Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Эколого-морфологические особенности развития корневой системы растений 16
1.1.1. Характеристика рода Amaranthus L, как пищевой и кормовой культуры 16
1.1.2. Влияние эдафических факторов на развитие корневой системы растений 24
1.1.3. Влияние плотности посева нарост и развитие растений 32
1.2. Эколого-физиологическое взаимодействие корневой системы растений и азотфиксирующих микроорганизмов 36
1.2.1. Ризосферная зона растений как место обитания диазотрофов 36
1.2.2. Ассоциативные диазотрофы родов Azotobacter и Azospirillum 44
1.2.3. Особенности метаболизма азотфиксирующих микроорганизмов 49
1.2.4. Взаимодействие азотфиксирующих микроорганизмов и небобовых
растений 54
1.3. Влияние экологических факторов на ассоциативную азотфиксацию 56
1.3.1. Продуктивность ассоциативной азотфиксации в ризосферной зоне небобовых растений 56
1.3.2. Инокуляция небобовых растений диазотрофными микроорганизмами 61
1.3.3. Возделывание овощных и зеленных культур в защищенном грунте 70
1.4. Консервирование кормовых культур 75
1.4.1. Микробиологические аспекты силосования кормовых культур 75
1.4.2. Специфика консервирования амаранта 80
Глава 2. Материалы и методы исследований 84
2.1. Физико-географическая характеристика и природно-климатические условия района исследований 84
2.2. Видообразцы амаранта из коллекции Ботанического сада Казанского государственного университета 84
2.3. Характеристика почв 86
2.4. Выделение азотфиксирующих и других ризосферных микроорганизмов 88
2.5. Определение нитрогеназной активности у ризосферных диазотрофов 92
2.6. Определение витаминов группы В и индолил-3-уксусной кислоты у азотфиксирующих микроорганизмов 93
2.7. Определение антагонистической активности азотфиксаторов 96
2.8. Изучение влияния азотфиксирующих микроорганизмов на всхожесть семян и развитие проростков амаранта 97
2.9. Определение потенциальной активности азотфиксации ризосферной почвы 98
2.10. Проведение производственной инокуляции в защищенном грунте... 101
2.11. Эколого-микробиологические аспекты силосования амаранта 102
2.11.1. Определение в динамике численности естественной микрофлоры растительного сырья 103
2.11.2. Идентификация молочнокислых бактерий 104
2.11.3. Определение химического состава, питательности кормов и органических кислот 106
2.12. Статистическая обработка результатов 108
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Влияние плотности посева на рост и развитие Amaranthus cruentus /,...110
3.1.1. Динамика роста и особенности развития корневой системы и надземных органов A. cruentus L 110
3.1.2. Поступление азота, фосфора и калия в растения A. cruentus L 114
3.1.3. Динамика численности ризосферных микроорганизмов амаранта 116
3.2. Нитрогеназная активность ризосферы растений рода Amaranthus L. в онтогенезе 119
3.2.1. Ассоциативная азотфиксирующая активность видообразцов рода Amaranthus L. в условиях полевого опыта 119
3.2.2. Динамика численности ризосферных диазотрофов амаранта 127
3.2.3. Выделение азотфиксирующих микроорганизмов различными методами 130
3.2.4. Характеристика ризосферных азотфиксаторов амаранта 131
3.2.5. Нитрогеназная активность ризосферных диазотрофов 133
3.2.6. Образование физиологически активных веществ микроорганизмами родов Azotobacter и Azospirillum ...135
3.2.7. Фунгистатические свойства азотфиксаторов 138
3.3. Влияние бактеризации на нитрогеназнуїо активность ризосферы растений рода Amaranthus L. в лабораторных и вегетационных опытах 140
3.3.1. Влияние бактеризации семян амаранта на их прорастание и развитие проростков 140
3.3.2. Влияние бактеризации на ризосферную азотфиксирующую активность растений рода Amaranthus L. в лабораторном опыте 144
3.3.3. Влияние бактеризации на ризосферную азотфиксирующую активность растений рода Amaranthus L. в вегетационном опыте 146
3.3.4. Разработка биологических методов повышения урожайности экологически безопасной продукции овощных и зеленных культур в условиях защищенного грунта 154
3.3.5. Эколого-микробиологические аспекты силосования кормовых видов амаранта с кукурузой 158
Глава 4. Обсуждение результатов 172
Заключение 198
Выводы 202
Научно-практические рекомендации 205
Список литературы
- Характеристика рода Amaranthus L, как пищевой и кормовой культуры
- Видообразцы амаранта из коллекции Ботанического сада Казанского государственного университета
- Динамика роста и особенности развития корневой системы и надземных органов A. cruentus L
- Образование физиологически активных веществ микроорганизмами родов Azotobacter и Azospirillum
Введение к работе
Актуальность работы. Важным резервом сельскохозяйственного производства является интродукция новых растений, которые превосходят традиционные по урожайности, содержанию ценных компонентов и устойчивости к неблагоприятным воздействиям. В этой связи большой интерес представляет введение в агрофитоценозы представителей семейства Amaranthaceae, относящихся к растениям с Q-типом фотосинтеза, и внедряемых в первую очередь с целью устранения дефицита кормового и пищевого белка. Включение амаранта в производство позволяет обогащать корма полноценным белком, углеводами, зольными элементами, витаминами, полнее реализовать ресурсный потенциал различных зон, уменьшить отрицательное влияние засухи. Ценные свойства этого растения неоднократно отмечались в литературе (Saunders, Becker, 1984; Лазаньи с соавт., 1988; Чернов, Земляной, 1991; Чернов, 1992а; Bressani, 1994; Schnetzler, Breene, 1994; Segura-Nieto et al., 1994; Амелин с соавт., 1995; Магомедов с соавт., 1996).
Амарант по основным почвенно-климатическим зонам России отличает высокая биологическая урожайность зеленой массы (до 120-150 т/га) и семян (до 6 т/га), устойчивость к неблагоприятным воздействиям, вредителям и болезням, экологическая безопасность продукции, ее хорошая поедаемость и усвоение животными (Kigel, 1994; Lozoya-Gloria, 1994; Караев, Тменов, 1998; Иванова, 1999). Известно, что в 1930 году академик Н.И. Вавилов первым в нашей стране рекомендовал амарант к незамедлительному использованию, но только с середины 80-х годов XX века началась его производственная интродукция, которую, однако, сдерживало отсутствие точных представлений о биологической специфике растений этого рода.
Внедрение в практику сельского хозяйства высокоурожайных видов и сортов растений требует оптимального удовлетворения их основных потребностей, в том числе создания в прикорневой зоне высоких концентраций легкодоступных соединений азота. Однако увеличение выпуска и применения азотных удобрений связано с решением ряда сложных проблем, наиболее значимыми из которых являются энергетическая и экологическая.
Отмечающееся в последние годы обострение экологической ситуации, падение естественного плодородия почв приводят к резкому ухудшению качества продукции растениеводства, что вызывает повышенное внимание к биологическому земледелию, суть которого заключается в мобилизации потенциальных возможностей агроэкосистем при минимизации применения химических средств для повышения урожайности возделываемых культур и повышения качества получаемой продукции (Шерстобоева с соавт., 1997; Наумова, 1998; Бузмаков, 1999; Шатохина с соавт., 2000).
Важнейший резерв повышения продуктивности сельскохозяйственных растений - использование ризосферных азотфиксирующих бактерий, функции которых при растительно-микробных взаимодействиях многообразны: это фиксация молекулярного азота, улучшение питания растений за счет повышения коэффициента использования минерального азота, синтеза биологически активных веществ, повышение устойчивости растений к действию патогенов и абиотическим стрессам (Тихонович, 1993; Шамсутдинов, 2002).
Возросший интерес к проблеме биологической фиксации атмосферного азота связан с перспективой практического использования этого явления для нужд сельского хозяйства, внимание к которому в 20-ые годы прошлого столетия привлек СП. Костычев, отметивший, что основным путем
снабжения небобовых растений биологическим азотом следует считать ассоциативную азотфиксацию. Известно, что даже самая высокая продуктивность посева, сформированная за счет биологического азота, не приводит к негативным последствиям. Уже накоплен большой объем данных о взаимоотношениях небобовых растений с диазотрофами (Берестецкий, І985; Умаров, 1985, 1986; Чумаков, 1988; Патыка, 1991; Дегтярева, Чернов, 2001). Ассоциативная азотфиксация осуществляется самыми разными микроорганизмами в ризосфере и филосфере многих растений во всех природных зонах, в силу чего имеет большую экологическую значимость (Коненков с соавт., 1979; Шабаев с соавт., 1989; Потапова, 1993; Емцев, 1994).
В настоящее время наметились два основных подхода к усилению азотфиксации в агроэкосистемах: активизация деятельности спонтанной популяции диазотрофных микроорганизмов в ризосфере и на корнях и инокуляция растений активными и эффективными штаммами азотфиксаторов (Патыка, 1993). Первый путь заключается в оптимизации факторов среды и подборе видов, линий, сортов растений, наиболее способных к активной азотфиксации. Второй путь предусматривает использование высокоэффективных в отношении азотфиксации микроорганизмов. Не менее перспективным направлением является подбор и использование специально для этого создаваемых искусственных ассоциаций микроорганизмов, обладающих суммарным положительным эффектом и экологической поливалентностыо.
Проблема поиска эффективных азотфиксаторов при всей ее сложности чрезвычайно актуальна. Прикорневая зона растений является наиболее благоприятной средой для размножения диазотрофов, а растения рода Amaranthus L., обеспечивающие их активное развитие, могут служить
«поставщиками» перспективных штаммов или ассоциаций азотфиксирующих бактерий для целого ряда сельскохозяйственных культур (Oziganova, Tchernov, 1993; Oziganova et al., 1993; Дегтярева с соавт., 1998, 2003).
Понимание сущности микробиологических процессов, протекающих в почве, метаболических процессов в клетках эпифитной микрофлоры и корневой системы растений, используемых в растениеводстве, аналитическая оценка этих процессов и микрофлоры, ответственной за их течение, необходимы для совершенствования современных технологий эффективного выращивания сельскохозяйственных культур.
Благодаря интенсивным научно-исследовательским и производственным экспериментам в природно-климатических условиях Республики Татарстан накоплена новая обстоятельная информация по биологии амаранта. В диссертации, предлагаемой к защите, представлены результаты исследований видообразцов растений рода Amaranthus L. с повышенной способностью к образованию ассоциации с диазотрофными бактериями и рассмотрены пути усиления азотфиксации в корневой зоне этих растений, ведущие к повышению их продуктивности и большему накоплению белка, а также к расширению использования амаранта в растениеводстве, и, в частности, в кормопроизводстве посредством комбинированного силосования.
К началу наших исследований в Ботаническом саду Казанского государственного университета было проведено изучение почвенных микроорганизмов только для одного видообразца Amaranthus cruentus L. и выделен один из представителей азотфиксиругощего комплекса - Azotobacter chroococcum (Ожиганова, 1993). Это представлялось не вполне достаточным для расшифровки физиолого-биохимического механизма взаимодействия корневой системы амаранта и ризосферных диазотрофов, а также в плане практического использования эффекта бактеризации.
Целью настоящей работы явилось исследование эколого-физиологической регуляции взаимодействия в агроценозе растений рода Amaranthus L. и диазотрофных бактерий и поиск путей усиления азотфиксации в корневой зоне этих растений, обладающих способностью к интенсивному биосинтезу и накоплению белка.
Задачи исследования:
Изучить эколого-морфологические особенности развития корневой системы A. emeritus L. на дерново-подзолистой почве;
Оценить эколого-физиологическое взаимодействие корневой системы различных видообразцов растений рода Amaranthus L. и диазотрофов по способности к ассоциативной азотфиксации;
3. Исследовать уровень нитрогеназной активности корневой зоны
инокулированных растений рода Amaranthus L. в онтогенезе на свету и в
темноте;
Изучить влияние эдафических факторов на количественный состав ризосферных азотфиксаторов амаранта;
Выявить перспективные штаммы диазотрофных бактерий по их способности фиксировать азот, продуцировать витамины, гормоны роста и стимулировать прорастание семян амаранта;
Изучить влияние отобранных азотфиксаторов на всхожесть семян и формирование проростков амаранта;
Изучить влияние бактеризации семян интродуцируемых видов растений рода Amaranthus L. на интенсивность их роста, биометрические показатели и химический состав фитомассы;
Исследовать влияние бактеризации диазотрофными бактериями, выделенными из ризосферы амаранта, на урожайность и качество
продукции овощных и зеленных культур в условиях защищенного
грунта;
9. Определить численность естественной микрофлоры и соотношение
органических кислот в процессе силосования амаранта с кукурузой.
Научная новизна. Впервые исследована эколого-физиологическая
регуляция взаимодействия в агроценозе растений рода Amaranthus L. и
диазотрофных бактерий. Изучена нитрогеназная активность ризосферной
зоны растений - интродуцентов рода Amaranthus L. в онтогенезе и выявлены
видообразцы с повышенной способностью к фиксации молекулярного азота в
ассоциации с микроорганизмами. Из ризосферной зоны различных
видообразцов амаранта выделены бактерии родов Azotobacter и Azospirillum,
обладающие высокой активностью ацетиленредукции, ростстимулирующими
и фунгистатическими свойствами. Для целей бактеризации сформирован
комплекс штаммов Azotobacter chroococcum и Azospirillwn spp., обладающий
полифункциональным положительным действием. Подробно изучено
влияние плотности почвы на увеличение общей массы корней и урожайности
зеленой массы A. cruentus L, Впервые исследованы эколого-
микробиологические аспекты комбинированного силосования амаранта с кукурузой в динамике и установлено повышение качества продукта по содержанию органических кислот и микроорганизмов по сравнению с кукурузным силосом. Научная новизна разработок защищена двумя патентами РФ («Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, используемый для получения бактериального удобрения под амарант» № 2074158, приоритет 27.02.97 г. и «Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, используемый для получения бактериального удобрения под огурцы» № 2074157, приоритет 27.02.97 г.).
Практическая значимость работы. Предложено использование в сельском хозяйстве определенных видов амаранта с повышенной азотфиксирующей активностью микроорганизмов в ризосферной зоне, что представляет собой энергосберегающий и экологически безопасный способ получения ценного растительного белка. На основе многолетних исследований установлена оптимальная густота посева A. cruentas L. при возделывании его на зеленую массу и выявлено положительное влияние приема окучивания на рост и развитие растений. Эффективность применения видообразцов амаранта с высокой нитрогеназной активностью, а также бактеризация их выражается в повышении интенсивности биосинтеза и накопления белка в растении. Способ комбинированного силосования успешно прошел испытания в НПО «Нива Татарстана». В диссертации имеется копия акта лабораторного испытания, подтверждающая эффективность использования амаранта с повышенной азотфиксирующей активностью в комбинации с кукурузой для получения консервированного корма высокого качества.
В приложении к диссертации представлены рекомендации, подготовленные в помощь практическим работникам сельского хозяйства:
Критерии и методы микробиологической оценки качественного состояния почвы и ее техногенного загрязнения (2003 г.);
Микробиологические основы возделывания кормовых видов амаранта (2004 г.).
Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, были представлены и докладывались на многочисленных научных конференциях и симпозиумах международного, общероссийского и регионального уровней: на Международных конференциях: «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1995); «Фундаментальные и
прикладные проблемы охраны окружающей среды» (Томск, 1995); «Люпин и амарант - источник новых пищевых и диетических продуктов» (Санкт-Петербург, 1996); «Актуальные проблемы развития зональных исследований и пути повышения их эффективности в сельскохозяйственном производстве» (Казань, 2000); «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Пенза, 2000); «Почва, жизнь, благосостояние» (Пенза, 2001); «Ecological phyziology of plants: problems and possible solutions in the century» (Syktyvkar, 2001); «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Ульяновск, 2002); «II международная конференция по анатомии и морфологии растений» (Санкт-Петербург, 2002); «Роль почвы в формировании естественных и антропогенных ландшафтов» (Казань, 2003); «Состояние и проблемы научного обеспечения овощеводства защищенного грунта» (Москва, 2003); «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004); «Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений» (Москва, 2004); «Проблемы рационального использования растительных ресурсов» (Владикавказ, 2004); Международных симпозиумах: «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (Пущино, 1995; 1997); «Эколого-популяционный анализ кормовых растений естественной флоры, интродукция и использование» (Сыктывкар, 1999); Всесоюзной научной конференции «Возделывание и использование амаранта в СССР» (Казань, 1991); Всероссийских научных конференциях: «Кормовые растительные ресурсы - фактор научно-производственного процесса в кормопроизводстве» (Киев - Белая Церковь, 1989); «Амарант: агроэкология, переработка, использование» (Казань, 1993); «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Пенза, 1998); «Первая Всероссийская конференция по ботаническому ресурсоведеншо» (Санкт-
Петербург, 1996); «Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья» (Саранск, 1999); «Флористические и геоботанические исследования в Европейской России» (Саратов, 2000); «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2001); «Агроэкологические проблемы сельскохозяйственного производства в условиях техногенного загрязнения агроэкосистем» (Казань, 2002); X съезде Русского ботанического Общества «Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков» (Санкт-Петербург, 1998); Республиканских (региональных) научных конференциях: «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 1995; 1997; 2000; 2002); «Окружающая среда и здоровье» (Казань, 1996); «III Республиканская научная конференция молодых ученых и специалистов» (Казань, 1997); «Роль Ботанического сада в интродукции, сохранении редких видов растений и экологическом воспитании» (Саранск, 2000); Научных конференциях: «I Всеукраинская научно-практическая конференция по проблемам выращивания, переработки и возделывания амаранта на кормовые, пищевые и другие цели» (Винница, 1995); «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 1995); «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); «Научно-практическая конференция, посвященная 50-летию кафедры общего земледелия агрономического факультета Пензенской государственной сельскохозяйственной академии» (Пенза, 2004); «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Москва, 2004); Конференции почвоведов, агрохимиков иземледелов Среднего Поволжья и Урала «Почвы Среднего Поволжья и Урала, теория и практика их применения и охраны» (Казань, 1991) и других.
Публикации. По теме диссертации в отечественной и зарубежной печати опубликовано 65 научных работ, в том числе 2 практические рекомендации производству и 15 статей.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 265 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков, 20 таблиц и состоит из Введения, 4 глав (Обзор литературы, Материалы и методы исследований, Результаты исследований, Обсуждение результатов), Заключения, Выводов, Научно-практических рекомендаций и Приложения. Список цитируемой литературы включает 513 наименований, из них 162 на иностранных языках.
Характеристика рода Amaranthus L, как пищевой и кормовой культуры
Амарант - культура, свойства которой привлекают внимание биологов и агрономов многих стран. Зеленая масса и семена амаранта широко используются на кормовые, пищевые, лекарственные и технические цели, поскольку по содержанию белка, витаминов, биологически активных веществ, жиров они превосходят многие традиционные сельскохозяйственные растения (Saunders, Becker, 1984; Магомедов, 1989; Чернов, Земляной, 1991; Чернов, 19926; Walkovszky, Szocs, 1992; Schnetzer, Breene, 1994; Амелин с соавт., 1995). За высокую питательность, продуктивность и адаптационные возможности экспертами Продовольственной комиссии ООН (ФАО) амарант признан важнейшей культурой XXI века.
Особое внимание ученых и практиков амарант привлек после того, как в конце 60-х годов XX столетия фитофизиологи В. Лэтч и Д. Даунтон установили его принадлежность к группе растений с высокоинтенсивным фотосинтезом С4-типа, что в значительной степени объясняло большие потенции его продуктивности даже при условии крайне лимитирующих факторов роста и развития (Laetsch, 1968; Downton et al., 1969). Главными продуктами фиксации С02 в культуре фотосинтезирующей ткани таких растений являются Сф-кислоты (Usuda et al., 1971; Магомедов, 1974).
Для получения высокого урожая необходим подбор растений, которые обладали бы достаточной интенсивностью фотосинтеза и значительной скоростью ростовых процессов (Курсанов, 1976; Гудвин, Мерсер, 1986; Чернов, 1997). Далеко не каждый вид сельскохозяйственных культур может, как амарант, за 100 дней создать фитомассу в 50 т/га и более, причем 2/3 этого количества за 40 дней (Железнова с соавт., 1989; Чернов, 1992а). В зависимости от условий питания, интенсивности света и влагообеспеченности скорость фотосинтеза у Сд-растений может превышать 80 мг СОг/дм -ч, то есть в 2-3 раза выше, чем у большинства С3-культур. Определяющим фактором высокой продуктивности амаранта является сопряжение функционирования Сз- и С4-путей углерода в клетках мезофилла и обкладки проводящих пучков листа (Эдварде, Уокер, 1986). Сочетание высокоинтенсивного фотосинтеза с достаточно эффективными белоксинтезирующими системами делает амарант перспективной культурой для повышения продуктивности растениеводства в широких агроэкологических условиях (Любимов с соавт., 1991).
Как известно, процесс фотосинтеза в основном происходит в листьях растений, где создается до 95% сухой массы урожая. Следовательно, чем более развит листовой аппарат, тем выше продуктивность растений. А.А. Ничипорович (1970, 1982) считает, что максимальный урожай большинства сельскохозяйственных культур (с С3-типом фотосинтеза) обеспечивается при достижении индекса листовой поверхности (ИЛП) равным 4 в период наиболее активного роста растений. При более высоких значениях индекса листовой поверхности урожай их чаще всего снижается, тогда как у с С4-растений оптимальная величина ИЛП составляет 8-Ю и более.
Большим преимуществом амаранта перед другими кормовыми культурами является высокая биологическая продуктивность. Урожай его зеленой массы по основным почвенно-климатическим зонам России превышает на 50% и более продуктивность традиционной силосной культуры - кукурузы. На участках с высоким уровнем плодородия, при оптимальной агротехнике и в условиях орошения этот показатель увеличивается в 1,5-2,0 раза (Иванова, 1999). В общей биомассе растений амаранта соотношение фитоэлементов составляет от 57,4 до 59,9% стеблей, 20,3-21,5% соцветий, 15,0-15,9% листьев и 4,1-5,5% семян (Бариева, 1997; Иванова, 1999).
Отличительной особенностью амаранта является значительная семенная продуктивность - 1,5-6,0 т/га и высокий коэффициент размножения семян -до 500000. Такого коэффициента не имеет ни одна традиционная культура (Schnarf, 1929; Woodcock, 1931; Ярошевич, Лобан, 1991; Алтунин, 1992; Делчев Ленин, 1999).
Важная особенность, выгодно отличающая амарант от многих сельскохозяйственных культур, заключается в том, что в составе его белков семян и фитомассы содержатся все незаменимые аминокислоты, необходимые для нормальной жизнедеятельности организма животных. Сумма незаменимых аминокислот амаранта находится на уровне высокобелковых кормовых растений (Carlsson, 1977; Saunders, Becker, 1984; Железнова с соавт., 1989; Домаш с соавт., 1991). Ни одна из известных зерновых культур не имеет столь высокого содержания (6-9%) лизина в белке (Carlsson, 1992; Dodok et al., 1992; Племенкова с соавт., 1993), к тому же при достаточно высоком содержании белок амаранта отличается хорошей растворимостью и легко экстрагируется (Carlsson, 1977; Segura-Nieto et al., 1994; Plemenkova et al., 1996; Гасимова, Чернов, 2004).
Видообразцы амаранта из коллекции Ботанического сада Казанского государственного университета
Характеристика почв. Полевые опыты по изучению нитрогеназной активности корневой зоны различных видообразцов амаранта проводились в 1991 -1998 гг. на дерново-подзолистой почве совхоза «Беркутовский» Республики Татарстан по общепринятой методике (Доспехов, 1987). Почва имела следующую агрохимическую характеристику: рН - 6,65; гумус - 1,8%; N щелочно-гидролизуемый - 264,0 мг/кг; Р205 - 146,6 мг/кг; К20 - 92,6 мг/кг.
Опыты по изучению корневой системы Amaranthus cruentus L. были заложены в 1991-1999 гг. по методике ВИУА и включали четыре варианта с разной площадью питания: I вариант - 70x10 см, II - 70x20 см, III - 70x30 см, IV - 70x40 см, где 70 см - ширина междурядий, а 10, 20, 30, 40 см -расстояние между растениями в рядах. В вегетативной фазе каждый вариант был поделен на два подварианта: окученный и неокученный. Посев, прополка, прореживание, окучивание и уборка проводились вручную. В вегетативной фазе проводили прополку и прореживание согласно схеме опыта, а также первое окучивание посевов и рыхление междурядий. Второе окучивание с рыхлением и прополкой осуществляли в фазе бутонизации.
Лабораторные и вегетационные опыты по изучению влияния диазотрофов на нитрогеназную активность корневой зоны амарантовых были проведены в 1993-2001 гг. на дерново-подзолистой среди есуглин и стой почве со следующей агрохимической характеристикой: рН - 5,9, гумус - 1,8%, N щелочно-гидролизуемый - 86,6 мг/кг, Р2О5 и К20 - 52,5 и 78,0 мг/кг, соответственно. Удобрения не вносили. Объектом исследования служили изолированные корни растений с прилегающим слоем почвы толщиной не более 2 мм (ризосфера). Общим контролем являлась почва без растений.
Опыты в защищенном грунте совхоза «Майский» с бактеризацией различных овощных культур были проведены в 1995-1998 гг. на дерново-подзолистой почве со следующей агрохимической характеристикой: рН - 6,3, гумус - 1,9%, N щелочно-гидролизуемый - 89,3 мг/кг, Р205 и К20 - 430,0 и 690,0 мг/кг, соответственно. Удобрения не вносили.
Полевой опыт для исследования нитрогеназной активности корневой зоны различных видообразцов амаранта был заложен в 45 вариантах (табл. 3) в 3-х кратной повторности. Растения выращивали на делянках площадью 10,5 м . Площадь опытной делянки, где изучалась корневая система A. cruentus L. - 25 м , общая площадь опыта - 800 м . Повторность четырехкратная. Лабораторные и вегетационные опыты закладывали в 6-ти кратной повторности.
Посев амаранта проводили при прогреве почвы на глубину 10-15 см до 12-16 С. Норма высева - 0,8-1,0 кг/га. Оптимальная глубина заделки семян в почву 1,0-1,5 см. Всходы появлялись на 10-12 день.
В течение всего вегетационного периода изучали динамику роста надземных и подземных органов A. cruentus L. С целью наблюдения за динамикой роста и развития надземных органов измеряли высоту растений и их массу, а таклсе определяли ассимиляционную поверхность листьев. Учет роста корневой системы проводили биометрическим методом (Калинин, 1991), который заключается в проведении соответствующих измерений каждого морфологического элемента и предполагает полное извлечение корневой системы из почвы путем сухой раскопки и отмывки корней водой, а затем измерение в лабораторных условиях. Корни отмывали от почвы водой с использованием сита с ячеей 0,25 см, группировали их по фракциям: стержневой, корни диаметром более 1 мм, корни диаметром менее 1мм. После этого определяли их массу, диаметр и длину. Проводили вычисление коэффициента продуктивности корневой системы (формула 1) и пространственного коэффициента корней (формула 2). КПкс = Ри/Рк{\), где Рн— масса надземной части растения, Рк - масса корней. ПК = А -Y(CM2)(2). Пространственный коэффициент распространения корней (Юрин, 1979) представляет собой произведение значения проникновения корней вглубь почвы (А) на значение распространения корней в горизонтальном направлении (В).
Плотность дерново-подзолистой почвы на опытном участке (г/см ) Фазы онтогенеза вегетативная бутонизация цветение неокученные окученные неокученные окученные неокученные экученные 1,32 1,14 1,30 1,10 1,28 1,12
Плотность почвы (табл. 4) определяли в процессе онтогенеза растений на окученных и неокученных вариантах по общепринятой методике при помощи бура Качинского (Балахчев, Фаткулин, 1982).
Почвенные пробы для агрохимических и микробиологических анализов отбирали по общепринятой методике в течение всего вегетационного сезона (Методы..., 1991; Практикум..., 2001). Ризосферную микрофлору определяли в различные фазы онтогенеза: вегетативную, бутонизации, цветения, плодоношения. Контролем служила почва без растений.
Динамика роста и особенности развития корневой системы и надземных органов A. cruentus L
Определение химического состава, питательности кормов и органических кислот проводили по общепринятым методикам (Разумов, 1986; Петухова с соавт., 1989). Исследовано содержания сырого протеина, жира, клетчатки, золы, сахара, БЭВ в фитомассе изучаемых видообразцов амаранта.
Определение органических кислот в силосах осуществляли методом газожидкостной хроматографии на приборе «Хром 5» (Разумов, 1986). Метод основан на хроматографическом разделении жирных кислот в колонке хроматографа и их идентификации по стандартам индивидуальных кислот. Подготовка пробы к анализу заключалась в отжатии сока из консервированного корма, очистке его от механических примесей и белка, переводе связанных кислот в свободные и введении добавок для снятия «эффекта памяти». Прямое разделение водных растворов свободных жирных кислот производилось на стационарных фазах типа сложных эфиров или полигликолей. Идентификация кислот и количественный расчет их содержания в силосе осуществлялась по стандартным смесям кислот. Средний образец силоса перед отжатием сока тщательно перемешивали, измельчали на измельчителе растительных проб типа ИПР-2. Отжимали сок на гидравлическом прессе. Цилиндр стакана заполняли массой образца, уплотняли, придавливали поршнем, ставили в пресс и в течение 1 минуты выдерживали под давлением около 50 атм. Во внешнюю часть стакана набирали не менее 20 мл жидкости. 5 мл сока из внешнего стакана сливали в центрифужную пробирку, а остальную часть - в стаканчик для определения рН и общей кислотности. В пробирку с соком добавляли 0,5 мл 50%-ной трихлоруксусной кислоты и 5 капель 85%-ной муравьиной кислоты, слегка встряхивали пробирку и центрифугировали в течение 5 минут при 6 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали в бюкс с притертой крышкой и хранили до анализа в холодильнике. Подготовленный к анализу сок (4 мкл) вводили в испаритель прибора с помощью микрошприца и вводили пробу в испаритель хроматографа. В испарителе происходит быстрое и полное испарение пробы, поскольку температура его нагрева более высокая, чем температура кипения наиболее высококипящего компонента пробы.
Элюируемые газом-носителем кислоты регистрировались детектором согласно их температурам кипения и на ленте самописца появлялись в виде пиков различной высоты. Разделенные пики идентифицировали соответственно времени удерживания каждой кислоты по стандартным смесям, составленным из чистых кислот. По хроматограмме измеряли время удерживания и рассчитывали площади пиков. Количественный анализ осуществляли методом абсолютной калибровки. Для этого хроматографировали специально приготовленные смеси с известной массой определяемых кислот. Измеряли площади пиков и строили градуировочный график в координатах: площадь пика - концентрация кислоты (для каждой отдельно).
Расчет содерэ/сания молочной кислоты и соотношения кислот. Количественное содержание молочной кислоты в граммах на 100 г силоса определяли по разности между общей кислотностью и суммой найденных кислот по формуле: Смол = А - (С2 + С, + С4 + CJ, где А - общая кислотность силоса, г/100 г; С2, С3, С4, Сн - содержание уксусной, пропионовой, масляной и других кислот, г/100 г. Находили сумму массовых долей уксусной, пропионовой, масляной и молочных кислот и принимали ее за 100%: С = С2 + С3 + С4 + Смоя = 100%. Далее рассчитывали отношение массы каждой кислоты к суммарной массе.
Образование физиологически активных веществ микроорганизмами родов Azotobacter и Azospirillum
Бактерии рода Azospirillum долгое время трудно было выделить из ризосферы растений рода Amaranthus L. Для изоляции азоспирилл были использованы разные методы, существенный недостаток которых в том, что активные штаммы азоспирилл получают путем длительного отбора и, они, как правило, обладают низкой нитрогеназной активностью. Нами опробовано пять известных методов выделения диазотрофных микроорганизмов. В результате опытов отобраны методика Л.В. Васюк с соавторами (Авторское..., 1987) и методика О.Н. Шиляевой и З.М. Яковлевой (1988).
По вышеуказанной методике (Авторское..., 1987) активные штаммы азоспирилл выделяются путем подавления роста неактивных и малоактивных микроорганизмов. Сущность метода заключается в выращивании проростков различных видообразцов амаранта на вермикулите и среде Красильникова -Кореняко и последующем рассеве гомогенатов корней на твердую модифицированную среду Доберейнер, на которой вырастают колонии 10-15 видов микроорганизмов, а не 200-300, как при обычных способах, причем все полученные штаммы азоспирилл - активные азотфиксаторы (табл. 9).
В параллельных исследованиях, связанных с изоляцией азотобактера на жидкой среде Эшби с сахарозой, при микроскопировании накопительной культуры мы обратили внимание на то, что в культуральной жидкости нередко встречаются клетки, сходные по описанию с азоспириллами. При инокуляции культуральной жидкости в полужидкую малатную среду (по методике О.Н. Шиляевой и З.М. Яковлевой, 1988) за 12 ч инкубации (37С) обнаружена четкая подповерхностная пленка и подщелачивание среды. Микроскопическим анализом выявлено наличие монокультуры азоспирилл. Выделенные чистые культуры азоспирилл показывают высокую активность ацетиленредукции (табл. 9).
Таким образом, по данным наших исследований, для выявления микроорганизмов-стимуляторов целесообразно пользоваться одновременно несколькими методами, основанными на метаболических особенностях диазотрофных бактерий.
В процессе выполнения работы из ризосферы и ризопланы исследуемых видообразцов амаранта в различные фазы их развития выделены (табл. 10) штаммы бактерий - представители рода Azotobacter (19 штаммов) и рода Azospirillum (10 штаммов).
Клетки штамма Az. chroococcum В35 (задепонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМВ-6010) в молодом возрасте - кокки, реже диплококки, размер которых в зависимости от возраста колеблется в пределах 1,8-2,0x3,2-4,1 мкм. С возрастом происходит объединение клеток в цепочки. Клетки малоподвижны. На твердых средах образуют гладкие блестящие колонии. При старении они приобретают темно-коричневую окраску. Пигмент в среду не проникает. Клетки штамма Az. chroococcum Ш25 (задепонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМВ-6011) имеют форму кокков, располагаются одиночно и парами, а на 7 сутки - в виде коротких цепочек. Размер клеток колеблется в пределах 0,7 1,7x3,0-4,1 мкм. Слабоподвижны, капсула вокруг клеток не заметна. На агаризованных средах образуют плотную слизь. Поверхность колонии гладкая, блестящая, слабоморщинистая в более старом возрасте. Пигмент коричневый.
Клетки других выделенных штаммов азотобактера в молодом возрасте -кокки, реже диплококки, размер которых колеблется в пределах 1,8-2,0x3,2-4,1 мкм. С возрастом происходит объединение клеток в цепочки. Клетки малоподвижны. На твердых средах образуют гладкие блестящие колонии. При старении они приобретают коричневую окраску. Пигмент в среду не проникает.
Клетки штаммов Azospirillum spp. А1 и А22 - аэробные, палочковидные, грамотрицательные бактерии (1x3 - 4 мкм), необычайная подвижность и характерный тип движения которых, позволяет дифференцировать их в составе разных микробных ассоциаций. Кроме того, эти штаммы отличает образование ярко-розового пигмента, не диффундирующего в среду, что дает возможность их быстрого визуального распознавания. Колонии на картофельном агаре среднего размера (5-8 мм в диаметре), округлые, полупрозрачные с плотным центром, с характерным металлическим блеском. 8 течение недели колонии накапливают розовый пигмент. На среде с конго красным колонии мелкие (0,5-2,0 мм в диаметре), интенсивного темно красного цвета, сухие, морщинистые, с агара снимаются целиком. Все выделенные из ризосферной зоны амаранта штаммы азоспирилл являются микроаэрофилами и имеют типичные морфологические признаки: клетки короткие, округлые на концах, виброидной, иногда спиральной формы с характерным, специфичным винтообразным движением.
