, что добавление уксусной кислоты дополнительно увеличило подвижность и компактность хроматографических зон кверцетина и рутина, а также AR/ между ними, что может быть использовано в практических целях.
Параметры эффективности и селективности, рассчитанные для оптимальных систем, представлены в таблице 5.3, из которой видно, что в циклодекстриновых ПФ значения N и Н для кверцетина несколько ухудшаются, а для рутина, наоборот, улучшаются.
Установлено также, что использование циклодекстриновых ПФ вместо органических растворителей приводит к изменению порядка элюирования сорбатов на слабополярной НФ (Полиамид-6) (таблица 5.3). Наблюдаемое явление может быть связано с адсорбцией циклодекстрина на НФ и изменением её свойств за счет модификации поверхности сорбента [30].
Изменение подвижности аминокислот в широком интервале концентраций органического растворителя показано на рисунках 5.10, 5.11 из которых видно, что с появлением органического растворителя (рисунок 5.11) и увеличением его содержания в 2-ГП-[3-ЦД ПФ величина R/ аминокислот на полярной НФ уменьшается во всем интервале концентраций органической составляющей. Это связано с конкурирующим включением молекул растворителя в полость циклодекстрина, препятствующим образованию комплекса «гость-хозяин» между молекулами циклодекстрина и сорбата, а также образованием водородных связей функциональных групп аминокислот с НФ.
Система циклодекстрин - сильный электролит Установлено, что увеличение ионной силы, так же как и введение органического растворителя, в ПФ при постоянной концентрации ЦД уменьшает подвижность всех сорбатов (рисунки 5.13, 5.15).
Так, в циклодекстриновых ПФ подвижность дексаметазона уменьшается почти в 1,5 раза, преднизолона - примерно в 2 раза (рисунок 5.13). Возможно, как и в случае с органическим растворителем, это происходит из-за протекания конкурирующей реакции комплексообразования между ЦД и ионами электролита, концентрация ионов которого на несколько порядков больше концентрации сорбатов [148].
Параметры эффективности и селективности для исследуемых стероидов приведены в таблице 5.4. Данные, приведенные в таблице 5.4, показывают, что лучшими характеристиками по сравнению с водно-органической ПФ обладает система 3-ЦД - КС1 (95:5), использование которой приводит к улучшению формы зон сорбируемых веществ, увеличению числа теоретических тарелок и соответствующему уменьшению высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ).
Аналогичными закономерностями характеризуются и аминокислоты. При повышении ионной силы раствора до 1,0 подвижность аминокислот практически не меняется. При \i 0,01 происходит незначительное уменьшение значений подвижности триптофана, лейцина и тирозина (рисунок 5.15).
Следует отметить, что основным положительным результатом введения электролита в циклодекстриновые ПФ, как и растворителя, является существенное улучшение формы зон сорбируемых веществ (рисунок 5.16).
В отличие от классического варианта ТСХ, селективность разделения веществ с использованием ПФ на основе ЦД, так же как и в мицеллярной ТСХ, 127 зависит от специфики их распределения между неподвижной фазой (НФ) и водой (Ksw), НФ и молекулами ЦД (KSCD), а также распределения внутри самой ПФ (KCDW), т.е. в системе вода - ЦД (рисунок 5.17). Количественная оценка распределения в указанных системах позволяет выявить процесс, оказывающий основное влияние на подвижность сорбата в условиях ТСХ с циклодекстриновыми подвижными фазами.
