Введение к работе
Необходимость эколого-аналитического мониторинга, контроля
примесей в объектах пищевой и фармацевтической промышленности, решения ряда"- медицинских - И- биохимических задач обусловливает актуальность проблемы, стоящей перед аналитической химией, - проблемы разработки высокочувствительных и селективных методов определения биологически активных веществ: ионов метхчдов, неорганических анионов, органических соединений.
Для решения этой проблемы в последние годы все шире применяют ферментативные методы. Использование биологических катализаторов, отличающихся высокими активностью и избирательностью действия, позволяет значительно повысить чувствительность и селективность методов анализа. Эти качества в сочетании с простотой аппаратурного оформления и методики эксперимента, экспрессностью обосновывают широкое внедрение ферментативных методов в заводские, агрохимические, клинические лаборатории, научно-исследовательские институты, природоохранные службы. Актуальность исследований в области ферментативных методов повышается в связи с расширением круга промышленно выпускаемых ферментов и разработкой способов их иммобилизации, благодаря чему ферменты становятся доступными і! более дешевыми реагентами.
В настоящее время ферментативные методы используют в основном для
определения самих ферментов, а также их субстратов, то есть соединений,
превращение которых катализируют ферменты. Известно весьма
ограниченное число работ, посвященных определению неорганических и органических соединений, являющихся эффекторами - активаторами или ингибиторами - ферментов. В то же время методы определения эффекторов, хотя и менее селективны, часто более чувствительны, чем методы определения субстратов. Кроме того, число эффекторов ферментов гораздо больше, чем число их субстратов, что расширяет возможности ферментативных методов анализа.
Все сказанное дает основание считать развитие методов определения эффекторов ферментов актуальным и перспективным направлением.
Одними из наиболее дешевых, достаточно устойчивых в водных растворах и выпускаемых отечественной промышленностью ферментов являются представители классов оксидоредуктаз - пероксидаза из корней хрена, супероксиддисмутаза - и гидролаз - щелочная и кислая фосфатазы, неорганические пирофосфатазы, выделенные из различных источников. Ранее влияние различных соединений на скорость реакций, катализируемых этими ферментами, изучали, в основном, в целях выяснения механизма их действия. Систематическое исследование действия неорганических и органических соединений на каталитическую активность указанных ферментов не проводилось. Практически не разработаны методы определения эффекторов этих ферментов; возможности использования в аналитических целях супероксиддисмутаз, пероксидаз другого (не из корней хрена) происхождения, пирофосфатаз вообще не изучались.
Целью настоящей работы было научное обоснование использования гидролаз и оксидоредуктаз (щелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз и пероксидаз различного происхождения, супероксиддисмутазы) в химическом анализе для определения их эффекторов - биологически активных ионов металлов, неорганических анионов, органических соединений различных классов.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
выявление неорганических и органических эффекторов щелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз и пероксидаз различного происхождения, супероксиддисмутазы;
изучение кинетических особенностей ферментативных процессов и механизма действия эффекторов на указанные ферменты для направленного выбора классов неорганических и органических соединений, которые могут проявлять активирующее либо ингибирующее действие на ферменты и, следовательно, могут быть определены с их использованием;
- развитие ферментативных методов определения биологически
активных неорганических и органических соединений - активаторов и
ингибиторов различных пероксидаз, щелочной и кислой фосфатаз,
пирофосфатаз, супероксиддисмутазы;
- поиск и разработка новых способов иммобилизации пероксидазы;
- развитие тест-методов и создание тест-устройств для определения
неорганических и органических токсикантов в объектах окружающей среды.
Научная новизна заключается в том, что
- развито - одно из направлений ферментативных методов анализа -
определение эффекторов ферментов на примере "представителей -.классов
гилролаз и оксидоредуктаз;
выявлены неорганические и органические эффекторы ферментов: шелочной и кислой фосфатаз животного и растительного происхождения; неорганическігх пирофосфатаз из пекарских дрожжей и кишечной палочки E.coli, пероксидаз из корней хрена, клеток люцерны, ксилотрофного гриба Phellinus igniarius: супероксиддисмутазы из молочной сыворотки, в результате систематического исследования действия на их каталитическуто активность широкого круга ионов металлов, неорганических анионов, органических соединений различных классов;
выявлены причины активирующего либо ингибирующего действия неорганических и органических соединений на каталитическую активность шелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз, пероксидаз и супероксиддисмутазы на основании изучения механизма их действия, установленных закономерностей и обобщений;
- показаны возможности и перспективы использования в химическом
анализе шелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз, пероксидаз,
выделенных из различных источников, а также супероксиддисмутазы для
определения их эффекторов;
показана возможность повышения чувствительности и селективности методик определения неорганических и органических эффекторов за счет использования их совместного действия на каталитическую активность фермента (на примере реакции окисления ароматических диаминов, катализируемой пероксидазой);
установлено, что совместное действие двух эффекторов не является аддитивным и в зависимости от природы серосодержащего органического эффектора изменяется характер и степень действия другого эффектора (иона металла или ртутьорганического соединения): он может либо оказывать более значительное ингибирующее действие на пероксидазу, либо менять
4 кинетические параметры ферментативного процесса; ртутьорганические соединения могут оказывать также либеративное действие на пероксидазу, ингибированную серосодержащими веществами;
предложен новый способ иммобилизации пероксидазы из хрена, основанный на ее модификации полимером хигозаном, обеспечивающий повышение устойчивости ферментного препарата, облегчающий его хранение и транспортировку;
расширены возможности использования пероксидазы хрена в химическом анализе: на основе пероксидазы, иммобилизованной в пленке хитозана на различных носителях, разработаны тест-методики и создано тест-устройство для определения ртути на уровне и ниже ПДК и ртутьорганических соединений.
Практическая значимость работы заключается в том, что разработаны ферментативные методики определения
ионов металлов:
ртути(П) ((^=0,5 пг/мл), кадмия (Сн=0,1 нг/мл), висмута(Ш) (Сн= 0,5 нг/мл), и свинца (сн =3 нг/мл) по их ингибирующему действию на пероксидазу хрена;
свинца(Н) (сн= 0,7 нг/мл) по ингибирующему действию на щелочную фосфатазу животного происхождения;
редкоземельных элементов (сн= 008 - 0,4 нг/мл) по ингибирующему действию на пирофосфатазы, выделенные из пекарских дрожжей и Exoli;
- железа(Ш) (Ch=10 пг/мл) по реактивирующему действию на
пероксидазу хрена, ингибированную салициловой кислотой;
неорганических анионов:
фторид- ( = 2 нг/мл) и цианид-ионов (сн = 10 пг/мл) по ингибирующему действию на пероксидазу хрена;
фторид- (сн = 5 пг/мл), вольфрамат- (сн = 0,02 нг/мл) и молибдат-ионов (сн = 0,6 нг/мл) по ингибирующему действию на кислые фосфатазы растительного происхождения;
цианид- (сн= 0,05 мкг/мл), тиосульфат-ионов (сн — 5 мкг/мл) по ингибирующему действию на супероксиддисмутазу из молочной сыворотки;
5 органических соединений:
- Р-содержащих комплексонов (( = 0,01-1 мкМ) по активирующему
действию на щелочную фосфатазу;
алифатических аминов (сц = 10 мкМ) по ингибирующему действию на супероксиддисмутазуГ "" "" "" ---
S-содержаших соединений (сн = 0,02-500 мкМ), органических кислот (сн= 20 пМ - 20 мкМ), N-coдержащих соединений (сн = 0,2 - 40 мкМ) по ингибирующему либо активирующему действию на пероксидазу хрена;
фенолов и аминофенолов (с„ = 0,2 - 50 мкМ) по ингибирующему действию на пероксидазы из хрена, люцерны, гриба Phellinus igniarius;
ртугьорганических соединений (метил-, этил-, фенилртуги с сн = 0,05 - 1 мкМ) по их либсративному действию на пероксидазу хрена.
Разработаны также тест-методики и созданы тест-устройства для определения различных форм ртути - неорганической и ртутьорганических соединений на основе пероксидазы хрена, иммобилизованной в пленке хитозана на различных носителях.
Разработанные методики определения неорганических и органических эффекторов ферментов нашли применение при решении следующих практических задач: для определения бензотриазола в охлаждающей воде теплообменников в лаборатории водных режимов и коррозии Уральского филиала ВНИИ теплотехники; для определения фосфорсодержащих комплексонов на фоне их комплексонатов при контроле процесса удаления гипсовых отложений в вакуум-испарительных установках на Усть-Каменогорском свинцово-цинковом комбинате; для определения ртути в речных, морских и подземных водах, крови человека, белковом витаминном концентрате; кадмия, вольфрамат-иона - в почвах; цинка - в крови человека в НЦ хирургии РАМН; для определения высокотоксичных фторорганических соединений.
Апробация работы, Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на III Всесоюзной конференции по аналитической химии (Минск, 1979), IV-VI Всесоюзных конференциях по применению органических реагентов в аналитической химии (Москва, 1980; Киев, 1983; Москва, 1984), Всесоюзном симпозиуме по получению и
6 применению иммобилизованных ферментов (Ленинград, 1980), Всесоюзных конференциях по методам анализа объектов окружающей среды (Тбилиси, 1983; Москва, 1983; Санкт-Петербург, 1991; Краснодар, 1994), Уральской конференции "Современные методы анализа и исследования материалов металлургии и машиностроения (Устинов, 1985), II, III Региональных конференциях "Аналитика Сибири" (Красноярск, 1986; Иркутск, 1990), V-VII Всесоюзных симпозиумах по инженерной энзимологии (Кобулети, 1985; Вильнюс, 1988; Москва, 1991), VI Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991), Всесоюзной конференции "Технология ключевых соединений, используемых в синтезе биологически активных веществ" (Пенза, 1993), IV и V Международных симпозиумах "Кинетика в аналитической химии" (Эрланген, Германия, 1992; Москва, 1995), VI Российско-японском симпозиуме по аналитической химии (Санкт-Петербург, 1992), II Международном симпозиуме по аналитической химии (Монтре, Швейцария, 1994), Международном симпозиуме "Пероксидазы. Биотехнология и применение" (Пущино, 1995).
Публикации, По материалам диссертации опубликовано 60 работ, получено 4 авторских свидетельства СССР и патента РФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 335 стр. машинописного текста, содержит 61 рисунок, 66 таблиц. Состоит из введения, 3 частей, 14 глав, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Библиография включает 397 наименований. Положения, выносимые на зашиту:
Похожие диссертации на Ферментативные методы анализа: определение эффекторов гидролаз и оксидоредуктаз
