Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА В обзор литературных данных 13
Разделение белков із лектрофрретическими методами 13
Капиллярная электрохроматография на полых колонках (ОТ-КЭХ)Л 3
Динамическое модифицирование 14
Физическая сорбция модификаторов на поверхности кварцевого капилляра 19
Иммобилизация модификаторов на поверхности кварг\евого капилляра 31
1.1.2 Капиллярная электрохроматография на монолитных колонках 34
1.2 Применение дендримеров исверхразветвленных полимеров в хроматографии и электрофорезе 46
1.2.1 Дендримеры в газовой хроматографии 50
1.2.2 Использование дендримеров в мицеллярной электрокинетической хроматографии 51
1.2.3. Дендримеры в капиллярной электрохроматографии 55
1.2.4 Применение дендримеров для твердофазной микроэкстракции. 57
Использование дендримеров для хирального разделения в режиме ВЭЖХ 57
1.3 Модификаторы в тонкослойной хроматографии (ТСХ) 59
1.3.1. Химическая модификация стационарных фаз 60
1.3.2 Физическая модификация стационарных фаз 62
1.3.3 Динамическая модификация неподвижных фаз 68
ГЛАВА 2. Общая характеристика объектов и методов исследования 76
2.1 Аппаратура 76
2.2 Реагенты 77
2.2.1 Приготовление стандартных растворов определяемых веществ 78
2.3 Синтез и характеристики сверхразветвленных мальтозилированных полиэтилениминов (PEI-Mal). 79
2.4 Приготовление рабочих.растворов 81
2.5 Синтез монолитной.капиллярной колонки
2.5.1 Травление кварцевого капилляра 83
2.5.2 Силанизация кварцевого капилляра 83
2.5.3 Синтез полиметакрилата in situ 84
2.5.4 Постфункционализация монолитной колонки 84
2.5.5 Получение «окна» детектирования 85
2.5.6 Оценка пористости монолитного сорбента 85
2.5.7 Оценка воспроизводимости процедуры синтеза монолитных капиллярных колонок 87
2.6 Синтез полых колонок на основе полимеров PEI-Mal 88
2.6.1 Травление и силанизация кварцевого капилляра 88
2.6.2 Функционализация капилляра полимером PEI-Mal 88
2.7 Разделение белков в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ) на монолитных колонках 89
2.7.1 Определение скорости электроосмотического потока (ЭОП) 89
2.7.2 Электрохроматографическое разделение смеси миоглобина, лизозима, инсулина и альбумина 90
2.7.3 Определение эффективности в капиллярном зонном электрофорезе (КЗЭ) и капиллярной элсктрохроматографии (КЭХ) 90
2.8 Разделение белков в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ) на полых колонках 90
2.8.1 Концентрирование смеси белков при использовании стэкинга с большим объемом вводимой пробы {large volume sample stacking, LVSS) 91
2.9 Разделение белков в условиях дендримерной электрокинетической хроматографии 91
2.10 Разделение водорастворимых витаминов в режиме ВЭТСХ 92
2.10.1 Разделение водорастворимых витаминов введением в подвижную фазу полимера PEI-Mal 93
2.10.2 Разделение водорастворимых витаминов с использованием модифицированных пластин 94
2.11 Разделение жирорастворимых витаминов в условиях ВЭТСХ на модифицированных PEI-Mal пластинах 95
ГЛАВА 3. Использование монолитных колонок для разделения смесей белков в режиме капиллярной электрохроматографии 96
3.1 Синтез монолитных колонок наоснове метилметакрилата 97
3.2 Разделение смеси белков на монолитных колонках в режиме КЭХ 105
ГЛАВА 4. Использование водорастворимых сверхразветвленных полимеров для разделения смесей белков в условиях дендримерной электрокинетической хроматографии и капиллярной электрохроматографии ПО
4.1 Динамическая модификация кварцевых капилляров полимерамиPEI-Mal...11 1
4.2 Капиллярная электрохроматография с использованием полых колонок на основе полимеров PEI-Mal 120
ГЛАВА 5. Использование полимеров PEI-MAL для разделения витаминов в условиях высокоэффективной тонкослойной хроматографии 126
5.1 Импрегнированис ТСХ- пластин различными модификаторами 131
5.1.1 Влияние модификаторов на факторы удерживания и эффективность водорастворимых витаминов 132
5.1.2 Влияние полимера PEI-Mal на факторы удерживания и эффективность жирорастворимых витаминов 135
5.2 Влияние полимера PEI-Mal в составе подвижной фазы на факторы удерживания и эффективность водорастворимых витаминов 137
Список литературы
- Физическая сорбция модификаторов на поверхности кварцевого капилляра
- Использование дендримеров для хирального разделения в режиме ВЭЖХ
- Постфункционализация монолитной колонки
- Капиллярная электрохроматография с использованием полых колонок на основе полимеров PEI-Mal
Введение к работе
Актуальность. В последние годы отмечается повышенный интерес к полимерным материалам в связи с использованием их в хроматографических и электрофоретических методах разделения. К ним, в первую очередь, относятся полимеры для создания монолитных сорбентов - нового поколения стационарных фаз, а также дендримеры и сверхразветвленные полимеры.
Интерес к последним обусловлен их уникальными физико-химическими характеристиками: термическая стабильность, не зависящая от внешней среды мицеллоподобная структура, способность к образованию комплексов включения, высокая плотность терминальных функциональных групп и легкость их модификации, регулирующая растворимость и полярность. Применение дендритных полимеров в хроматографии и капиллярном электрофорезе позволяет существенно расширить аналитические возможности этих методов разделения.
Данная работа посвящена выявлению возможностей использования новых полимеров типа ядро -обол очка, состоящих из функционализированного дендритного ядра, окруженного оболочкой привитых низкомолекулярных соединений - водорастворимых производных полиэтиленимина, модифицированных мальтозой (РЕІ-Mal), в качестве компонентов хроматографических (высокоэффективная тонкослойная хроматография, ВЭТСХ) и электрофоретических (ЭКХ, КЭХ) систем на примерах разделения низко- и высокомолекулярных аналитов гидрофильной и гидрофобной природы (водо- и жирорастворимых витаминов, белков) и сопоставлению полученных результатов с использованием монолитных полимерных сорбентов в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ).
Потенциал, заложенный в таких полимерах уже обеспечил им использование в медицине в системах целевой доставки лекарств и химическом синтезе в качестве нанокатализаторов, однако до настоящего времени работ, посвященных их применению в хроматографии и электрофорезе нет.
Выявление способности этих полимеров, введенных в состав хроматографических и электрофоретических систем, влиять на миграционные характеристики аналитов, выступать в качестве модификатора стенок кварцевого капилляра и способствовать on-line концентрированию определяемых соединений позволит не только контролировать эффективность и селективность разделения компонентов сложных смесей, но и получить независимую информацию об этих новых материалах.
Работа поддержана грантами РФФИ 10-03-00902-а и РФФИ ННИО 11-03-91331_а.
Цель работы: Выявление влияния мальтозилированных сверхразветвленных полиэтилениминов в качестве компонентов и модификаторов хроматографических и электрофоретических систем при определении биологически активных соединений.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
Синтез монолитных колонок для разделения смесей белков в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ).
Выявление закономерностей влияния степени модификации и размера ядра дендритных полимеров типа ядро-оболочка в составе рабочего буфера на величину электроосмотического потока, эффективность и селективность разделения белков в режиме электрокинетической хроматографии, а также на процессы on-line концентрирования.
Подготовка полых колонок на основе полимеров PEI-Mal химическим и динамическим модифицированием поверхности кварцевого капилляра и выявление возможностей их использования для разделения и концентрирование модельных смесей белков в условиях капиллярной электрохроматографии.
Установление закономерностей влияния сверхразветвленных полимеров PEI-Mal, отличающихся массой ядра и содержанием терминальных мальтозных групп, в качестве модификаторов хроматографических фаз при различных значениях рН элюента на хроматографические характеристики гидрофильных и гидрофобных аналитов (водо- и жирорастворимых витаминов) в условиях ВЭТСХ и получение сравнительных оценочных характеристик при использовании других модификаторов - Р-циклодекстрина и катионного детергента цетилтриметиламмоний бромида.
Научная новизна
Предложен вариант КЭХ, обеспеченный за счет динамического и ковалентного модифицирования поверхности кварцевого капилляра положительно заряженным мальтозилированным сверхразветвленным полиэтиленимином. Реализован вариант ЭКХ за счет введения в буферный электролит отрицательно заряженного или нейтрального полимера.
Выявлена зависимость хроматографических и электрофоретических характеристик (эффективности и селективность) изученных систем и характеристик аналитов (времена миграции и факторы удерживания) от размера ядра и степени модификации полимеров типа ядро-оболочка на примерах высокомолекулярных соединений - белков, и низкомолекулярных - водо- и жирорастворимых витаминов в методах ЭКХ, КЭХ и ВЭТСХ. Установлено, что при наличии ионных взаимодействий между полимером и
молекулами аналитов происходит существенное увеличение времен миграции в КЭХ и уменьшение величин Rf аналитов в ВЭТСХ. При отсутствии этих взаимодействий (полимер и белок слабозаряжены или нейтральны) происходит резкое увеличение эффективности в ЭКХ.
Установлено, что лучшая селективность разделения белков реализуется при использовании монолитных колонок в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ), а максимальная эффективность - на капиллярных колонках, модифицированных дендритными полимерами, в режиме электрокинетической хроматографии (ЭКХ).
Предложена схема изготовления полых колонок на основе ковалентно привитого сверхразветвленного полимера, примененная для on-line концентрирования (стэкинг с большим объемом вводимой пробы) и уменьшения пределов обнаружения белков (до 70 раз по сравнению с КЗЭ в тех же условиях). Обоснована целесообразность использования исследованных сверхразветвленных полимеров в качестве модификаторов подвижной и неподвижной фаз в ВЭТСХ. Показано, что наличие водородных взаимодействий между исследованными аналитами (водорастворимыми витаминами) и PEI-Mal обеспечивает рост эффективности, в то время как ионные взаимодействия и образование комплексов гость-хозяин наоборот, приводит к уменьшению значений эффективности и параметров Rf аналитов.
Практическая значимость работы
Осуществлен синтез монолитных колонок на основе глицидилметакрилата, метилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (инициатор - азобисизобутиронитрил) с использованием в качестве порогенного растворителя системы пропанол-1 : формамид (10 : 50, соответственно) с последующей постфункционализацией бутилэтиламином для анализа белков.
Предложен вариант on-line концентрирования белков (с пределом обнаружения суммарной концентрации белков 0,12 мг/мл) на колонках, динамически модифицированных дендритным полимером.
Достигнуто снижение пределов обнаружения белков в 70 раз (до 0,008, 0,013, 0,005, 0,004 мг/мл для альбумина, миоглобина, лизоцима и инсулина соответственно) при использовании полых колонок на основе химически привитого полимера PEI-Mal и сохранении разрешения всех компонентов в условиях КЭХ по сравнению с КЗЭ на не модифицированных капиллярах в тех же условиях.
Использование импрегнированных сверхразветвленным полимером пластин для ВЭТСХ обеспечило увеличение эффективности при определении витамина В2 в 100 раз иВ12в 10 раз.
Методом ВЭТСХ с использованием пластин, модифицированных полимером PEI-Mal установлено, что в условиях ВЭТСХ исследованные полимеры взаимодействуют с водорастворимым витамином В2 и жирорастворимым витамином А, что вызывает резкое снижение параметров Rf на импрегнированных пластинах для этих аналитов. Установлено, что взаимодействие в системе PEI-Mal - рибофлавин зависит от молекулярной массы полиэтиленимина и степени его замещения мальтозой и объясняется образованием комплекса типа «гость-хозяин».
Положения, выносимые на защиту
1. Хроматографические характеристики сверхразветвленных полимеров,
модифицированных мальтозой, в электрокинетической хроматографии (ЭКХ) и
капиллярной электрохроматографии на полых колонках (КЭХ). Влияние молекулярной
массы ядра и степени замещения на величину электроосмотического потока и
миграционные характеристики альбумина, миоглобина, инсулина, лизоцима.
2. Разделение белков на капиллярных монолитных колонках в условиях капиллярной
электрохроматографии, синтез монолитных колонок и факторы, влияющие на их
пористость.
3. Зависимость хроматографических параметров водо- и жирорастворимых
витаминов от присутствия сверхразветвленного полиэтиленимина, модифицированного
мальтозой, в составе неподвижной фазы в (ВЭТСХ), сравнительные оценочные
характеристики с Р-циклодекстрином, цетилтриметиламмоний бромидом.
4. Доказательство проявления эффекта модификации подвижной фазы в ВЭТСХ
сверхразветвленным мальтозилированным полиэтиленимином на хроматографические
характеристики витаминов группы В и витамина С.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 2 статьях и 11 тезисах докладов. Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (2008, Клязьма, Россия); III Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (2008, Санкт-Петербург, Россия); 9х European Meeting on Environmental Chemistry (2008, Girona, Spain); Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнология» (2009, Самара, Россия); VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 2009» (2009, Йошкар-Ола, Россия);
Международной конференции по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века» (2009, С.-Петербург, Россия); III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (2009, Краснодар, Россия); 10th European Meeting on Environmental Chemistry (2009, Limoges, France); Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (2010, Клязьма, Россия).
Структура и объем работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 3 глав с обсуждением полученных результатов, выводов, приложения и списка цитируемой литературы (206 наименований). Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 85 рисунков и 24 таблицы.
Физическая сорбция модификаторов на поверхности кварцевого капилляра
В [36] катионный полиэтиленамин-/со-пропиленамин, физически сорбированный на стенках капилляра, использовали для разделения основных белков. Покрытие не меняло своих характеристик в диапазоне рН 4 - 8 и обеспечивало разделение смеси основных белков с эффективностью 265 — 584 тыс. т.т.
В [37] использовали сополимер на основе ДіУ-диметилакриламида и метакрилата этилпирролидина. В отличие от многих других покрытий он характеризуется рН-зависимым ЭОП, что одновременно сужает диапазон применимых условий для анализа, но при этом обеспечивает возможность исследовать смеси как основных, так и кислотных белков (рис 11). При рН 5 удалось разделить смеси основных белков с эффективностью 50 тыс. т.т., а при значении рН буферного электролита 8,5 с такой же эффективностью анализировали смеси кислотных белков. Правда, селективность разделения была хуже. о капилляр 10 Рисунок 11 — Влияние рН на величину ЭОП для модифицированного () и немодифицированных кварцевых капилляров () [37]
Сополимер винилпирролидина и диметиламиноэтилметакрилата использовали в [38] для разделения смеси основных белков. Эффективность составила 386-738 тыс. т.т./м.
Кварцевые капилляры, покрытые поливинилпирролидином, нашли применение при исследовании взаимодействий между липопротеинами и стероидами. Первые - выступали в качестве псевдостационарной фазы; о взаимодействии со стероидами судили по изменению их параметров удерживания [39].
В [40] дополнительно к полиэлектролитному слою капилляр модифицировали наночастицами золота, что обеспечило высокую эффективность за счет большей площади поверхности. Выбор золота обусловлен его стабильностью, легкостью модификации и высоким отношением площади поверхности к объему [41]. В качестве полиэлектролитов использовались катионный поли(диаллилди метиламмоний) хлорид (ПДАДМАХ) и анионный поли(4-стиролсульфонат) натрия (ПССН), при этом было реализовано три типа покрытия (Рис. 12).
Первый тип покрытия оказался чрезвычайно стабильным. Так, разница в электрофоретических подвижностях ДМСО между первым и восьмисотым анализами составила всего лишь 0,5%, что, по предположению авторов статьи, является следствием сильных электростатических и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. Значительное ухудшение результатов уже после десятого анализа для второго типа колонок свидетельствует о важной роли полиэлектролитного слоя в обеспечении прочности покрытия.
Тем не менее, эффективность при разделении лизоцима и альбумина (основные белки) оказалась крайне мала, что связано с их сорбцией в процессе разделения. Таким образом, несмотря на высокую стабильность данного покрытия, плотность наночастиц все-таки недостаточна высока, чтобы воспрепятствовать сорбции белков.
В [42] трехслойное покрытие, состоящее из полибрена (бромид гексадиметрина), сульфата декстрина и снова - полибрена, опробовано на его способности к разделению смеси основных белков. Установлено, что с увеличением количества слоев стабильность покрытия возрастает: капилляр с монослоем полибрена обеспечивает стабильный ЭОП на период не более 10 анализов, в то время как использование би- и трехслойного покрытия позволяет провести до 30 соответствующих экспериментов (Рис. 13). В случае трехслойного покрытия смесь основных белков была разделена с эффективностью 125-200 тыс. т.т.
Двухслойное покрытие на основе хлорида поли(диаллилдиметиламония) и сульфодекстрина было использовано для разделения четырнадцати рекомбинантных продуктов аллергена Betula verrucosa [43] с эффективностью 150-650 тыс. т.т. В [44] проведен сравнительный анализ применения покрытия на основе полиэтиленоксида, полиакриламида и полибрена для разделения изоформ фосфорированных и нефосфорированных шоу-белков (белков, преимущественно находящихся в нейронах центральной нервной системы). Выяснилось, что удовлетворительные результаты могут быть получены на любом из покрытий, однако в случае полибрена наблюдалась 5-ти и 35-тикратный рост эффективности по сравнению с полиэтиленоксидом и полиакриламидом.
В [45,46] серия сверхразветвленных поли(3-метил-3 гидроксиметилокиэтанов) с разной степенью ветвления была использована при модификации кварцевого капилляра и последующем разделением смеси лизоцима, цитохрома С и рибонуклеазы А (Рис. 14). Эффективность составила 1100«тыс т.т., что достигается за счет разветвленной структуры полимера и большого количества гидроксильных групп, обеспечивающих многочисленные водородные связи как с силанольными группами на поверхности капилляра, так и с разделяемыми белками. Интересно, что с ростом степени ветвления увеличивается эффективность и времена удерживания аналитов.
В [47] использование покрытия на основе винилпиридина привело к обращению ЭОП при рН 6.6; его величина сильно зависела от кислотности среды, поскольку сам пиридин является слабым основанием. Эффективность в кислой среде составила до 340 тыс. т.т./м, однако резко снижалась уже при рН 8,8, что объясняют потерей заряда пиридиновым кольцом и возрастающими взаимодействиями белков с силанольными гидроксильными группами. Оказалось, что стабильность покрытия уменьшается с ростом рН среды, что также можно связать с уменьшением как заряда полимера, так и силы ионных взаимодействий со стенками капилляра.
Использование дендримеров для хирального разделения в режиме ВЭЖХ
В одной из недавних работ было предложено использовать в качестве стационарной фазы для сверхкритической флюидной хроматографии (СФХ) классический полиариловый дендример Фретчета [117]. Показано, что при сравнимой эффективности для разветвленных и линейных полимерных фаз первые характеризуются меньшим удерживанием компонентов в силу перехода от абсорбционного к адсорбционному механизму [118].
В [119] силикагелевые частицы с дендримерным покрытием использованы в качестве фазы для эксклюзионной хроматографии. Установлена корреляция между размером привитого полимера и границами исключения молекулярных масс: чем больше масса дендримера, тем больший объем он занимает в порах силикагеля, и тем меньшие частицы могут быть удержаны.
Таким образом, в силу уникальности строения и легкости получения требуемых производных дендритные полимеры можно считать перспективными модификаторами подвижной и неподвижной фаз в хроматографии и электрофорезе.
Модификаторы в тонкослойной хроматографии (ТСХ) Простота нанесения сорбента на пластину и проведения самого анализа в ТСХ, а также существование большого количества разнообразных стационарных фаз обусловливает распространенность данного метода на практически все классы органических соединений .
Наиболее популярными, являются пластины на основе силикагеля, оксида алюминия, целлюлозы [120]. Химической модификации, в основном, подвергаются пластины на основе силикагеля [120-122].
За счет физической сорбции достигается импрегнирование требуемыми органическими или неорганическими агентами. При этом возможно либо предварительное импрегнирование неподвижной фазы погружением пластины в раствор модификатора или опрыскиванием спреем, либо образование жидкой неподвижной фазы в процессе самого анализа {динамическое модифицирование). В последнем случае зачастую наблюдается разделение в градиентном режиме за счет неравномерного распределения модификатора по всей площади пластины [120].
В [123] было проведено разделение 21 аминокислоты с применением ТСХ-пластин на основе силикагеля и целлюлозы, а также в условиях ионообменной ТСХ (неподвижная фаза Polygram Ionex-25 SA-Na) в присутствии цитратного буфера (рН 3.3). Для разделения и идентификации цитохрома С, миоглобина и других диагностически важных белков в [124] использовались пластины на основе силикагеля и целлюлозы ProteoChrom с последующим масс-спектрометрическим детектированием. К ограничениям предлагаемого варианта, можно отнести высокую длительность анализа: время миграции компонентов составило 45-60 мин.
В [125,126] использовали полиамидный сорбент в сочетании с элюирующей системой хлороформ : метанол (в соотношении 2:3, объемн.) для разделениия смеси катехинов и тиафлавинов с последующим детектированием, с использованием хлорида железа (III) и этанола.
В условиях обращенно-фазовой хроматографии на пластинах с сорбентом С18 проведен анализ жирорастворимых витаминов, а в [127] оптимизировалиіусловия определениявитамина К.. Исследование пигментов, преимущественно- фенольных производных, в различных сортах красных вин и полифенолов в составе фармацевтических препаратов в условиях ОФ ТСХ на сорбенте С18 с подвижной фазой ацетонитрил : вода : уксусная кислота (40:58:2; объмн.) обсуждается в [128]. Разделение полифенолов проведено также и на сорбенте, содержащем С18 и аминогруппы [129].
Для решения конкретных задач, а также для достижения большей эффективности и селективности разделения требуется либо разработка новых типов сорбентов, либо модифицирование уже существующих.
Так, нанокомпозит на основе хитозана и силикагеля в качестве неподвижной фазы (НФ) был использован для разделения растительного алкалоида цитизина и его производных [130].
Ковалентно привитые стационарные фазы широко используются для разделения различных групп органических соединений и характеризуются высокой стабильностью.
Новый подход к проблеме выбора сорбента продемонстрирован в [131], где предложено использовать сродство ДНК к ряду соединений для разделения энантиомеров аминокислот и биологически активных полифенольных и гетероциклических соединений. Сорбент получен сополимеризацией поливинилового спирта, 1,5-пентадиаля и ДНК с последующей прививкой к силикагелевым частицам (Рис. 36).
Однако вызывает сомнение возможность получения воспроизводимых результатов при использовании подобного сорбента, т.к. подготовка фазы и разделение проводятся при комнатной температуре. Возникает вопрос: сколь стабильна вторичная и третичная структура в таких условиях, и как это влияет на воспроизводимость результатов? Не меняется ли структура ДНК при взаимодействии с поверхностью силикагеля, и как спрогнозировать эти изменения?
При оптимизации условий анализа, варьировании селективности разделения и эффективности чаще применяется импрегнирование стационарной фазы с использованием конкретного модифицирующего агента[120,132].
Следует ввести понятие коэффициента импрегнирования і, рассчитываемого по формуле (2) і = (b-a)/a. (2) где а - масса немодифицированной пластины, г, Ъ - масса модифицированной пластины, г. Использование ионов металлов для модификации пластин В [133,134] разделение смеси парабенов (эфиров п-гидроксибензойной кислоты) и ряда консервантов {бензоат натрия, сорбиноеая и салициловая кислота) осуществляли на силикагелевом сорбенте, модифицированным оловом (IV). В качестве подвижной фазы использовалась смесь н-гексан : бутан-2-он : уксусная кислота (8:2:0,3; объемн). Предел детектирования составил 0,5 мг, а время анализа — 30 мин.
Использование модифицированных раствором нитрата серебра пластин позволило улучшить разделение цис- и транс- изомеров жирных кислот по сравнению с газожидкостной хроматографией на длинных колонках с полярной неподвижной фазой [135].
Модификация силикагеля раствором сульфата меди обеспечила разделение изомеров никотиновой кислоты при использовании смеси н-гексан : ацетон в качестве элюента [136].
Влияние силиката висмута как модификатора неподвижной фазы на хроматографические параметры амфетамина, кофеина, эфедрина, метадона и стрихнина было изучено в [137], а в [138] исследована возможность применения сульфата кальция для разделения алифатических биогенных полиаминов (орнитина, цитруллина, путресцина, кадаверина, спермидина и спермина) - маркеров различных заболеваний (табл. 1).
Постфункционализация монолитной колонки
Для модификации неподвижной фазы в условиях ВЭТСХ ТСХ-пластины горизонтально погружались в 15 мл водного раствора с добавкой ДДСН, Р-циклодекстрина или PEI-Mal (0,25, 0,5, 1, 2,5, 5 мг/мл), выдерживались в течение 5 мин, и высушивались в темноте в течение четырех суток.
Первоначально использованный гравиметрический метод определения массы модификатора на пластине оказался неточным, так как в процессе модификации пластин часть силикагеля смывалась с их поверхности, что приводило к заниженным результатам.
Поэтому был использован спектрофотометрический метод, основанный на измерении абсорбции раствора полимера (А, = 499 нм), модифицированного флуоресцеином, до и после модификации пластины.
К традиционным методам анализа пептидов- и белков- относятся: иммунные- (илшунно-ферментные и радио-ферментные); ВЭЖХ- и капиллярный электрофорез. Одно из направлений развития современного электрофореза — использование для разделения смесей белков в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ).
Метод КЭХ сочетает достоинства капиллярного электрофореза {высокая эффективность) и ВЭЖХ (высокая селективность). Это позволяет считать КЭХ не только в ряде случаев альтернативой ВЭЖХ, но и одним из наиболее перспективных методов для анализа смесей биополимеров.
Роль сорбента в КЭХ заключается в формировании электроосмотического потока, хроматографическом разделении компонентов пробы и обеспечении проницаемости для подвижной фазы.
При разделении пептидов и белков в режиме КЭХ обычно-используют колонки трех типов: полые, насадочные и монолитные.
Вследствие небольшой площади поверхности сорбента главными недостатками полых колонок являются малый коэффициент распределения, недостаточная обменная емкость [165], и как следствие — низкая селективность. Серьезным ограничением насадочных колонок является адсорбция на поверхности сорбента основных аналитов [166].
Монолитные капиллярные колонки лишены этих недостатков, способствуя ускорению массообмена, что принципиально при анализе биополимеров. Монолитные сорбенты представляют собой непрерывные однородные пористые материалы, полученные полимеризацией in situ непосредственно в колонке и, если необходимо, функционализированные для достижения требуемых хроматографических свойств. [167]
К важнейшим характеристикам монолитных колонок относятся пористость, проницаемость и тип покрытия. В нашей стране публикаций по синтезу и исследованию монолитов в капиллярной электрохроматографии крайне немногочисленны [168], хотя за рубежом данное направление развивается очень интенсивно [169-171].
Получение монолитной капиллярной колонки осуществлялось, в несколько этапов: - травление внутренней поверхности кварцевого капилляра; - силанизация поверхности капилляра; - полимеризация в присутствии порогенных растворителей; - функционализация полимерной поверхности. Первая стадия аналогична процессу подготовки капилляра к работе в режиме КЭ. Ее цель — обеспечить максимальное количество гидроксильных групп на кварцевой поверхности, поскольку в неподготовленном капилляре большинство силанольных групп существует в связанной форме.
Реакция силанизации необходима для увеличения смачиваемости поверхности капилляра раствором мономера с последующей иммобилизацией к ней полимерного сорбента. Это позволяет избежать свободного пространства между стенками капилляра и монолитом, что может быть причиной низкой эффективности. В [172] отмечается, что силанизация позволяет добиться большей однородности и механической прочности колонки.
Для предотвращения в ходе силанизации термической полимеризации привитых метакрилатных групп использовали в качестве ингибитора 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил, как рекомендовано в [172].
Недостаточная силанизация поверхности приводит к радиальной неоднородности монолита, что видно из фотографии среза монолитной колонки, полученной на лазерном сканирующем микроскопе (Рис. 53). Рисунок 53 — Фотография метакрилатного монолитного сорбента. Силанизация при 120 С в течение 6 ч. Фотографии получены на лазерном микроскопе Leica TCS SL. Реакция полимеризации (Рис. 54) проводилась в присутствии смеси порогенных растворителей (табл. 8). Варьируя их соотношение, можно изменять пористость колонки и оптимизировать ее проницаемость. Считается, что использование смеси двух растворителей позволяет синтезировать монолит с бимодальным распределением пор: макро- и микропорами [70].
Схема процесса полимеризации Пористость обеспечивает высокую эффективность и проницаемость колонки, для чего необходимо наличие микропор диаметром до 50 нм, и макропор — диаметром от 50 до 500 нм [173].
Наиболее распространенным критерием выбора растворителей для высокомолекулярных- соединений является полярность растворителя. Согласно литературным данным, ее оценивают по величине диэлектрической проницаемости или по значению дипольного момента [174].
Для изучения влияния порогенов на макро- и микропористость исследованы нами пять систем растворителей (табл.8):
Варьировалось соотношение между компонентами порогенной системы, при этом их суммарное содержание оставалось постоянным и составляло 60% от общего объема смеси. Максимальная суммарная пористость наблюдалась в системе формамид/пропанол-1, которая в дальнейшем и была использована нами в реакции полимеризации (табл. 8).
Капиллярная электрохроматография с использованием полых колонок на основе полимеров PEI-Mal
При сохранении той же логики в постановке экспериментов с гидрофобными жирорастворимыми витаминами следует отметить наиболее интересный результат для пальмитата ретинола (витамина А): резкое уменьшение факторов удерживания на импрегнированных PEI-Mal пластинах, что может быть следствием комплексообразования витамина и полимера и независимо подтверждается литературными данными (Рис. 78).
Данное предположение подтверждается и в [199], где изучено образование соответствующих комплексов между амилозой и пальмитатом ретинола. Установлено, что образование комплекса происходит за счет водородных взаимодействий сложноэфирной группы пальмитата ретинола и присутствующих в сахаре гидроксильных групп.
Влияние полимера на прочие жирорастворимые витамины не выявлено (Приложение 5).
Этот пример наглядно демонстрирует, что метод ТСХ потенциально применим для быстрого качественного определения способности полимеров к образованию комплексов с аналитами гидрофильной и гидрофобной природы, что может быть использовано для скрининга систем контролируемой адресной доставки лекарств {controlled drug delivery).
Проведена серия специальных экспериментов в 10 мМ фосфатных буферных растворах при различных значениях рН: 2.0 (PEI-Mal заряжен положительно); 7.5 (PEI-Mal практически нейтрален), 11.5 (PEI-Mal заряжен отрицательно) и дистиллированной воде.
Установлено, что хроматографическое поведение витамина В1 при использовании буферных растворов практически не зависит от наличия в составе элюента полимера, что находится в хорошем соответствии и с результатами, полученными и на импрегнированных PEI-Mal пластинах. Однако в дистиллированной воде наблюдается двух-трехкратное увеличение эффективности (Приложение 6).
Таким образом, в условиях эксперимента образование комплекса между В1 и сверхразветвленным полимером возможно только в нейтральной среде (все структуры полимера слабозаряжены) за счет слабых водородных взаимодействий. В дистиллированной воде отсутствие солей способствует большей эффективности разделения витамина.
Установлено, что введение PEI-Mal в состав элюента влияет на хроматографические характеристики витамина В2 (Рис. 80). Так, добавление PEI-5k-Mal-B в концентрации 0,5 мг/мл вызвало резкий рост эффективности Рисунок 80 — Хроматограммы витамина В2 в отсутствии и в присутствии PEI-5k-Mal-B; подвижная фаза: (а) дистиллированная вода. (б) дистиллированная вода +0,5 мг/мл PEI-5k-Mal-B. И в кислой (рН 2,0), и в щелочной (рН 11,5) средах добавление PEI-Mal в состав элюента приводит к дальнейшему размыванию хроматографической зоны (Рис. 82). Однако в нейтральной среде (фосфатном буферном растворе (рН 7,4) и особенно в дистиллированной воде) эффективность возрастает ( 20 раз).
Так же, как и в случае импрегнированных пластин, описанные результаты можно объяснить с позиции образования комплекса рибофлавин-PEI-Mal, обусловленного водородными связями между гидрофильным рибозным фрагментом витамина и мальтозными остатками полимера и ионными взаимодействиями.
В буферных растворах при рН 10 витамин В2 существует в нейтральной форме (Рис. 81), поэтому между PEI-Mal и рибофлавином возможны только ионные взаимодействия. В кислой среде за счет протонирования аминогрупп полимера количество подобных межмолекулярных водородных связей возрастает, что приводит к значительно большему удерживания аналита полимером и, как следствие, снижению эффективности (Рис. 82).
Однако, гипотеза об образовании комплексов рибофлавин-PEI-Mal не объясняет поведение витамина в щелочном буферном растворе при рН 11.5, где и PEI-Mal, и рибофлавин существуют в анионной форме, и какие-либо взаимодействия между ними должны быть исключены.
