Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 13
1.1. Типы и источники примесей 13
1.2. Выделение органических примесей из фармацевтических препаратов ... 14
1.3. Определение органических примесей в фармацевтических препаратах.. 18
1.3.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография 18
1.3.2. Тонкослойная хроматография ...24
1.3.3. Газовая хроматография 27
1.3.4. Другие методы 33
1.3.4.1. Капиллярный электрофорез 33
1.3.4.2. Сверхкритическая флюидная хроматография 36
1.3.4.3. Двухколоночные системы 39
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 46
2.1. Оборудование 46
2.2. Исходные вещества и материалы 46
2.3 Методика эксперимента 49
2.3.1. Жидкостная экстракция 49
2.3.2. Сверхкритическая флюидная экстракция 51
2.3.3. Газохроматографический анализ 51
2.3.3.1. Хромато-масс-спектрометрический анализ 51
2.3.3.2. Газохроматографический анализ с использованием двухступенчатой off-line ГХ 53
ГЛАВА 3. Хромато-масс-спектрометрическое определение среднелетучих органических примесей, выделенных из таблетированных форм фармацевтических препаратов 57
3.1. Анализ экстрактов, выделенных жидкостной экстракцией из таблетированных форм диазепама, феназепам, нитразепама, клоназепама, анальгина, аспирина и димедрола 57
3.1.1. Прямой хромато-масс-спектрометрический анализ выделенных примесей57
3.1.2. Анализ с использованием двухступенчатой off-line ГХ/МС 62
3.1.2.1. Изучение закономерностей выделения и концентрирования примесей при использовании двухступенчатой off-line ГХ на примере модельной смеси 62
3.1.2.2. Изучение возможности определения примесей, элюируемых одновременно с основным компонентом, на примере модельной смеси 68
3.1.2.3. Определение примесей в таблетированной форме диазепама и феназепама с использованием двухступенчатой off-line хромато-масс-спектрометрии 71
3.2. Хромато-масс-спектрометрический анализ экстрактов, выделенных сверхкритической флюидной экстракцией из таблетированных форм диазепама, феназепама, нитразепама, клоназепама, анальгина, аспирина и димедрола 75
3.2.1. Выбор условий термодесорбции среднелетучих соединений 75
3.2.2. Выбор условий сверхкритической флюидной экстракции примесей из таблетированной формы феназепама 77
3.2.3. Выделение примесей из таблеток фармацевтических препаратов в оптимальных условиях 84
3.3. Сравнение результатов хромато-масс-спектрометрического определения примесей с использованием различных способов их выделения из таблетированных форм 100
Заключение 105
Выводы 107
Список литературы
- Выделение органических примесей из фармацевтических препаратов
- Сверхкритическая флюидная хроматография
- Сверхкритическая флюидная экстракция
- Изучение закономерностей выделения и концентрирования примесей при использовании двухступенчатой off-line ГХ на примере модельной смеси
Введение к работе
Современная медицина немыслима без использования
высокоэффективных лекарственных средств. Лекарства должны способствовать лечению, предупреждению и профилактике заболеваний, поэтому они должны быть не только эффективными, но и безопасными. Причинами опасности приема лекарственных препаратов могут быть, во-первых, многочисленные побочные эффекты, которые в большинстве случаев сопровождают попадание в организм фармакологически активного вещества, а, во-вторых, наличие различных примесей в фармацевтическом препарате. Примеси могут оказывать очень сильный отрицательный эффект, так как могут обладать нежелательным фармакологическим и токсикологическим действием, которое может оказаться сильнее положительного эффекта от применения лекарства, и, кроме того, примеси могут мешать проявлению фармацевтических свойств лекарственного вещества. Необходимо также отметить, что состав примесей позволяет судить о производителе продукции и ее фальсификации, которая принимает все большие масштабы во всех странах мира. В связи с этим необходимо осуществлять строгий контроль качества фармацевтической продукции на предмет наличия посторонних примесей на всех стадиях производства - от сырья до готовых лекарственных форм. По современным требованиям предел регистрируемых органических примесей в фармацевтических препаратах составляет от 0,05 до 0,1 % в зависимости от препарата. Примеси с концентрацией выше этого уровня должны быть идентифицированы. Определение примесей на более низком уровне (10"3% и ниже) требуется лишь в ряде случаев, однако все более актуальным становится снижение пределов обнаружения примесей в связи с накоплением информации о пагубном влиянии примесей, присутствующих в фармацевтических препаратах даже на уровне 10~3 - 10"4 %.
Определение органических примесей в фармацевтических препаратах проводят с использованием хроматографических методов. При этом примеси в жидких препаратах определяют прямым вводом в хроматограф препарата, а для определения примесей в твердых субстанциях (технических образцах) и таблетированных формах проводят выделение основного компонента и
примесей жидкостной экстракцией. В дальнейшем анализе используют лишь малую часть конечного экстракта. Это приводит к низкой чувствительности определения примесей и, следовательно, к искажению состава пробы за счет потери части определяемых примесей. Одним из возможных путей преодоления описанных ограничений может быть применение такого метода выделения и концентрирования примесей, как сверхкритическая флюидная экстракция (СФЭ). В литературе имеется большое число работ по СФЭ из различных матриц, и лишь небольшое число из них посвящено СФЭ из фармацевтических препаратов, при этом выделение соединений из потока флюида производится в органический растворитель с последующим газохроматографическим анализом лишь малой части (0,001-0,01) полученного раствора. Как правило, работы по СФЭ из фармацевтических препаратов посвящены извлечению основного компонента. В связи с этим представляет большой интерес изучение возможности извлечения примесей из фармацевтических препаратов при помощи СФЭ без использования растворителя, в которой производится сорбционное выделение примесей из потока флюида и перенос всего концентрата, а не малой его части в хроматограф либо хромато-масс-спектрометр за счет термодесорбции. Применение такого подхода позволило бы снизить предел обнаружения на порядки и увеличить число регистрируемых примесей.
В анализе фармацевтических препаратов на содержание органических примесей (как правило, заданных) одно из ведущих мест занимает высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Предел обнаружения в стандартных фармакопейных методиках составляет 10~2-10"1 %. Сочетание ВЭЖХ с масс-спектрометрией (МС) используют в большинстве случаев для подтверждения известных примесей, присутствующих в фармацевтической продукции. Идентификация неизвестных примесей с использованием этого метода затруднена, что обусловлено возможностью потери информации о ряде компонентов смеси из-за различных ион-молекулярных реакций, связанных с примесями в элюенте, а также регистрацией только молекулярных масс компонентов смесей. Также общепринятым методом определения примесей в
7 фармацевтических препаратах является высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ). ГХ используется гораздо реже, однако этот факт является неоправданным, так как анализ Европейской Фармакопеи показал, что около 70 % фармакологически активных веществ, входящих в состав различных фармацевтических препаратов, и, следовательно, примесей, содержащихся в них, принципиально могут быть определены методом ГХ. При использовании реакционной ГХ список этих веществ может быть значительно расширен. Помимо количественного определения примесей важна возможность их обнаружения и идентификации, которая наиболее достоверно осуществляется при использовании сочетания высокоэффективной капиллярной ГХ с масс-спектрометрией (ГХ/МС).
При анализе сложных смесей, когда концентрация одного из компонентов намного превосходит концентрацию примесей, актуальным является увеличение селективности разделения, особенно в тех случаях, когда примеси элюируются одновременно с основным компонентом либо разделены с ним частично. Увеличение селективности возможно при использовании двухмерной хроматографии в варианте on-line, которая осуществляется при переводе фракции из одной колонки на другую, расположенную в соседнем термостате, что усложняет конструкцию прибора и увеличивает его стоимость. Более перспективным, по нашему мнению, является увеличение селективности разделения за счет использования двухступенчатой хроматографии в режиме off-line. Применение такого подхода к анализу фармацевтических препаратов методом хромато-масс-спектрометрии может увеличить достоверность обнаружения примесей, элюируемых из колонки после основного компонента, масс-спектры которых искажаются за счет перекрывания с пиком основного компонента. Кроме того, применение этого метода может дать возможность определения примесей, элюируемых одновременно с основным компонентом, и снижения предела обнаружения неизвестных примесей за счет их концентрирования путем многократного улавливания на выходе из первой колонки.
В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение возможности определения неизвестных среднелетучих примесей в таблетированных
8 формах фармацевтических препаратов, фармакологически активные компоненты которых относятся к различным классам химических соединений, основанного на сочетании жидкостной и сверхкритической флюидной экстракции и хромато-масс-спектрометрии; кроме того, целью нашей работы являлось изучение возможности выделения и концентрования примесей из соответствующих жидкостных экстрактов и их определения при использовании двухступенчатой off-line газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить условия хромато-масс-спектрометрического определения, необходимые для анализа органических примесей, выделенных жидкостной экстракцией из таблетированных форм ряда фармацевтических препаратов и определить состав примесей в экстрактах из диазепама, феназепама, нитразепама, клоназепама, анальгина, аспирина и димедрола.
Изучить возможность выделения и концентрирования примесей, в том числе элюируемых одновременно с основным компонентом, из органического раствора (экстракта из фармацевтического препарата) с применением двухступенчатой off-line ГХ с масс-спектрометрическим детектированием с использованием в качестве модельных соединений фармакологически активных веществ и разработать способ последующего хромато-масс-спектрометрического анализа всего полученного концентрата.
Изучить состав среднелетучих примесей, выделенных жидкостной экстракцией из таблеток изучаемых фармацевтических препаратов, и провести их последующее определение методом двухступенчатой off-line ГХ с масс-спектрометрическим детектированием. Сопоставить с составом жидкостного экстракта, определенного прямым хромато-масс-спектрометрическим анализом.
Изучить условия количественного выделения методом СФЭ без использования растворителя среднелетучих примесей из таблетированных форм исследуемых фармацевтических препаратов и изучить условия определения всего экстракта методом хромато-масс-спектрометрии.
5. Сравнить результаты хромато-масс-спектрометрического анализа экстрактов из таблетированных форм ряда фармацевтических препаратов, полученных жидкостной и сверхкритической флюидной экстракцией.
Научная новизна работы:
Изучены закономерности выделения и концентрирования примесей, в том числе элюируемых одновременно с основным компонентом, из органического раствора (экстракта из фармацевтического препарата) с применением двухступенчатой off-line ГХ с масс-спектрометрическим детектированием и с использованием в качестве модельных соединений фармакологически активных веществ (оксазепама, диазепама, феназепама, нитразепама и клоназепама). Выбраны условия, необходимые для количественного выделения и концентрирования примесей и хромато-масс-спектрометрического анализа всего концентрата.
Разработан способ определения примесей менее летучих и более летучих, чем основной компонент, а также примесей, элюируемых одновременно с ним, в жидкостных экстрактах из таблетированных форм фармацевтических препаратов методом двухступенчатой off-line ГХ с масс-спектрометрическим детектированием, позволяющий снизить предел обнаружения более, чем на порядок и увеличить число регистрируемых примесей по сравнению с общепринятым прямым хромато-масс-спектрометрическим анализом жидкостных экстрактов.
Изучены закономерности выделения и концентрирования среднелетучих примесей из таблетированных форм изученных фармацевтических препаратов, основные компоненты которых принадлежат к различным классам химических соединений, методом СФЭ без использования растворителя и выбраны оптимальные условия, необходимые как для концентрирования примесей, так и последующего хромато-масс-спектрометрического анализа всего экстракта.
Изучен состав большого числа неизвестных среднелетучих примесей в различных фармацевтических препаратах, выделенных жидкостной экстракцией и СФЭ без использования растворителя, при использовании хромато-масс-спектрометрии и двухступенчатой off-line капиллярной ГХ с
10 масс-спектрометрическим детектированием. Показано, что СФЭ без использования растворителя обеспечивает выделение большего числа примесей из изученных фармацевтических препаратов, чем традиционная жидкостная экстракция метанолом или ацетонитрилом.
Практическая значимость работы: разработан способ определения неизвестных среднелетучих органических примесей в жидкостных экстрактах из фармацевтических препаратов, в том числе элюируемых одновременно с основным компонентом, основанный на двухступенчатой off-line ГХ/МС. Разработанный способ позволяет определять значительно большее число примесей и на более низком уровне по сравнению с прямым хромато-масс-спектрометрическим определением. Предложен способ определения среднелетучих примесей в таблетированных формах фармацевтических препаратов, основанный на СФЭ без использования растворителя и хромато-масс-спектрометрическом анализе всего экстракта. Способ позволяет определять большее число примесей и на более низком уровне, чем при выделении примесей методом жидкостной экстракции с последующим хромато-масс-спектрометрическим анализом малой части экстракта. Предложенные способы позволяют увеличить достоверность контроля качества фармацевтической продукции и могут быть использованы в фармацевтической промышленности. Результаты работы нашли практическое применение на кафедре аналитической химии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
На зашиту выносятся следующие положения:
Результаты исследования закономерностей выделения и концентрирования примесей, в том числе элюируемых одновременно с основным компонентом, из органических растворов (экстрактов) фармацевтических препаратов и анализа концентрата с применением двухступенчатой off-line ГХ с масс-спектрометрическим детектированием.
Способ определения среднелетучих примесей, выделенных жидкостной экстракцией из таблетированных форм фармацевтических препаратов, основанный на концентрировании примесей и их регистрации
методом двухступенчатой off-line ГХ с масс-спектрометрическим детектированием.
Способ определения среднелетучих примесей в таблетированных формах фармацевтических препаратов, основанный на СФЭ без использования растворителя и хромато-масс-спектрометрическом анализе всего экстракта.
Результаты определения среднелетучих органических примесей в таблетированных формах диазепама, феназепама, нитразепама, клоназепама, анальгина, аспирина и димедрола с использованием разработанных способов и прямого хромато-масс-спектрометрического анализа жидкостного экстракта.
Апробация работы:
Результаты диссертационной работы были представлены на Седьмом международном симпозиуме по гибридным методам в хроматографии (Брюгге, Бельгия, 2002 г.), на Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии" (Москва, 2002 г.), на Двадцать пятом международном симпозиуме по капиллярной хроматографии (Рива дель Гарда, Италия, 2002 г.), на Двадцать четвертом международном симпозиуме по хроматографии (Лейпциг, Германия, 2002 г.), на Третьем международном симпозиуме по методам разделения и биосинтезу "100 лет хроматографии" (Москва, Россия, 2003 г.).
Публикации:
По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура и объем работы:
Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы.
Во введении обоснована актуальность темы работы, сформулированы цель, научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.
Первая глава является литературным обзором, посвященным методам выделения и определения примесей в фармацевтических препаратах.
12 Основная часть обзора посвящена рассмотрению хроматографических методов определения примесей в готовых препаратах и субстанциях, их ограничениям и недостаткам с точки зрения определения и идентификации неизвестных примесей. В обзоре также рассмотрены основные типы и источники примесей в фармацевтических препаратах.
Во второй главе описаны оборудование, исходные вещества и материалы и методика эксперимента.
В третьей главе представлены результаты исследования и их обсуждение по разработке метода выделения среднелетучих органических примесей жидкостной и сверхкритической флюидной экстракцией из таблетированных форм фармацевтических препаратов таких, как диазепам, феназепам, нитразепам, клоназепам, анальгин, аспирин и демедрол. В этой же главе представлены результаты исследования закономерностей выделения и концентрирования примесей, в том числе элюируемых одновременно с основным компонентом, с применением двухступенчатой offline ГХ. Приведены также результаты анализа жидкостных экстрактов фармацевтических препаратов методами ГХ/МС и двухступенчатой off-line ГХ с масс-спектрометрическим детектированием. В этой главе представлены результаты исселодания оптимальных условий количественного выделения методом СФЭ среднелетучих органических примесей из таблетированных форм изученных фармацевтических препаратов и условий перевода в газовый хроматограф всего объема экстракта и последующего его анализе методом ГХ/МС. Приведены также результаты ГХ/МС анализа сверхкритических флюидных экстрактов, выделенных из изученных фармацевтических препаратов. Проведено сравнение результатов хромато-масс-спектрометрического определения примесей, выделенных из исследуемых препаратов жидкостной и сверхкритической флюидной экстракцией.
Диссертационная работа изложена на 128 страницах, содержит 14 рисунков, 24 таблицы и список литературы из 187 наименований.
Выделение органических примесей из фармацевтических препаратов
При определении примесей в жидких образцах фармацевтических препаратов (например, в растворах для инъекций и инфузий, а также в технических образцах) в качестве пробоподготовки, как правило, проводят предварительное разбавление образца водой [9-11]. В работе [12] для выделения примесей из препарата тиапрофеновой кислоты лиофильное содержимое одной ампулы растворяли в 5 мл деионизованной воды и доводили до рН 3 0,1 М раствором HCI. Затем водную фазу экстрагировали диэтиловым эфиром, органический слой промывали водой, сушили над безводным сульфатом натрия и током азота упаривали досуха. Образовавшийся осадок растворяли в 20 мл смеси н-гексан - 2-пропанол (9:1).
В большинстве случаев фармацевтические препараты не являются жидкими образцами. Это могут быть таблетки, мази, капсулы, гранулы, сиропы и др., а также твердые и аморфные субстанции в случае технических образцов. В этом случае для выделения органических примесей из препаратов могут быть использованы такие методы пробоподготовки как жидкостная экстракция, в том числе ускоренная жидкостная экстракция (УЖЭ), экстракция в аппарате Сокслета, жидкостная экстракция в микроволновом и ультразвуковом (УЗ) поле, а также сверкритическая флюидная экстракция.
Жидкостная экстракция наиболее часто используется для выделения органических примесей из фармацевтических препаратов и технических образцов. Этот метод является традиционным; существует множество соответствующих методик, используемых, например, в Фармакопейных статьях. Это достаточно дешевый метод, как правило, не требующий специального аппаратурного оформления.
В качестве экстрагента, как правило, используются органические растворители (метанол [12, 13-15], ацетонитрил [16-18], этанол [19, 20] и др.) или их смеси (например, метанол/ацетонитрил (1:1) [21]), а также, если для последующего определения применяется метод ВЭЖХ, то соответствующая подвижная фаза [22-25]. В ряде случаев в качестве экстрагента используется вода [9, 10]. Объем используемого экстрагента составляет от 5 до 100 мл.
Если объектом исследования являются фармацевтический препарат в таблетированнои форме, то необходимое количество таблеток (от 1 до 20) тщательно растирают в порошок. Технические образцы являются, как правило, порошками и для извлечения из них примесей взвешивают 100-200 мг образца. При извлечении примесей из препаратов в виде кремов взвешивают 0,5-1 г препарата, в виде сиропов - 5-10 мл, в виде капсул -содержимое 3-10 капсул. Затем к исследуемому образцу добавляют эктрагент и для увеличения коэффициента экстракции встряхивают или перемешивают в течение 5-30 мин. Также для этого в ряде случаев применяют обработку в УЗ поле в течение 10-30 мин [13, 18, 26]. Для отделения нерастворившегося осадка от экстракта раствор фильтруют через бумажный фильтр или центрифугируют со скоростью 2500-3000 об/мин в течение 3-10 мин и затем сливают надосадочную жидкость. Таким образом, общее время, необходимое для выделения примесей из фармацевтических препаратов методом жидкостной экстракции, составляет от 10 мин до 1 часа.
Объем пробы, вводимой в хроматограф, составляет от 1 мкл (ГХ) до 10 мкл (ВЭЖХ). Таким образом, при объеме экстрагента 10-100 мл в хроматограф попадает лишь малая часть экстракта - 0,00001-0,001. Следовательно, при количестве вещества в пробе экстракта, равном 10"6г/мкл, при пределе обнаружения 10"10-10"11 г/мкл определение примесей, содержание которых в препарате составляет 10"2-10"3 % и ниже, становится невозможным.
Несмотря на то, что метод жидкостной экстракции является самым популярным для решения задачи извлечения органических примесей из фармацевтических препаратов и технических образцов, он обладает рядом недостатков, основными из которых являются продолжительность процесса (до 1 часа), необходимость работы с органическими растворителями, которые часто являются токсичными и дорогими. Кроме того, в процессе пробоподготовки происходит искажение состава пробы за счет потери части определяемых примесей и внесения присущих растворителям примесей. Как было отмечено выше, помимо классической жидкостной экстракции для извлечения органических примесей из фармацевтических препаратов могут быть использованы такие виды экстракции, как экстракция в аппарате Сокслета, ускоренная жидкостная экстракция, жидкостная экстракция в микроволновом поле и сверхкритическая флюидная экстракция. Применение этих методов оправдано, так как позволяет улучшить некоторые характеристики, а именно: уменьшить количество растворителя, используемого в качестве экстрагента, либо вообще исключить его использование, увеличить коэффициент экстракции, а также уменьшить время экстракции и стоимость пробоподготовки. Однако к настоящему времени эти методы не используются широко для выделения примесей из фармацевтических препаратов, несмотря на их очевидные преимущества перед классической жидкостной экстракцией. В ряде работ они нашли применение для выделения основного компонента. Существуют лишь единичные работы по применению некоторых из перечисленных методов для выделения примесей из фармацевтических препаратов.
Например, в работе [27] проводили исследование возможности применения жидкостной экстракции в микроволновом поле для извлечения основного компонента (фелодипина) и примеси, являющейся продуктом его разложения, из таблетированной формы препарата. В качестве экстрагента использовали 5 % раствор метанола в ацетонитриле. Объем экстрагента для извлечения фелодипина и примеси из одной таблетки составлял 10 мл, температура микроволнового нагрева составляла 80 С, время экстракции -10 мин. Полученный экстракт охлаждали льдом в течение 2 мин, добавляли 1 мл раствора внутреннего стандарта и центрифугировали со скоростью 4000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, разбавляли подвижной фазой в пропорции 1:5 и проводили ВЭЖХ анализ. Степень экстракции составила 99,0 % для фелодипина и 99,2 % для примеси. Необходимо особо отметить, что таблетку не растирали в порошок и не измельчали перед проведением экстракции, что значительно упрощает пробоподготовку, например, в рутинном анализе. Авторы также проводили выделение фелодипина и примеси одновременно из 20 таблеток
Сверхкритическая флюидная хроматография
Метод КЭ обладает высоким разрешением (ширина пиков от долей секунд до нескольких секунд) и высокой эффективностью разделения (число теоретических тарелок может достигать 104 - 106 на метр). Для определения полярных и ионогенных органических примесей в лекарственных препаратах метод КЭ является достойным конкурентом ВЭЖХ. КЭХ позволяет успешно разделять примеси с различной полярностью. Кроме того, значительным достоинством КЭ является малое время разделения. Однако существенным недостатком этого метода является низкая чувствительность (около 0,1 %), поэтому на настоящий момент КЭ не может конкурировать с ВЭЖХ и тем более с ГХ при определении органических примесей в лекарственных препаратах. 1.3.4.2. Сверхкритическая флюидная хроматография
По своим возможностям метод СФХ дополняет методы ВЭЖХ и ГХ. Он обладает более высокой эффективностью по сравнению с ВЭЖХ, так как коэффициенты диффузии и массопереноса в сверхкритических флюидах значительно больше, чем в жидкостях, используемых в качестве подвижных фаз в ВЭЖХ. Скорость анализа можно регулировать, изменяя плотность подвижной фазы, что может быть легко достигнуто изменением давления и/или температуры. Кроме того, в СФХ могут быть использованы детекторы, используемые в ГХ, которые являются более чувствительными, чем детекторы ВЭЖХ. Система СФХ/МС позволяет избежать ряд значительных трудностей, возникающих при объединении ВЭЖХ и МС.
Сверхкритический диоксид углерода чаще всего используется как подвижная фаза при определении примесей в лекарственных препаратах методом СФХ благодаря тому, что его критическая температура низка, а критическое давление и критическая плотность довольно высоки, что очень важно при использовании его в качестве подвижной фазы. Кроме того, диоксид углерода дешев, нетоксичен, не воспламеняется и невзрывоопасен. Диоксид углерода является неполярной подвижной фазой, поэтому для элюирования полярных соединений необходимо добавлять модификатор. Для этого, как правило, используется метанол. В СФХ с использованием набивных колонок добавление небольшого количества модификатора приводит к значительным изменениям удерживания, а при разделении на капиллярных колонках для достижения сколько-нибудь заметного изменения удерживания необходимы более значительные количества модификатора (5-30 %). В ряде случаев в подвижную фазу добавляют третий компонент: пропиламин [144, 145], триэтиламин [146, 147], 1,4-диоксан [148] для изменения специфических взаимодействий между элюентом и неподвижной фазой.
Капиллярные колонки являются наиболее эффективными, однако сложность разделения полярных соединений, низкая производительность и отсутствие хорошего оборудования для СФХ на капиллярных колонках обусловливает тот факт, что для определения примесей в фармацевтических препаратах методом СФХ капиллярные колонки используют редко [149, 150], а в большинстве случаев в СФХ используют набивные колонки. При этом неподвижной фазой является силикагель, модифицированный диол-[147, 151-153], аминопропильными [146, 147], цианопропильными [150] или циано- [151] группами. От модификатора неподвижной фазы зависит ее полярность, что оказывает влияние на аналитические параметры разделения.
Наиболее часто используемым детектором является УФ. Модификаторы подвижной фазы дают высокий уровень шума в ПИД, поэтому, к сожалению, этот чувствительный и универсальный детектор не может быть использован. В сочетании с СФХ используют также такие детекторы как детектор светового рассеяния, флуорометрический детектор и ЭЗД. Первый из них дает нелинейный отклик в области низких концентраций, а два последних являются селективными, что не дает возможность определять все, и тем более неизвестные, примеси в фармацевтических препаратах. Наиболее важными параметрами при подборе условий разделения и определения примесей методом СФХ на набивных колонках являются выбор сорбента колонки и модификатора подвижной фазы и его количества. Градиентное элюирование с изменением концентрации модификатора позволяет добиваться разделения примесей, сильно различающихся по полярности. Улучшения селективности и разрешения можно добиться путем изменения температуры колонки.
В СФХ в сочетании с МС используют, как правило, химическую ионизацию при атмосферном давлении [154, 155], что позволяет определить только молекулярную массу неизвестной примеси и не дает возможность определить ее структуру. Для идентификации неизвестных компонентов методом СФХ могут быть использованы также такие детекторы как ЯМР [156] и ИК-спектрометр [157], но в литературе нет работ, посвященных идентификации неизвестных органических примесей в фармацевтических препаратах этими методами.
Наиболее широкой областью применения СФХ при определении примесей в лекарственных препаратах является разделение и определение энантиомеров. В рутинных анализах для определения примесеи-энантиомеров метод СФХ более распространен по сравнению с методом ВЭЖХ, что обусловлено лучшим разрешением (в связи с большей эффективностью метода СФХ), а также меньшим временем анализа, кроме того диоксид углерода, как правило используемый в качестве подвижной фазы в СФХ, значительно дешевле ацетонитрила - основного компонента подвижной фазы в ВЭЖХ, что обусловливает меньшую стоимость СФХ по сравнению с ВЭЖХ. При этом используются как набивные [144, 145, 148, 158-160], так и капиллярные [149] колонки. В качестве сорбентов в набивных колонках используются сорбенты с хиральными неподвижными фазами на основе целлюлозы [144, 158, 160] и силикагеля [145, 148, 149].
Сверхкритическая флюидная экстракция
Разделение проводили на капиллярной кварцевой колонке 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм с неподвижной фазой CPSil 24 СВ. Режим программирования температуры колонки: 40 С (10 мин) - 10/мин -» 290 С (20 мин) (при анализе примесей в препарате клоназепама продолжительность второй изотермы была увеличена до 30 мин). Температура испарителя хроматографа составляла 270 С. Пробу вводили в режиме без деления потока. В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью потока 1,5 мл/мин. Температура переходной линии составляла 260 С, температура источника ионов-180 С, энергия электронов - 70 эВ, диапазон сканируемых масс от 50 до 500 а.е.м., скорость сканирования - 2 скан/с.
Для обработки хромато-масс-спектрометрических данных использовали программное обеспечение GCQ версии 2.2. Неизвестные примеси идентифицировали сравнением масс-спектра неизвестного соединения с базой данных NIST. Отнесение спектра к определенной структуре считали достоверным, если значения коэффициентов сходимости при прямом и обратном библиотечном поиске были больше 700.
Содержание примесей, выделенных жидкостной экстракцией, оценивали с использованием метода внешнего стандарта - раствора нафталина-de концентрацией 1Ю 8г/мкл. Оценку содержания примесей, выделенных методом СФЭ, проводили с использованием метода внутреннего стандарта - смеси 1,4-дихлррбензола 4, нафталина-ds, аценафтена 10, фенантрена 10, кризеначЗі2 и перилена-d , растворенных в метаноле в концентрации 4-Ю"9 г/мкл.
Система двухступенчатой off-line ГХ/ПИД была использована для изучения закономерностей и разработки способа выделения и концентрирования примесей на примере модельных смесей. Исследования проводили с использованием газового хроматографа модели "DANI 6500". Для проведения экспериментов использовали систему, представленную на рис. 1.
На конце разделительной колонки был установлен тройник 8, позволяющий направлять поток газа-носителя на сорбционный картридж 10 и частично на ПИД (при открытом вентиле 11) или полностью через ПИД (при закрытом вентиле 11). Разделение проводили на капиллярной кварцевой колонке 4 м х 0.32 мм х 0.45 мкм с неподвижной фазой SE-54. Температура испарителя хроматографа составляла 250 С, а температура ПИД - 250 С. Присоединение колонки к детектору и инжектору осуществляли без поддува и сброса потока. В качестве газа-носителя использовали водород. Скорость потока варьировали от 5 до 15 мл/мин. При изучении закономерностей двухступенчатой off-line ГХ на примере модельной смеси разделение осуществляли в следующем режиме программирования температуры колонки: 50 С (5 мин) - 30/мин -» 250 С (10 мин). При изучении возможности определения примесей в фармацевтических препаратах, элюируемых одновременно с основным компонентом, режим программирования температуры колонки был следующим: 50 С (3 мин) -» 20/мин - 250 С (10 мин).
Концентрирование примесей осуществляли на сорбционном картридже 10, подключенном к выходу капиллярной колонки (рис. 1), при скорости потока газа-носителя, равной 0,8 скорости потока через колонку. Картридж представлял собой металлическую трубку длиной 4 см и внутренним диаметром 3 мм, наполненную тенаксом (длина слоя 1,6 см) и хромосорбом W с 15% SE-30 (длина слоя 1,6 см). Зоны сорбентов внутри трубки отделялись друг от друга кварцевой ватой. Улавливание веществ проводили при потоке газа-носителя, направленном от слоя хромосорба W с 15% SE-30 к слою тенакса. Для перевода адсорбированных соединений в капиллярную колонку картридж с помощью иглы соединяли с испарителем хроматографа и осуществляли термодесорбцию, нагревая картридж потоком горячего воздуха.
Степень термодесорбции модельных соединений определяли, сравнивая площади соответствующих пиков, зарегистрированных при прямом вводе в инжектор 1 мкл раствора смеси № 1 и после нанесения 1 мкл этой же смеси на картридж и последующей термодесорбции. При проведении ГХ анализа вентили 2 и 11 (рис. 1) были закрыты, а вентиль 1 был открыт. 1 мкл смеси № 1 вводили непосредственно на картридж, затем к картриджу подсоединяли иглу, вводили ее в инжектор ГХ и осуществляли термодесорбцию веществ с картриджа, как описано выше. При этом вентили 2 и 11 были открыты, а вентиль 1 был закрыт. Время термодесорбции варьировали от 3 до 10 мин, температуру нагрева от 200 до 250 С, скорость потока десорбирующего газа от 5 до 10 мл/мин. После окончания термодесорбции иглу картриджа вынимали из инжектора, вентили 2 и 11 закрывали, вентиль 1 открывали и осуществляли ГХ анализ десорбированной смеси.
Изучение закономерностей выделения и концентрирования примесей при использовании двухступенчатой off-line ГХ на примере модельной смеси
В табл. 24 приведены основные результаты ГХ/МС определения среднелетучих органических примесей, выделенных жидкостной и сверхкритической флюидной экстракцией, такие как общее количество зарегистрированных и идентифицированных примесей и диапазон оценок их содержания. Как видно из представленных данных, с использованием жидкостной экстракции с последующим прямым хромато-масс-спектрометрическим анализом определено небольшое (3-Ю) число примесей на уровне 10"4-10"1 %. Эти примеси в основном соответствуют органическим соединениям с молекулярными массами больше 200, так как во время пробоподготовки происходит потеря более летучих примесей (особенно при выделении примесей из препаратов бензодиазепинового ряда, где проводили упаривание образца).
Как видно из данных табл. 24, число примесей, выделенных из таблетки диазепама жидкостной экстракцией с последующим определением методом ГХ/ГХ/МС и выделенных сверхкритической флюидной экстракцией и зарегистрированных методом ГХ/МС, практически не отличается. Однако количество идентифицированных примесей отличается (но незначительно); это обусловлено тем, что часть примесей, определенных методом СФЭ/ГХ/МС, относится к наиболее легким из определяемых примесей, потеря которых происходит при жидкостной экстракции с последующим упариванием, которое используется как метод пробоподготовки в методе off-line ГХ/ГХ/МС. Общее число примесей, зарегистрированных методом СФЭ/ГХ/МС в таблетке феназепама, примерно в полтора раза больше, чем зарегистрированных методом ЖЭ/ГХ/ГХ/МС. При этом большая часть примесей, не зарегистрированных методом ГХ/ГХ/МС, относится к более летучим соединениям, потеря которых, вероятно, происходит в процессе пробоподготовки методом жидкостной экстракции.
Как видно из анализа данных, представленных в табл. 17-23, качественный и количественный состав первичных экстрактов при использовании в качестве экстрагентов С02 и N20 отличается незначительно. Так же незначительно отличаются вторичные экстракты, выделенные сверхкритическими С02 и N20. Оценка содержания примесей в экстракте, выделенном первичной СФЭ с использованием как С02 так и N20, на 1-2 порядка больше содержания примесей во вторичном экстракте.
Из данных табл. 24 видно, что значительно большее число примесей (16-56 по сравнению с 3-10) может быть определено с использованием СФЭ/ГХ/МС по сравнению с ЖЭ/ГХ/МС. При этом диапазон определения примесей составляет от 10 6 до 10 1 %. Число выделенных примесей методом СФЭ возрастает по сравнению с жидкостной экстракцией благодаря переносу всего экстракта в хромато-масс-спектрометрическую систему, а не малой его части (0,005), что происходит при прямом хромато-масс-спектрометрическом анализе жидкостного экстракта.
В Фармакопее США регламентированы следующие примеси для некоторых исследуемых фармацевтических препаратов: в диазепаме: 5-хлор-2-(метиламин)-бензофенон, 3-амино-6-хлор-1-метил-4-фенил-карбостирил и 7-хлор-1,3-дигидро-5-фенил-2Н-1,4-бензодиа-зепин-2-он[187, а]; в клоназепаме: 2-амино-2 -хлор-5-нитро-бензофенон, 3-амино-4-(2-хлорфенил)-6-нитро-карбостирил [187, Ь]; в аспирине: свободная салициловая кислота [187, с].
Как видно из данных, представленных в табл. 3, 6 и 8, ни одна из регламентированных примесей не была определена при прямом анализе жидкостного экстракта из таблеток диазепама и клоназепама, а в таблетке аспирина была определена свободная салициловая кислота. При анализе жидкостного экстракта, выделенного из препарата диазепама, методом off-line ГХ/ГХ/МС, были определены регламентированных две примеси (см. табл. 12). При хромато-масс-спектрометрическом анализе сверхкритического флюидного экстракта, как при использовани С02 так и при использовании N20 в качестве экстрагентов, в таблетке диазепама были определены две регламентированные примеси (см. табл. 17), в таблетке клоназепама была определена одна регламентированная примесь (см. табл. 20).
Можно предположить, что часть определенных и неидентифицированных органических примесей, возможно, обусловлена наличием наполнителей в таблетках и связанных с ними примесей. В качестве наполнителей во многих таблетках, в том числе исследуемых фармацевтических препаратов, используются такие вещества, как глюкоза, сахар, крахмал, лактоза, стеариновая кислота, метилцеллюлоза, карбоксицеллюлоза, аэросил, тальк и другие вещества. Однако число тех и других должно быть невелико, так как практически все вещества, используемые в качестве наполнителей, являются нелетучими.
Доказательством отсутствия деструкции примесей и основных веществ в процессе концентрирования и термодесорбции с картриджа являлось наличие четких хроматографических пиков, соответствующих этим веществам, на хроматограммах, зарегистрированных, как для растворов этих веществ при прямом вводе в хромато-масс-спектрометр, так и для десорбированного содержимого картриджа (см., например, рис. 14).
