Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Сравнительная характеристика половой системы бескишечных турбеллярий 11
1.1. Общий обзор половой системы И
1.2. Ультраструктура спермиев 16
1.3. Семенные сумки и их придатки .23
1.4. Функциональная роль наконечников 26
15 Замечания по терминологии 30
ГЛАВА 2 Материал и методика . 34
ГЛАВА 3 Ультраструктура спермиев . 36
3 1 Результаты 36
311 Pseudaphanostoma smithrn . 36
З 12 Praeconvoluta tigrina, Isodiametra pulchra, Aphanostoma brascai 36
3 1 3 Otocelis sandara 40
3 14 Philocelisbrueggemanni . 43
3 1 5 Notocelisgullmarensis 45
3 1 6 Paedomecynostomum bruneum 49
3 1.7 Daku woonmensis 50
3 1 8 Stomatncha hochbergi 57
3 1 9 Wulguru cuspidata . 59
3 2 Обсуждение 61
3 2 1 Типы спермиев Acoela и их таксономическое значение 61
3 2 2 Эволюция спермиев 69
3 2 3 Цитоскелет спермиев морфофункциональные аспекты 74
ГЛАВА 4 Ультраструктура и гистохимия бурс и их наконечников . .77
4 1. Результаты . . 77
4 1 1 Notocehs gullmarensis
4 1 2 Daku woonmensis
4 1 3 Aphanostoma brascai
4 1 4 Aphanostoma virescens
4 1 5 Wulguru cuspidata
4 1 6 Pseudmecynostomum phoca
4.2. Обсуждение
4 2 1 Общая характеристика бурс и их склеротизированных придатков
4 2 2 Пути формирования скелетных структур у низших билатерий
4 2 3 Типы наконечников
4 2 4 Функциональные особенности наконечников
4 2 5 Эволюция придатков бурс
Заключение
Основные результа ты и выводы .
Литература
- Ультраструктура спермиев
- Функциональная роль наконечников
- Praeconvoluta tigrina, Isodiametra pulchra, Aphanostoma brascai
- Daku woonmensis
Введение к работе
Едва ли среди свободноживущих низших беспозвоночных найдется группа, сравнимая с бескишечными турбелляриями (Асоеіа) по уникальности своей морфологии и тканевой организации. Внешний вид Acoela кажется типичным для турбеллярий, но взгляд на их внутреннюю анатомию обнаруживает структуру более примитивную, чем у других ресничных червей (рис. 1). Бескишечные турбеллярии лишены эпителизованной кишки, и переваривание пищи происходит у них при участии специализированных паренхимных клеток, причем у некоторых форм эти клетки могут сливаться, образуя так называемый пищеварительный синцитий (рис. 1А, Б, ср; Мамкаев, Маркосова 1979, Smith 1981a,b; Smith & Tyler 1985 и др.) Дыхательная и выделительная системы отсутствуют. Центральная нервная система представлена несколькими продольными стволами, соединенными между собой неправильными тяжами грубого нервного сплетения; мозг, по существу, возникает как локальное утолщение фронтальной комиссуры; остальная часть нервной системы образована диффузным нервным плексусом (Raikova et al. 1998b; Reuteretal. 2001). Эпидермис не отграничен от постилающей его мускулатуры базальной пластинкой, и внеклеточный матрикс присутствует лишь в виде тонкой капсулы, окружающей статоцист. Эмбриональное развитие также имеет ряд уникальных черт. Дробление носит спиральный характер, но отделение макромеров на анимальном полюсе происходит не квартетами, как при обычном спиральном дроблении, а дуэтами, т.е попарно (Bresslau 1909; Apelt 1969, Богута 1972; Гуреева, Мамкаев 1989 и др.). В отличие от других первичноротых, бескишечные турбеллярии способны генерировать только эндомезодерму -эктомезодерма и ее производные у них отсутствуют (Henry et al. 2000). По существу, бескишечные турбеллярии устроены проще, чем любые другие свободноживущие билатерии, и хотя некоторые из перечисленных признаков говорят о специализации Acoela, большая часть из них, безусловно, свидетельствует о филогенетической примитивности группы.
Рис. 1. А - внешний вид Aphanostoma virescens, с живого придавленного экземпляра. Б - схема организации A. virescens. В - Notocelis gullmarensis, сагиттальный срез.
Хотя вопрос о первичной примитивности бескишечных турбеллярий обсуждается уже более ста лет (Мечников 1877,1878,1886; Graff 1882, 1891, 1904-1908), убедительные доказательства в пользу этой гипотезы появились совсем недавно. Анализ последовательностей генов 18S и 28S рДНК (Ruiz-Trillo et al. 1999; Telford etal. 2003), миозина II (Ruiz-Tnllo et al. 2002), гена let-7 (Pasquinelh et al. 2003) и митохондриальной ДНК (Ruiz-Trillo et al. 2004) показывает, что Acoelomorpha* не принадлежат к Plathelminthes (плоским червям), но являются сестринской группой для всех ныне живущих билатерий. Руководствуясь этими данными, Baguna & Ruitort 2004 предложили эволюционную гипотезу, согласно которой Acoelomorpha представляют собой раннее ответвление филогенетической ветви, давшей начало всему современному разнообразию трехслойных животных, и поэтому должны были сохранить многие примитивные черты, свойственные планулоидным предкам билатерально-симметричных животных. Плоские черви занимают аналогичное базальное положение в таксоне Lophotrophozoa, объединяющем Annelida, Mollusca, Tentaculata и близкие им группы (Jondelius et al. 2002).
Следует сказать, что вопрос о возможной полифилии плоских червей и необходимости разделения этого типа на две или три независимые группы (Acoelomorpha, Catenulida и Rhabditophora) обсуждался еще до появления первых молекулярно-филогенетических исследований (Smithetal. 1986). Действительно, признаки, объединяющие Acoelomorpha и Rhabditophora (гермафродитизм, внутреннее оплодотворение, нитевидные двужгутиковые спермин и др.), при всестороннем анализе оказываются либо плезиоморфиями, либо гомошшиями, и, следовательно, не могут служить надежными источниками филогенетической информации. Единственный признак, представляющий потенциальную филогенетическую ценность, связан с организацией камбиальной системы. У плоских червей (включая бескишечных турбеллярий и катенулид) соматические клетки неспособны к делению и поэтому заживление и восполнение дефинитивных тканей происходит исключительно за счет размножения и дифференцировки
* Класс (тип) Acoelomorpha включает бескишечных турбеллярий и родственный им отряд Nemertodermatida.
специальной популяции стволовых клеток - необластов (Bagunaetal. 1989; Дробышева 1991; Auladell et al. 1993; Riegeretal. 1999; Rieger& Ladurner2001 и др.) Тем не менее, вопрос о филогенетическом значении особенностей камбиальной системы нуждается в дополнительной разработке (в частности, неизвестно как происходит замещение соматических клеток в других группах низших билатерий) и поэтому далее в этой работе бескишечные турбеллярии будут рассматриваться как филогенетическая линия, возникшая независимо от рабдитофорных турбеллярии и катенулид. При этом термин «турбеллярии» («ресничные черви») будет использоваться для обозначения общего уровня организации без учета действительных филогенетических связей между группами, к которым прилагается этот термин.
Простота организации бескишечных турбеллярии служит серьезным препятствием при установлении филогенетических отношений в пределах отряда, существенно ограничивая число признаков, которые могут быть использованы при построении таксономической системы. В этой ситуации органы половой системы, достигающие у Acoela сложности, необычной на фоне примитивности других систем, становятся незаменимыми (а иногда и единственными) источниками филогенетической информации.
В то время как признаки мужских копулятивных органов широко используются в принятой на сегодняшний день системе бескишечных турбеллярии (Dorjes 1968), органы женского полового аппарата (бурсы и их наконечники) изучены мало и, по существу, остаются за пределами внимания исследователей. Наконечники бурс представляют собой сложные многоклеточные образования и, очевидно, что стандартные гистологические методики недостаточны для их всестороннего изучения. В этой ситуации неоценимую помощь могут оказать методы электронной микроскопии. К сожалению, на данный момент существует лишь одна работа, в которой наконечники бурс рассматриваются на ультраструктурном уровне (Bruggemann 1985).
Особенности ультраструктуры спермиев активно используются систематиками при исследовании самых разных групп беспозвоночных. Недавно было показано их потенциальное значение и в систематике бескишечных турбеллярии - на
основании строения аксонем спермиев были установлены три основные группы ранга надсемейств, на которые распадается отряд Acoela (Raikovaetal 2001; Hooge et al. 2002). К сожалению, на текущий момент ультраструктура спермиев известна только для 32 видов бескишечных турбеллярий и лишь примерно половина спермиев из этого списка исследована достаточно детально для того, чтобы на основе этой информации можно было делать таксономические или филогенетические выводы. Едва ли можно сомневаться, что дальнейшее исследование выявит новые морфотипы спермиев и позволит с большей точностью определять филогенетические отношения между родами и семействами бескишечных турбеллярий.
Цель данного исследования - дать сравнительную и функциональную характеристику спермиев и наконечников бурс бескишечных турбеллярий и выявить таксономически значимые признаки. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
выбрать представителей с неясным или спорным таксономическим положением;
провести ультраструктурное исследование спермиев;
выяснить функциональную роль элементов цитоскелета в локомоции спермиев;
провести комплексное (ультраструктурное и гистохимическое) исследование бурс и их склеротизированных придатков;
выяснить функциональную роль склеротизированных придатков бурс и вероятные пути их эволюции;
провести таксономическую оценку рассмотренных семейств Acoela.
Ультраструктура спермиев
На светооптическом уровне спермин, принадлежащие разным группам Acoela, лишь незначительно отличаются друг от друга (Westblad 1948: стр 31; Hendelberg 1969а). Сперматозоиды бескишечных турбеллярий обладают нитевидной или лентовидной формой и неизменно несут две аксонемы, инкорпорированные в цитоплазму клетки. Интересно, что аксонемы имеют инвертированное положение: их кончики заходят в ядросодержащий отдел или, по крайней мере, лежат в непосредственной близости от ядра, а центриоли расположены на противоположном дистальном конце спермия. В морфологическом плане в сперматозоиде бескишечных турбеллярий можно различить три отдела В проксимальном ядросодержащем участке спермия расположено удлиненное ядро (лишь в отдельных случаях ядро смещается в дистальном направлении) Далее следует промежуточный, или средний, отдел (shaft, mid piece), включающий все крупные клеточные органеллы (митохондрии, цитоплазматические гранулы и др.). Последний дистальный участок спермия образует узкий хвостовой отдел - в этот отдел заходят лишь аксонемы, прочие крупные органеллы здесь отсутствуют. В цитоплазме обнаруживаются два основных типа включений, отграниченных от цитоплазмы мембраной. Более крупные преломляющие гранулы хорошо видны при изучении мазков спермиев методами фазово-контрастной микроскопии, благодаря своим светопреломляющим свойствам. Так называемые плотные включения обычно мельче преломляющих гранул и на светомикроскопическом уровне, как правило, не просматриваются.
Ультраструктурные исследования выявили существенные вариации во внутренней организации спермиев. Это разнообразие в значительной степени определяется составом и расположением микротрубочек, как тех, что формируют аксонемы, так и тех, что лежат непосредственно в цитоплазме спермия.
У 18 из 35 видов бескишечных турбеллярий, исследованных с помощью электронного микроскопа (см. табл. 1) (и, по-видимому, у большинства Acoela), аксонемы имеют конфигурацию (далее обозначаемую как 9+2), обычную для ресничек и жгутиков: девять дуплетов по периферии аксонемы и два синглета микротрубочек в центре (рис. 2, а, б). Вместе с тем, у Acoela встречаются еще два типа аксонем, один из которых (9+1) является уникальным для этой группы турбеллярий. Аксонемы структуры 9+1 описаны у 4 видов (рис. 2, в; табл. 1) -вместо двух синглетов, в центре такой аксонемы располагается только одна микротрубочка. Подобное строение принципиально отличается от аксонем, описанных у Trepaxonemata - в группе, которая объединяет всех ресничных червей, кроме Catenulida, Acoelomorpha и Macrostomida (Ehlers 1985). Хотя аксонемы трепаксонемат часто обозначаются как 9+1, в центре располагается не микротрубочка, а пара фибрилл, закрученных в форме двойной спирали (Thomas 1975; Burton 1976 и др.). Таким образом, в более корректной нотификации конфигурация таких аксонем должна обозначаться как 9+"1". Для бескишечных турбеллярий «трепаксонематная» конфигурация микротрубочек описана Афцелиусом у Mecynostomum auritum (Afzelius 1966, 1975,1982; Bacetti & Afzelius 1976), однако, приведенная им в подтверждение микрофотография едва ли может принадлежать сиермию Acoela, так как имеет слишком много трепаксонематных признаков (Сама по себе организация аксонемы также представляется «слишком» типичной для трепаксонемат.) Можно предположить, что произошло загрязнение пробы, в которую вместе с Mecynostomum auritum попали какие-то неидентифицированные плательминты (см. также Raikova& Justine 1994). Хендельбері (Hendelberg 1977) также пишет о присутствии аксонем трепаксонематного типа у спермиев Childia groenlandica, однако не приводит в качестве свидетельства электронных микрофотографий. Таким образом, наличие у бескишечных турбеллярий спермиев с аксонемами вида 9+"1" является недоказанным и представляется весьма маловероятным.
Расшифровка признаков: 1: Тип аксонемы: 9+2 (0), 9+1 (1), 9+0 (2); 2: Мембранная орнаментация: отсутствует (0), волокнистый гликокаликс (1), в форме продольных гребней (2); 3: Нитевидные придатки (микроподии) на поверхности спермия: отсутствуют (0), имеются (1); 4: Цитоплазматические микротрубочки: отсутствуют (0), кортикальные (1), аксиальные (2), окружают впячивание плазматической мембраны (3); 5: Цитоплазматические микротрубочки в форме креста: нет (0), да (1); 6: Число микротрубочковых цилиндров: один (0), два (1); 7: Цитоплазматические микротрубочки в форме двух параллельных лент: нет (0), да (1); 8:
Функциональная роль наконечников
Существует множество предположений касательно функционального назначения наконечников. Согласно мнению, которое разделяет сегодня большинство исследователей, наконечники используются как каналы, по которым хранящаяся в семенных сумках сперма партнера поступает в область яичников, где осуществляется оплодотворение (см., например, Hyman 1951: стр. 121) Положение наконечников и их строение в целом свидетельствуют в пользу такой трактовки. Тем не менее, эта гипотеза до сих пор не была подтверждена наблюдениями. Напротив, многие авторы, описывавшие бурсы на светомикроскопическом уровне, подчеркивали, что, хотя перед входом наконечника часто наблюдаются значительные скопления спермы, на выходе сперма неизменно отсутствует (Mark 1892: стр. 308; Беклемишев 1915; Иванов 1952 и др.; см., также обсуждение в Богута1971: стр.122) . Кроме того, если наконечники - лишь пассивные проводники спермы, остаются необъяснимыми их сложность и удивительное многообразие в пределах отряда.
В кратком сообщении, затрагивающем вопрос о функциональной роли бурс у Polychoerus carmelensis, Костелло и Костелло (Costello & Costello 1968; см. также Henley 1974: стр 277 и 296) выразили сомнение, что сперматозоиды способны проникать в канал наконечника, тем более, проходить его насквозь, так как эффективный диаметр последнего существенно меньше диаметра спермиев. Авторы предположили, что наконечники скорее выполняют функцию резорбции избыточной спермы. Темный нитевидный материал, нередко присутствующий у проксимального конца наконечников Р carmelensis (см. Henley 1974: рис.3),
Костелло и Костелло интерпретировали как продукт процесса резорбции -остаточную цитоплазму спермиев. Такого же мнения придерживался и Л. фон Графф (Graff 1891) Согласно Граффу, у бурс Amphiscolops наблюдаются три функциональных состояния: бурсы, целиком заполненные спермой (Graff 1891: Табл. II, 1), бурсы, содержащие отдельные группы спермиев у входа в наконечник (Graff 1891: Табл. II, 2), и, наконец, бурсы, лишенные спермиев и заполненные лишь остаточным гранулярным материалом (Graff 1891: Табл. II, 3) Графф трактовал эти состояния как последовательные фазы резорбции избыточной спермы. Хотя такая функция наконечников представляется маловероятной, важно подчеркнуть, что во многих случаях наконечники не способствуют прохождению сперматозоидов, а представляют скорее дополнительный барьер на пути спермы.
Высказывались предположения, что основная функция наконечников состоит в сортировке (отборе) или дозировании спермы, в частности, что они могут пропускать сперматозоиды по одному, уменьшая опасность полиспермии или блокируя «дефектные» спермин (см., например, Богута 1971; Henley 1974; Bruggemann 1985). Интересные данные о возможной функциональной роли наконечников приведены в диссертации К.К. Богуты, посвященной морфологии и репродуктивному циклу Anaperus biaculeatm (Богута 1970,1971). Спермин, свободно лежащие в полости бурсы, имеют обычную для этого вида лентовидную форму. Те же спермин, которые подходят к наконечнику, претерпевают необычные изменения. Они укорачиваются, ядра закручиваются в плотную спираль, проксимальные участки спермиев образуют перед входом в канал наконечника ампулообразные утолщения. На противоположном конце наконечника Богута обнаружил тонкие нити, тянущиеся наружу из выходного отверстия канала. По мнению Богуты, эти нити представляют собой видоизмененные ядра сперматозоидов, лишенные значительной части цитоплазмы. Аналогичные данные о структурных модификациях спермиев, проникающих в наконечник у Anaperus tvaerminemis, приведены в работе Лютера (Luther 1912). У этого вида направленные во вход наконечника спермин также имеют скрученное в спираль ядро и ампулообразно расширенный проксимальный конец Однако данных о нитях, появляющихся на противоположном конце наконечника, Лютер не приводит. Трудно сказать, какое значение имеют подобные модификации спермиев, однако кажется вероятным, что наконечник у этих видов участвует в подготовке сперматозоидов к оплодотворению (капацитации).
Интересно отметить, что спермин могут претерпевать определенные изменения еще до попадания в канал наконечника По крайней мере у нескольких видов Acoela лежащие в бурсах сперматозоиды лишены преломляющих гранул, характерных для спермиев, заполняющих пузыри совокупительных органов (Henley 1974; Fegleyetal. 1984; Smith & Tyler 1984). Таким образом, потеря этих включений (очевидно, путем экзоцитоза) происходит либо во время копуляции, либо непосредственно в семенной сумке.
Положение и ориентация наконечников по отношению к другим органам половой системы иногда плохо сочетаются с идеей о функциональном назначении по дозированной доставке спермы к месту оплодотворения яиц Так, например, у Polychoerus caudatus многочисленные мелкие наконечники направлены почти перпендикулярно продольной оси тела, прилегая непосредственно к вентральному эпителию и даже несколько выдаваясь наружу. Э. Гардинер (Gardiner 1898) предполагал, что осеменение у Р caudatus происходит путем подкожной инъекции и наконечники играют в этом процессе существенную роль. По мнению Гардинера, наконечники прокалывают покровы партнера во время копуляции, после чего совокупительный орган вводит сперму в образовавшуюся ранку.
Направленные к вентральному эпителию (но не вперед, к ооцитам) наконечники описаны у целого ряда видов, у некоторых видов наконечники направлены косо назад, прочь от яичников, наконец, среди конволютид встречаются виды, у которых наконечники не только направлены вертикально вниз, но и плотно соединены с вентральным эпидермисом мышечными волокнами.
Praeconvoluta tigrina, Isodiametra pulchra, Aphanostoma brascai
Pseudaphanostoma smithrii (рис. 6А, Б) Относительно небольшое ядро имеет на поперечных срезах округлую или овальную форму и содержит электронно-плотный аморфный хроматин с разрозненными островками светлой кариоплазмы (рис. 6А).
Аксонемы следуют приблизительно до середины ядросодержащего отдела. Почти на всем своем протяжении они имеют структуру 9+2 (рис. 6Б, стрелки), но у дистального конца ядра центральная пара микротрубочек исчезает и аксонемы принимают форму 9+0 (рис. 6А, стрелки). Плоскости, проходящие через центральные микротрубочки в обеих аксонемах, образуют между собой прямой или острый угол. Цитоплазматические микротрубочки занимают в клетке кортикальное положение и располагаются более или менее равномерно по всей длине среднего отдела (рис. 6Б, наконечники стрелок) - в других отделах спермиев цитоплазматические микротрубочки отсутствуют. Поверхность спермия покрыта мембранной орнаментацией в виде узких продольных гребней - каждый второй гребень соединен пучком тонких филаментов с лежащей под ним кортикальной микротрубочкой Форму гребней трудно определить из-за недостаточно удачной фиксации материала. Никакой упорядоченности в расположении цитоплазматических включений установить не удалось. Все включения имеют одинаковые размеры (150-250 х 70-80 нм), но существенно различаются по электронной плотности (рис. 6Б, сі)
Для спермиев A. bruscai характерны исключительно крупные цистерны (зоны прикрепления), лежащие по обеим сторонам аксонем (рис. 7, az).
Цитоплазматические микротрубочки занимают кортикальное положение - они располагаются на равном расстоянии друг от друга непосредственно под поверхностной мембраной и прослеживаются на срезах вдоль всего среднего отдела. У A. bruscai 6 цитоплазматических микротрубочек достигают дистального конца клетки - здесь они размещаются двумя симметричными группами (по 3 микротрубочки в каждой) по обеим сторонам спермия между аксонемами (рис. 7Б). У I. pulchra цитоплазма среднего отдела содержит большое число клеточных включений (плотных гранул?), которые заметно варьируют по размеру и форме. У P. tigrina включения не столь многочисленны, но также разнообразны по величине и форме. У A. bruscai округлые цитоплазматические гранулы (диаметром 80-110 нм) разделены на две группы, лежащие по обеим сторонам от плоскости аксонем (рис. 7А); между ними вдоль оси клетки проходит цепочка митохондрий (рис. 7А, т). У всех трех видов поверхность спермия покрыта мембранной орнаментацией в виде регулярно расположенных продольных гребней, профили которых на поперечных срезах напоминают раздвоенные зубцы крепостных стен. У P. tigrina все гребни связаны филаментами с подстилающими их микротрубочками, у A. bruscai и /. pulchra только каждый второй элемент орнаментации соединен с кортикальной микротрубочкой.
Линии, проходящие через центральные синглеты в аксонемах, параллельны друг другу и на протяжении значительной части среднего отдела перпендикулярны плоскости, идущей через центры обеих аксонем. Ближе к ядру плоскость центральных микротрубочек может поворачиваться к линии аксонем под острым углом (рис. 8; 9А, Б), а в ядросодержащем отделе спермия они уже практически параллельны друг другу. Между аксонемами в среднем отделе расположен электронноилотный стержень, тесно связанный с плазмалеммой (рис. 9Д, edc). (Не исключено, впрочем, что эта структура представляет собой не стержень, а серию коротких тяжей, так как на некоторых поперечных срезах она не просматривается.)
Цитоплазматические микротрубочки имеют необычную конфигурацию. В ядросодержащем районе все микротрубочки лежат на периферии клетки (в кортикальной позиции) (рис. 9А), но дистальнее ядра часть из них сдвигается ближе к центру, образуя две латеральные полуцилиндрические группы несколько вентральнее аксонем - эти микротрубочки желобообразно охватывают скопление плотных гранул (числом от 2 до 8 в каждой группе), так что последние оказываются «зажатыми» между ними и поверхностной мембраной спермия (рис. 8, наконечники стрелок; 9Б, В).
Плотные гранулы имеют узкоцилиндрическую форму и отличаются необычайной для этих органелл протяженностью (достигая, по крайней мере, 2,3 мкм в длину при диаметре 70-75 нм - см. рис. 9, db, 10В). Все они располагаются более или менее параллельно продольной оси спермия. Содержимое плотных гранул не совсем гомогенно: обычно хорошо различимы электронноплотная сердцевина и более светлый внешний слой. В среднем отделе цитоплазматические микротрубочки формируют два диагональных ряда ближе к центру спермия (рис. 9Г, Д).
Daku woonmensis
Notocelis gullmarensis (рис. ЇВ; 26Ж-И; 27). Небольшая бурса овальной формы (рис. IB, b) с каудальной стороны открывается на поверхность широкой безресничной вагиной. Короткий бочонковидный наконечник направлен вперед, к яичнику. Стенка бурсы составлена из серии тонких, плотно упакованных, концентрических слоев (12 у экземпляра, исследованного под электронным микроскопом). Уплощенные ядра располагаются в стенке бурсы без какой-либо упорядоченности
Наконечник состоит из 10-12 расширенных на концах отростков, принадлежащих клеткам стенки бурсы (рис. 27А, Ьп); отростки несколько отогнуты внутрь, в полость семенной сумки. Сортирующий аппарат, преддверие и промежуточные клетки отсутствуют. Форма наконечника хорошо прослеживается на конфокальных препаратах благодаря высокому содержанию фибриллярного актина (рис. 26Ж-И). Микрофиламенты сосредоточены в концевых участках отростков (рис 27Б, ас), окружающих канал наконечника - в радиальном направлении (к периферии наконечника) концентрация микрофиламентов постепенно уменьшается. Отростки четырех наружных клеток бурсы содержат гораздо меньше актина (рис 27В, стрелки), чем те отростки, что лежат ближе к полости семенной сумки У экземпляра, исследованного под электронным микроскопом, виден толстый пучок спермиев, проходящий через канал наконечника (рис. 27А, sp). Сперма, лежащая внутри бурсы, окружена оболочкой из однородного цитоплазматического материала.
У 11 экземпляров N gullmarensis, окрашенных фаллоидином, наконечник имел цилиндрическую или бочонковидную форму (рис. 26Ж, 3, Ьп) Однако у одного из исследованных червей дополнительно к основному цилиндру имелась цепочка из 5 гранул округлой или конусовидной формы, дающих сильную реакцию на актин (рис 26И, наконечники стрелок) Эти гранулы сильно отличаются по своей форме от мышечных волокон и, по-видимому, представляют собой склеротизированные участки, отделившиеся от основного наконечника
Daku woorimensis (рис. 26Г-Е; 29-32). Вытянутая в дорсо-вентральном направлении бурса занимает положение непосредственно перед мужским совокупительным аппаратом. С фронтальной стороны стенка бурсы расширена, образуя клеточный колпачок, обычно упирающийся и даже вдавленный в яйцо (рис. 28), сзади стенка переходит в широкую безресничную вагину. Колпачок содержит тела клеток уплощенной формы, чьи периферические отростки образуют собственно стенку бурсы, так что последняя составлена из серии тонких концентрических клеточных слоев (обычно более 20) и лишена ядер Большинство ядер лежит ближе к периферии клеточного колпачка, а их центральные отростки формируют серию склеротизированных сегментов
Среди клеток колпачка выделяются два типа. Эти клетки отчетливо различаются по электронной плотности, и так как они расположены чередующимися рядами, создается впечатление, что электронноплотные слои перемежаются в колпачке с электронносветлыми (рис. 28) Клетки с более электронноплотной цитоплашой принимают участие в формировании склеротизированных сегментов, а электронносветлые клетки заполняют пространство между сегментами. Впрочем, в отдельных случаях клетки второго типа могут накапливать актин по краям вдоль своих плазматических мембран, образуя своего рода окаймление вокруї дистальных концов склеротизированных участков (рис 31 А, В, стрелки) Оба типа клеток имеют овальные или несколько уплощенные ядра с крупным центральным ядрышком.
Наконечник разделен на 10 или более склеротизированных сегментов. Последние расположены в виде цепочки, так что вся структура имеет внешнее сходство с бусами или четками (рис. 26Г, ss). Ориентация сегментов различна -большинство повернуто вперед, в сторону яичника (рис. 26Д, Е; 29А, стрелки), но некоторые могут лежать перпендикулярно этому направлению. Впрочем, положение сегментов, по всей видимости, весьма динамично и на тотальных препаратах, к тому же, может изменяться под давлением покровного стекла. Склеротизированные сегменты уменьшаются в размере к периферии колпачка; длины сегментов варьируют от 4-5 мкм рядом с бурсой до 2 мкм на противоположном конце колпачка. Основа каждого склеротизированного сегмента образована единым клеточным отростком, который «расщеплен» на три части, так что на продольном срезе через канал он имеет форму трезубца. Перпендикулярно этому отростку, располагаются еще два отростка, проходящие внутри развилок между ветвями «трезубца» (рис. 31 А, В). Таким образом, все три элемента лежат более или менее перпендикулярно оси канала, при этом все три заполнены густой сетью актиновых филаментов в тех своих частях, которые обращены к просвету наконечника. Актиновая природа склеротизированных участков подтверждается конфокальными данными - при дифференциальной окраске фаллоидином клеточные отросгки, образующие сегменты наконечника, дают отчетливую положительную реакцию на фибриллярный актин (рис. 26Д, Е).
В покоящемся состоянии, когда колпачок лишен спермы, канал каждого склеротизированного сегмента закрыт, наподобие пробки, так называемой осевой клеткой (рис. 29Б-Г, ахс). Эта клетка проходит через канал и оканчивается в дистальной части сегмента округлым утолщением, напоминающим булавочную головку (рис. 29Б, be). Противоположный конец клетки расширен и содержит овальное ядро, ничем ни отличающееся от ядер друїих клеток колпачка (рис. 29Г, п)
Согласно данным эпифлюоресценции, осевые клетки включают значительное количество фибриллярного актина, превышающее его концентрацию в клетках, образующих сами склероіизированньїе сегменты - на конфокальных проекциях осевые клетки отчетливо выделяются на общем фоне по интенсивности окраски, и булавовидная форма этих клеток хорошо прослеживается на рис. 26Д. Однако на ультраструктурном уровне оформленные актиновые микрофиламенты в этих клетках почти не просматриваются. Цитоплазма осевых клеток вообще бедна обычными оріанеллами, но заполнена многочисленными электронносветлыми пузырьками различной формы и размера (вероятно, лизосомной природы) (рис. 29Г). По всей видимосш, большая часть актиновых филаментов сосредоточена внутри центрального отростка клетки, который отграничен от остальной цитоплазмы плазматической мембраной, именно этот отросток и образует булавовидный придаток, заполняющий канал склеротизированною сегмента (рис. 29Б, В; ЗОА, be).
