Введение к работе
Актуальность работы. Одним из актуальных направлений современной аналитической химии является разработка подходов к селективному и экспрессному определению средне и трудно окисляемых ограниченно растворимых или нерастворимых в воде субстратов оксидоредуктаз в матрицах сложного состава. Эта проблема сегодня стоит наиболее остро для серосодержащих субстратов, включающих два класса соединений - производные фенотиазина и дибензотиофена (ДБТ), вследствие необходимости и чрезвычайной важности постоянного контроля содержания этих соединений, являющихся нейролептическими лекарственными препаратами и общепризнанными маркерами качества дизельного топлива соответственно, в биологических жидкостях и тканях человека, а также в нефтепродуктах. В качестве типичных представителей указанных классов субстратов были выбраны промазин и ДБТ, определение которых как с практической, так и с научной точек зрения чрезвычайно актуально. Многокомпонентный состав объектов, содержащих эти аналиты, вызывает необходимость их предварительного извлечения. В настоящее время для этой цели используют длительные, трудоемкие и многоступенчатые схемы извлечения с помощью экстракции органическими растворителями или лигандно-обменной хроматографии. роме того, при определении общего содержания серы в топливе применяют различные инструментальные методы (в частности, рентгенофлуоресцентные), что удорожает анализ.
Альтернативным является подход, основанный на твердофазном извлечении аналитов с последующим определением их непосредственно в матрице сорбента методами спектрофотометрии или флуоресценции. Вследствие того, что выбранные аналиты - субстраты оксидоредуктаз, в частности пероксидазы из корней хрена (ПХ), сочетание описанного подхода с использованием биокатализатора способно обеспечить селективность их определения за счет избирательности действия фермента и сорбента.
Для окисления субстратов, в том числе при создании сенсоров, предложен широкий круг аналогов ПХ, включающий гемсодержащие белки (гемоглобин, цитохром с и др.) и биомиметики (комплексы порфирина с Mn, Co, Fe, Mo, гемин, P- циклодекстрин-гемин, гематин и др.); однако наиболее каталитически активен из них дешевый, доступный коммерческий препарат гемоглобина (Гб) из крови быка. Для повышения практической значимости методик, основанных на указанном подходе, важно сравнение эффективности и стабильности хорошо изученного фермента П и ее гемсодержащего аналога белка Гб в процессе превращения упомянутых субстратов в водной и водно-органической средах. Для успешной реализации такого подхода используемый сорбент должен не только обладать хорошими сорбционными характеристиками и извлекать определяемые соединения или их различные формы из матрицы объекта, но и быть оптически прозрачным и обеспечивать простоту регист-
Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии МГУ им. М.В. Ломоносова И.А. Веселовой за активное участие в постановке задач и обсуждении результатов исследований.
рации аналитического сигнала, формируемого в его объеме и на поверхности. В качестве матрицы таких сорбентов перспективен полисахарид хитозан, хорошо зарекомендовавший себя в аналитической практике. Актуально получение сшитых материалов на его основе: модифицированного (сшитого) хитозана и хитозана с молекулярными отпечатками (МО), а также применение их в виде двух типов сорбентов: пленок и гелей.
Цели работы заключались в:
выработке подходов к определению средне и трудно окисляемых субстратов с использованием ПХ и Гб;
оценке перспектив использования Гб вместо ПХ в качестве катализатора окисления серосодержащих субстратов в водной и водно-органической средах;
разработке способов получения оптически прозрачных пленок и гелей сшитого хитозана и хитозана с МО двумя методами: ионной и ковалентной сшивки;
выборе материала и типа сорбента, обладающего лучшими сорбционными характеристиками в отношении производных фенотиазина и ДБТ;
разработке методик определения фенотиазинов и производных ДБТ с использованием более эффективного биокатализатора и лучшего сорбента в модельных растворах.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
o оптимизировать условия проведения реакций окисления ДБТ и фенотиазинов в
водной и водно-органической средах; o выбрать оптимальный состав пленок и гелей сшитого хитозана и хитозана с МО
промазина или ДБТО2, получаемых ионной и ковалентной сшивкой; o изучить морфологию, сорбционные характеристики и селективность полученных пленок и гелей;
o выбрать условия определения ДБТ и фенотиазинов в матрице сорбента.
Научная новизна работы. Предложены новые оригинальные подходы к двухстадийному определению серосодержащих субстратов оксидоредуктаз (на примере промазина и ДБТ) методами спектрофотометрии и флуоресценции. В результате систематического изучения окисления фенотиазинов (промазина и хлорпромазина), катализируемого П и Гб, показаны аналитические перспективы использования этих биокатализаторов в водной и водно-органической средах. Выявлены значительные преимущества белка Гб перед ПХ в окислении ДБТ. С использованием Гб впервые достигнута количественная конверсия 230 мкМ ДБТ с высокой селективностью выхода продукта - сульфоксида (ДБТО) (98±1%) в течение 5 мин.
На основе биополимера хитозана предложены новые сорбционные материалы - пленки и гидрогели, полученные путем сшивки серной кислотой, глутаровым (ГА) и о-фталевым (ФА) альдегидами. Продемонстрированы преимущества использования ФА по сравнению с ГА для получения оптически прозрачных гидрогелей. Получены оптически прозрачные (в видимой области спектра) гидрогели ковалентно сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТО2, обеспечивающие извлечение этих серосодержащих соединений из растворов. Показаны преимущества использования гидрогелей сшитого хитозана перед гидрогелями хитозана с МО для извлечения и последующего определения в сорбенте фенотиазинов и производных ДБТ.
Практическая значимость. Выявлена зависимость эффективности действия биокатализаторов от природы субстрата и содержания органического растворителя в реакционной смеси. Для превращения средне окисляемых субстратов фенотиазинов пригодны оба биокатализатора - ПХ и Гб, как в водной, так и в водно-органической средах, однако в последнем случае применение ПХ предпочтительнее; напротив, при конверсии трудно окисляемого субстрата ДБТ исключительными преимуществами обладает белок Гб.
Предложены простые и экспрессные методики получения пленок и гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТО2, в том числе в лунках полистирольного планшета. Разработаны простые и экспрессные методики биокаталитического определения промазина и хлорпромазина в водной среде и в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО), а также методики определения промазина и ДБТО в матрице гидрогелей хитозана.
Автор выносит на защиту:
-
результаты изучения окисления ДБТ пероксидом водорода, катализируемого Гб в водно-органической среде;
-
результаты изучения кинетики катализируемого ПХ и Гб окисления промазина и хлорпромазина пероксидом водорода в водной и водно-органической средах;
-
методики биокаталитического определения промазина и хлорпромазина в водной среде и в присутствии ДМСО;
-
установленные условия получения гидрогелей сшитого ГА и ФА хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТО2;
-
данные по изучению оптических и сорбционных свойств гидрогелей сшитого хитозана и хитозана с МО промазина и ДБТО2;
-
методики определения в гидрогелях хитозана серосодержащих соединений: промазина методом спектрофотометрии и ДБТО методом флуоресценции.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 6 международных и всероссийских конференциях: Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011», «Ломоносов-2012» и «Ломоносов-2013» (Москва, 2011, 2012, 2013), Республиканской научно-практической конференции (с международным участием) «Зеленая химия» в интересах устойчивого развития» (Узбекистан, Самарканд, 2012), Всероссийских конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев - 2012» и «Менделеев - 2013» (Санкт-Петербург, 2012, 2013), 3rd International Conference on Bio-Sensing Technology (Spain, Sitges, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в российских журналах, 7 тезисов докладов на международных и российских конференциях, получено положительное заключение о выдаче патента РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков и 29 таблиц, и состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 2 глав экспериментальной части, 4 глав обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 188 источников.
Похожие диссертации на Гидрогели хитозана как новая матрица для извлечения и определения производных дибензотиофена и фенотиазинов оптическими методами
