Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Материалы и методы 15
1.1. Материал 15
1.1.1. Систематическое положение исследованных червей
1.1.2. Сбор паразитологического материала 16
1.2. Методики 19
1.2.1. Методы получения и культивирования первых стадий развития модельного вида Triaenophorus nodulosus
1.2.2. Методы ультраструктурных исследований
1.2.2.1. Трансмиссионная электронная микроскопия 21
1.2.2.2. Сканирующая электронная микроскопия 22
1.2.3. Авторадиографические исследования 22
1.2.4. Световая микроскопия 25
ГЛАВА 2 . Морфофункциональная организация свободно- плавающей личинки - корацидия
2.1. История изучения 26
2.2. Корацидий Triaenophorus nodulosus
2.2.1. Покровы 29
2.2.2. Мускулатура, экстраклеточные матриксы, контакты
2.2.3. Малодифференцированные клетки 32
2.2.4. Железы проникновения 33
2.2.5. Нервная система 35
2.2.6. Экскреторная система 37
2.3. Заключение 40 з
Глава 3. Морфогенетические закономерности в процессе метаморфоза
3.1. История изучения 43
3.2. Процеркоид Triaenophorus nodulosus. Метаморфоз
3.2.1. Формирование покровов 44
3.2.2. Мускулатура 52
3.2.3. Ультраструктурная организация и клеточный состав
3.2.4. Становление паренхимной организации 58
3.2.5. Железы проникновения 66
3.2.6. Вторичная выделительная система 70
3.2.7. Нервная система 78
3.2.8. Сенсорные образования процеркоида 85
3.3. Заключение 88
ГЛАВА 4. Морфогенетические закономерности на заключительных этапах жизненного цикла
4.1. История изучения 95
4.2. Организация и морфогенез мужских копулятивных аппаратов
4.2.1. Triaenophorus nodulosus (Pseudophyllidea) 97
4.2.2. Proteocephalus torulosus, P. exiguus, Gangesia parasiluri (Proteocephalidea)
4.2.3. Nippotaenia mogurndae (Nippotaeniidea) 112
4.2.4. Microsomacanthus sp. (Cyclophyllidea) 117
4.2.5. Sobolevicanthus gracilis (Cyclophyllidea) 125
4.2.6. Lineolepis scutigera (Cyclophyllidea) 13 5
4.2.7. Monocercus arionis (Cyclophyllidea)
4.3. Закономерности иннервации половых протоков 144
4.4. Закономерности морфогенеза половых протоков 152
4.5. Заключение 156
ГЛАВА 5. Камбиальные клетки плоских червей 157
5.1 Камбиальные клетки цестод 15 7
5.1.1. История изучения 157
5.1.2. Популяция малодифференцированных элементов Triaenophorus nodulosus
5.2. Камбиальные клетки турбеллярий 166
5.3. Общие особенности и скрытые отличия камбиальных клеток у плоских червей
ГЛАВА 6. Закономерности морфогенезов и тканевая организация цестод
6.1. Морфогенетические механизмы на разных стадиях жизненного цикла
6.2. Тканевая организация цестод 182
6.3. Заключение 188
ГЛАВА 7. Морфофункциональные преобразования гладкой мускулатуры
7.1. История изучения 191
7.2. Мускулатура фиксаторных структур сколекса
7.2.1. Sobolevicanthus gracilis (Cyclophyllidea) 195
7.2.2. Nippotaenia mogurnda (Nippotaeniidea) 197
7.2.3. Lineolepis scutigera (Cyclophyllidea) 199
7.2.4. Gastrotaenia dogieli (Cyclophyllidea) 201
7.2.5. Заключение 202
7.3. Мускулатура мужского копулятивного аппарата 205
7.3.1. Sobolevicanthus gracilis (Cyclophyllidea) 205
7.3.2. Microsomacanthus sp. (Cyclophyllidea) 207
7.3.3. Proteocephalus exiguus (Proteocephalidea), Triaenophorus nodulosus (Pseudophyllidea)
7.3.4. Monocercus arionis (Cyclophyllidea) 210
7.3.5. Заключение 211
7.4. Основные направления морфологической 212
эволюции гистологических структур на основе
гладкой мускулатуры
ГЛАВА 8. Взаимоотношения маточного эпителия с развивающимися зародышами
8.1. История изучения 215
8.2. Плацентарные взаимоотношения у цестод
8.2.1. Clestobothrium acheilognathi (Pseudophyllidea)
8.2.2. Proteocephalus thymalli, P. torulosus (Proteocephalidea)
8.2.3. Nippotaenia mogurndae (Nippotaeniidea) 223
8.2.4. Microsomacanthus sp. (Cyclophyllidea) 224
8.3. Эволюционные тенденции развития матки у цестод
8.4. Заключение 230
ГЛАВА 9. Симбионтная микрофлора тегумента
9.1. История изучения 231
9.2. Симбионтная микрофлора Triaenophorus nodulosus
9.2.1. Соотношение бактерий и поверхностных микроструктур колонизируемых поверхностей
9.2.2. Микрофлора, ассоциированная с поверхностью покровов паразита
9.2.3. Микрофлора, ассоциированная с поверхностью кишечника щуки
9.3. Симбионтная микрофлора протеоцефалидных 245
цестод
9.3.1. Микрофлора, ассоциированная с поверхностью покровов паразита и кишечником хозяев-рыб
9.3.2. «Глубинная» микрофлора, ассоциированная с покровами цестод
9.4. Заключение 257
ГЛАВА 10. Тканевая пластичность, как морфологическая основа прогрессивной эволюции цестод
Заключение 274
Выводы 281
Литература
- Сбор паразитологического материала
- Корацидий Triaenophorus nodulosus
- Ультраструктурная организация и клеточный состав
- Lineolepis scutigera (Cyclophyllidea)
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение становления тканевой организации и возникновения в процессе эволюции истинных многоклеточных животных относится к фундаментальным проблемам современной зоологии. Разные таксоны, стоящие в основании филогенетического древа, демонстрируют различные уровни организации тканевых систем, сочетающих в себе примитивные и прогрессивные признаки. Возникновение многоклеточное, и тканевой организации у животных, по мнению А.А. Заварзина (1953), произошло при формировании пограничных тканей и внутренней среды, которая появляется вместе с пограничной тканью (поскольку только у многоклеточных организмов пограничность обеспечивается не клеточной мембраной, а совокупностью клеток, объединенных в пограничную тканевую структуру). Такая самая общая классификация позволяет сравнивать тканевую организацию у животных, стоящих на самых разных ступенях развития многоклеточное. Далее этапы становления тканевой организации подчинялись требованиям более узкой функциональной тканевой специализации, более устойчивой клеточной дифференциации и возникновения собственной камбиальное.
Наиболее изученными из низших многоклеточных в данном отношении являются губки, у которых, по мнению Г.П. Коротковой (1981) и А.В. Ересковского (2005), возникли и еще лишенные собственного камбия примитивные органы, и примитивные тканевые структуры, причем оба эти уровня надклеточной организации практически совпадают. Исследования тканевых систем у кишечнополостных были проведены на представителе сцифомедуз Aurelia aurita (Напара, 1995). У этих животных, первично лишенных мезодермы, из эпителиальных элементов возникает особая линия свободных клеток, способная к росту и самоподдержанию, которую автор рассматривает как самостоятельную тканевую систему, обладающую собственной камбиальностью и сопоставимую по уровню своей гистологической обособленности с системами клеток крови других многоклеточных (Напара, 1995). Плоские черви представляют собой очень пеструю и недостаточно изученную группу. Даже в пределах класса Turbellaria можно проследить значительные вариации: существует мнение, что бескишечные турбеллярии не обладают еще тканевой организацией, лишь их покровы начинают приобретать признаки эпителиальное (Богута, Миничев, 1976); в других исследованиях показано, что периферическая паренхима Acoela сочетает в себе топографически не разделенные, растущие и обновляющиеся клеточные популяции, т. е. появление различий по кинетическим характеристикам опережает пространственное оформление системы - эпителизацию гистологических структур (Дробышева, 1983). Среди турбеллярии типичная тканевая организация
рассматривается только у представителей Polycladida (Богута, Миничев, 1976; Дробышева, 1987). Исследования тканевой организации остальных плоских червей крайне фрагментарны, и существующие работы выполнены, в основном, на светооптическом уровне.
Цестоды, как объект исследования, привлекательны тем, что, с одной
стороны, находятся в основании филогенетического древа и отражают
один из~ ранних этапов формирования тканевой организации; с другой -
относятся к паренхимным животным, не обладающим циркуляторными
системами, и представляют особый путь интеграции многоклеточных
организмов. У цестод исследованы локализация и некоторые параметры
митотического цикла малодифференцированных клеток как единой
популяции (Wikgren, 1964, 1966; Wikgren, Gustafsson, 1967, 1971;
Gustaffson, 1973, 1976 a-c и др.), в то же время попыток проследить
судьбу отдельных субпопуляций малодифференцированных клеток и
исследовать характерные для них кинетические параметры предпринято
не было. Признание того факта, что морфогенезы эволюционируют и
основные их закономерности сложились на первых этапах становления
многоклеточности (Беклемишев, 1925; Миничев, 1982 и др.), приводит к
тому, что изучение морфогенезов плоских червей как животных,
находящихся в процессе становления тканевой организации, становится
необходимым условием для понимания филогенетических и
онтогенетических изменений морфогенезов высших Metazoa. Небольшое
количество и разнообразие клеточных элементов позволяют на
современном уровне проследить судьбу всех специализированных
систем во время метаморфоза, при переходе личинки цестод к
паразитизму. Существующих в настоящее время сведений о
морфогенетических закономерностях в процессах метаморфоза (Одгеп,
1961, 1962, 1968; Stunkard, 1962), а также в период формирования
репродуктивной системы (Sulgostovska, 1972, 1974, 1980; Галкин, 1979)
явно недостаточно, они проведены на светооптическом уровне и
преимущественно на представителях отряда Cyclophyllidea.
Стробилярный характер организации на завершающем этапе жизненного
цикла цестод позволяет в различных члениках одного и того же
животного поэтапно проследить морфогенетические изменения (на
примере формирования половой системы). Затем на основании
полученных данных появляется возможность выявить
формообразовательные механизмы и эволюцию этих механизмов в различных таксонах цестод. Обитание цестод в широком круге позвоночных и беспозвоночных хозяев, наличие многочисленных адаптации к паразитическому образу жизни, а также многообразие формообразовательных потенций, присущее низшим Metazoa, приводят к разнообразным морфофункциональным трансформациям примитивных тканей и позволяют исследовать эволюционные тенденции развития гистологических структур.
Цели и задачи исследования
Цель настоящей работы - установить характер и структурные особенности тканевой организации плоских червей на примере класса Cestoda.
В задачи работы входило;
Охарактеризовать прогрессивные и примитивные черты тканевой организации цестод и определить их гистологический статус.
У модельного вида на всех стадиях жизненного цикла установить клеточный состав и исследовать особенности тканевой организации, сделав основной акцент на изучении специфической ткани внутренней среды - паренхимы, проследить ее становление в онтогенезе и выяснить вопрос о существовании специализированных паренхимных элементов.
Изучить кинетические и ультраструктурные характеристики популяции камбиальных элементов.
Установить особенности и закономерности протекания морфогенетических процессов на разных стадиях жизненного цикла: во время метаморфоза, при переходе личинки к паразитическому образу жизни, и у взрослого паразита при формировании репродуктивной системы.
Исследовать тканевую пластичность на данном эволюционном уровне развития животных на примерах взаимоотношений: эпителий матки -развивающиеся зародыши; тегумент — симбионтная микрофлора; а также адаптационные изменения гладкой мускулатуры цестод в прикрепительных и копулятивных аппаратах.
Научная новизна
1. Работа представляет собой первое монографическое исследование
тканевой организации плоских червей на примере класса Cestoda.
Впервые охарактеризованы примитивные и", прогрессивные
гистологические признаки, проявляющиеся в структуре популяции
камбиальных элементов и закономерностях протекания
морфогенетических процессов. При изучении тканевой
полифункциональности продемонстрированы тенденции усложнения в процессе эволюции взаимоотношений маточного эпителия и развивающихся зародышей. Впервые для цестод описаны плацентоподобные структуры. 2. Исследована морфологическая основа и локализация процессов симбионтного пищеварения как пример адаптационной пластичности полифункционального тегумента цестод. Установлено, что симбионтную микрофлору, наряду с традиционными бактериями, составляют многочисленные наноформы. 3. Определены параметры митотического цикла для камбиальных элементов, формирующих различные отделы репродуктивной системы. Впервые установлено, что каждый отдел половой системы формируется особой популяцией малодифференцированных клеток, характеризующихся собственными параметрами митотического цикла. 4. На модельном виде
показано, что специализированные паренхимные элементы отсутствуют на всех стадиях жизненного цикла. Впервые для плоских червей изучены принципы формирования паренхимной организации, показано, что паренхима цестод как разновидность тканей внутренней среды формируется клеточными элементами другой гистологической принадлежности на основе явления метаплазии. 5. Впервые на ультраструктурном уровне рассмотрены процессы преобразования всех систем личинки в процессе метаморфоза. 6. Исследование формообразовательных закономерностей на различных стадиях жизненного цикла (у модельного вида) и у цестод из филогенетически отдаленных семейств позволило установить общие принципы, выявить тенденции усложнения и проиллюстрировать эволюцию морфогенезов соматических структур.
Основные положения, выносимые на защиту
Цестоды находятся на протканевом уровне развития, который является первичным состоянием для таксона, а не возник в результате вторичного упрощения, связанного с переходом к паразитическому образу жизни.
Цестоды лишены специализированной соединительной ткани, т.е. ткани внутренней среды, поскольку обладают очень бедно представленными межклеточными матриксами и не имеют специализированных паренхимных элементов. Паренхимная организация формируется на основе процесса метаплазии, когда мышечные, железистые и другие специализированные клеточные элементы берут на себя функции тканей внутренней среды, не утрачивая своих типовых особенностей.
В жизненном цикле цестод присутствует катастрофический метаморфоз, в ходе которого все провизорные системы онкосферы резорбируются и формируются у процеркоида de novo под руководством активно развивающейся на этой стадии нервной системы.
Морфогенезы цестод протекают по различным сценариям, либо по примитивному сборочному или клеточному, либо по более эволюционно продвинутому эпителиальному пути, то есть на данном этапе развития тканевых систем происходит эволюционное усложнение морфогенезов.
Богатые формообразовательные потенции и полифункциональность клеточных систем служат морфологической основой для прогрессивной эволюции цестод.
Теоретическая и практическая значимость
Работа выполнена в рамках плановых тем лаборатории экологической паразитологии ИБВВ РАН, грантов РФФИ (94-04-11550; 96-04-49080; 98-04-48465; 03-04-48271) и является частью проектов, направленных на изучение у цестод морфофункциональной организации различных органов и систем. Работа служит * первым систематическим исследованием тканевой организации и ' морфогенетических
закономерностей у плоских червей на примере класса Cestoda. Обобщение ультраструктурных и экспериментальных данных позволяет сформулировать основные признаки тканевой организации цестод и использовать их для адекватной характеристики других таксонов плоских червей. Полученный фактический материал может быть включен в учебники по зоологии и частной паразитологии.
Апробация работы
Результаты исследований были доложены на Всесоюзных, Всероссийских и международных конференциях «Систематика, таксономия и фауна паразитов», Москва, 1996 г.; II съезде паразитологического общества РАН «Экологический мониторинг паразитов», Санкт-Петербург, 1997 г.; на симпозиуме «Роль Российской гельминтологической школы в развитии паразитологии», Москва, 1997 г.; на конференции «Взаимоотношения паразита и хозяина», Москва,
г.; на юбилейном заседании в ГОСНИОРХ, Санкт-Петербург,
г.; VIII European Multicolloquium of Parasitology, Poznan, Poland, 2000; "Ecological Parasitology of the turn of Millenium", St.-Peterburg, 2000; на конференции «Паразиты рыб - современные аспекты изучения», Борок, 2003 г., на Сибирской зоологической конференции, Новосибирск, 2004 г., и на пятьдесят первых чтениях, посвященных памяти В.А. Догеля, ЗИН РАН, Санкт-Петербург, 2006 г.
Публикации Материалы диссертации отражены в 52 научных работах, в том числе в 29 статьях в центральных журналах, 5 из которых на английском языке.
Структура и объем работы Основной текст диссертации с иллюстрациями изложен на 320 страницах, состоит из введения, 10 глав, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 364 названия, из них 217 на иностранных языках. Иллюстрации составляют 3 таблицы, 25 схем и 174 электроннограммы.
Сбор паразитологического материала
Для выявления локализации клеток, находящихся в фазе синтеза ДНК и определения продолжительности митотического цикла или генерационного времени был использован метод импульсного мечения. Черви инкубировались в растворе Хэнкса, содержащем 200 кБк/мл Н-тимидина. При этом объекты после однократной инкубации в растворе меченого предшественника синтеза ДНК культивируются в соответствующих условиях, и через определенные промежутки времени отбираются пробы, что позволяет проследить за «разбавлением» зерен метки над ядрами малодифференцированных клеток, которое отражает процесс деления данных клеток.
При однократном мечении взрослых Т. nodulosus инкубация продолжалась в течение 2 часов при 4С, в темноте, после чего материал переносился в чистый раствор Хэнкса и последовательно фиксировался через 1 час, 1 и 2 суток.
После обезвоживания материал заливали в парафин. Срезы толщиной бмкм покрывались эмульсией типа М (НИИХИМФОТОПРОЕКТ), разбавленной 1:3. Время экспозиции составило 3 суток. Полученные автографы окрашивались гематоксилином. На каждый срок инкубации использовали по 3-4 паразита. Для плероцеркоидов было подсчитано разбавление метки, количество меченых ядер с 7 срезов на срок и распределение количества меченых ядер по зонам паренхимы: кортикальной, медуллярной и продольно-мышечному слою с 7 срезов на срок.
Разбавление метки, т.е. число зерен серебра, приходящееся на одну клетку, на разных сроках фиксации было посчитано по стандартным методикам. Результаты обрабатывались с использованием критерия Стьюдента для 5% уровня значимости (р 0.05) (Лакин, 1980). Поскольку для плероцеркоида не отмечены ритмические неравномерности роста, как, например, «линьки», характерные для процеркоида, продолжительность митотического цикла определяли по формуле для экспоненциально растущей популяции (Дондуа А., Дондуа Г., 1964), 0.301 Т = xt lg Ао - lg At где Т - среднее генерационное время; Ао- исходная интенсивность мечения; At- интенсивность мечения к моменту времени t. Метод насыщения
Для вычисления величины пролиферативного пула (Np), то есть количества клеток популяции, способных к митотическому делению, был использован метод насыщения меченым предшественником синтеза ДНК. Для этого паразитов неоднократно, через определенные промежутки времени, помещали в раствор 3Н-тимидина, чтобы все клетки, способные к митотическому делению, но находящиеся в разных фазах митотического цикла, на фазе синтеза ДНК (S) могли поглощать меченый предшественник. В результате последовательного вступления в фазу S все новых малодифференцированных элементов, фракция меченых клеток возрастает до тех пор, пока все элементы, способные синтезировать ДНК, не окажутся мечеными. В опыте по насыщению клеток использовали половозрелых Т. nodulosus, для которых повторные 4-х часовые инкубации в Н-тимидине (концентрация 5 цСи/мл) проводились через каждые 6 часов. Общее время опыта составило 55 часов. Во всех опытах использовали по 3-4 паразита, которых после завершения эксперимента фиксировали в жидкости Карнуа. На парафиновые срезы толщиной 6 мкм наносилась эмульсия типа М (НИИХИМФОТОПРОЕКТ), разбавление 1:4. Среднее время экспозиции составило 20-25 дней. После проявления амидоловым проявителем автографы окрашивались гемалаун-эозином. Подсчет меченых клеток и обработка результатов проводились по стандартным методикам.
Для идентификации различных специализированных систем паразитов, определения плоскости среза и локализации зачатков половой системы, перед электронно-микроскопическим исследованием просматривали полутонкие аралдитовые срезы на светооптическом уровне. Срезы, толщиной 1-2 мкм, окрашивали 1% метиленовым синим.
Для подготовки объектов к исследованию на светооптическом уровне материал после фиксации обезвоживали в спиртах повышающейся концентрации и хлороформе. Затем объекты помещали в смесь (1:1) хлороформ-парафин и выдерживали ночь при температуре 37С. В двух порциях чистого расплавленного парафина по 1 часу объекты пропитывали при 56С, после чего заливали в парафин с добавлением воска. Парафиновые блоки монтировали на деревянные блоки и резали на санном микротоме. Срезы клеили на предметные стекла белком, обеспарафинивали последовательно в ксилоле и спиртах, окрашивали эозин-азуром или гемалаун-эозином, заключали в бальзам под покровные стекла, после чего просматривали на световом микроскопе «Биолам».
Корацидий Triaenophorus nodulosus
Дегенерация первичного тегумента сопровождается, с одной стороны, процессом элиминации наружного цитоплазматического слоя (Рис. 5 д; 6 г), с другой стороны - слиянием с ним малодифференцированных клеток, мигрирующих из нижележащей паренхимы и встраивающихся в покровный синцитий (Рис. 5 е). Первоначально поверхность первичных покровов образует единичные выпячивания, которые впоследствии увеличиваются в размерах и отшнуровываются. В определенный период развития процеркоида, на 3-4 сутки после инвазии, процесс дегенерации первичных покровов настолько интенсифицируется, что личинка Triaenophorus nodulosus оказывается отграниченной от организма хозяина либо полуразрушенным наружным слоем тегумента, либо непосредственно базальной пластинкой (Рис. 5 д). Области, где в результате отслаивания и отшнуровки первичных покровов базальная пластинка контактирует с внешней средой, невелики по размерам. Процесс отслаивания наружной цитоплазмы первичных покровов происходит не одновременно, распространяясь от передней части процеркоида к заднему концу тела. Исследование смены покровов у спороцисты Fasciola hepatica, после проникновения мирацидия в брюхоногого моллюска, выявило сходные этапы с вышеописанным процессом у цестод (Southgate, 1970; Xylander, 1987; 1996).
Малодифференцированные клетки, встраивающиеся в синцитий первичного тегумента Triaenophorus nodulosus, постепенно замещают цитоны, участвовавшие в образовании первой генерации микроворсинок. Начавшиеся ранее аутофагические процессы в первичном тегументе, завершаются полным разрушением его цитонов. Малодифференцированные клетки дают начало вторичным (дефинитивным) покровам. Дифференциация покровов на данном этапе направлена на обеспечение эффективного поглощения питательных веществ. Интенсификации данного процесса способствуют сформированные в процессе преобразования покровов микроворсинки второй генерации, которые достигают в длину 0.74 ± 0.008 мкм, а в диаметре 0.076 ± 0.002 мкм, то есть их длина в 2-3 раза превышает таковую микроворсинок, покрывающих первичный тегумент (Рис. 5 ж; 6 д). При этом за счет микроворсинок происходит увеличение площади поверхности тела, например, у процеркоидов Khawia armeniaca в средних отделах в 8.71 раз, а в задних отделах тела в 14.45 раз (Поддубная, 1988).
Как было показано методами авторадиографии на световом уровне, рост и развитие тегумента у ленточных червей осуществляется за счет миграции в него малодифференцированных клеток из подлежащей паренхимы (по принципу внешнего камбия) (Wikgren, Knuts, 1970). У Triaenophorus nodulosus малодифференцированные клетки, формирующие вторичный синцитий тегумента, обусловливают смену структуры покровов. На этой стадии онтогенеза в цитонах Triaenophorus nodulosus содержится значительное количество свободных рибосом, а в ядрах наблюдаются крупные округлые ядрышки, что свидетельствует об активных процессах синтеза, протекающих в цитоплазме. Некоторое количество активных ядер, сформировавших синцитий вторичных покровов, мигрируют к базальной пластинке процеркоида, и по отросткам, соединяющим цитоны с наружным слоем, проникают в область тегумента, расположенную над базальной пластинкой. Впоследствии такие ядра с окружающим их тонким слоем цитоплазмы отшнуровываются и элиминируются (Рис. 5 з; 6 е). Личиночные покровы циклофиллидных цестод, в ответ на макрофагальную реакцию хозяев, помимо секреции веществ, обладающих защитными свойствами, формируют на поверхности мощный мукополисахаридный слой, изолирующий и, таким образом, предохраняющий начальные стадии развития личинок (Кашин, 1986). Вторичные покровы процеркоидов кариофиллидных цестод за счет удлинения апикальных концов микроворсинок в, так называемые, бичевидные отростки формируют тонкий фибриллярный слой (Поддубная, 1995). У процеркоида Triaenophorus nodulosus, представляющего псевдофиллидных цестод, подобные образования на поверхности тегумента обнаружены не были, что, по-видимому, объясняется сравнительно непродолжительным временем, необходимым для достижения паразитом инвазионности.
В дальнейшем микроворсинки второй генерации замещаются микротрихиями, которые формируются у представителей Pseudophyllidea и Cyclophyllidea, как на основе микроворсинок, так и субмембранно, в наружном цитоплазматическом слое (Braten, 1968; Тимофеев, Куперман, 1973; Lumsden et al., 1974; Richards, Arme, 1984; Куперман, 1988). В дальнейшем микротрихии - являющиеся уникальными поверхностными структурами -сохраняются на всех последующих стадиях онтогенеза цестод.
Таким образом, тегумент Triaenophorus nodulosus в процессе метаморфоза несет большую и разнообразную функциональную нагрузку, приоритеты в которой неоднократно меняются. Это находит отражение в конкретных особенностях тонкого строения, различающихся на каждом из этапов морфогенетической перестройки покровов. Функциональная нагрузка тегумента, в свою очередь, во многом определяется особенностями биологии процеркоидов, а также спецификой паразито-хозяинных отношений. Сложные морфофункциональные преобразования покровов, имеющие место в процессе метаморфоза, свидетельствуют о глубоких метаболических и иммунологических взаимодействиях в системе процеркоид Triaenophorns nodulosus - первые промежуточные хозяева. Очень сходные результаты были получены при исследовании тонкого строения покровов зрелых церкарий и развивающихся метацеркарий Diplostomum chromatophorum от момента проникновения в промежуточного хозяина до достижения ими инвазионного состояния. Были выявлены три четко выраженные стадии формирования покровов, характеризующиеся сменой поверхностных микроструктур, где первая стадия сопровождается интенсивной резорбцией большинства ценогенетических структур церкарий и перестройкой пищеварительной системы. На этом этапе формируется чрезвычайно плотный гликокаликс, в чем проявляется защитная реакция паразита на иммунное воздействие хозяина. Второй этап знаменуется усилением роли абсорбционной функции покровного эпителия, на поверхности которого появляется развитая система микроворсинок. Этот период сопровождается бурным ростом и морфогенезом метацеркарий. На третьем этапе покровы приобретают черты дефинитивной организации. Рост паразитов приостанавливается, а трофическая функция покровов вновь сменяется на защитную. Об этом свидетельствует исчезновение микроворсинок и наличие хорошо выраженного гликокаликса (Подвязная, 1999).
Ультраструктурная организация и клеточный состав
На 7-е сутки происходит дальнейшее формирование ствола и дифференциация нервных клеток. Нейроны, формирующие ствол, имеют более светлые вытянутые ядра, объем окружающей их цитоплазмы несколько увеличен, хотя отростки в большинстве случаев по-прежнему очень тонки. Тем не менее, отростки довольно отчетливо группируются в ствол, а тела нейронов остаются на периферии. Некоторые отростки, входящие в состав формирующегося ствола, содержат только электронноплотные гранулы диаметром 60-80 нм, более дифференцированные отростки включают, наряду с плотными, светлые везикулы. Часть отростков на этой стадии формирует синаптические контакты. На 8 сутки основные системы процеркоида уже сформированы. На поперечном срезе нервный ствол выглядит вполне компактно, располагаясь рядом с выделительным сосудом (Рис. 17 г). Имеются типичные синаптические контакты, в которых пресинаптическое окончание содержит светлые везикулы и электронноплотные гранулы, параллельные мембраны в области контакта зачернены, к постсинаптической мембране примыкает электронноплотный материал. В толще ствола нервные отростки образуют плотные контакты.
Таким образом, клеточный состав центральной нервной системы сколекса и основные морфологические образования (два церебральных ганглия, центральная комиссура и пара главных стволов) формируются на стадии процеркоида (Бисерова, 2004; Бисерова, Корнева, 2006). При формировании нервного ствола у Triaenophorus nodulosus отростки нейронов сразу занимают центральное положение. Синаптические контакты с участием светлых везикул впервые появляются в стволе на 5-6 сутки развития процеркоида, а на 8 сутки они встречаются уже довольно часто. Большинство нейронов на ранних стадиях униполярны, т. е. имеют только один нервный отросток. Они первыми достигают стадии полной дифференцировки, причем формирующиеся отростки ориентированы по направлению к заднему концу тела личинки, к крючьям.
Анализируя данные, касающиеся иннервации мышц на ранних стадиях развития Triaenophorus nodulosus, следует отметить следующее. У онкосферы наиболее типичны и многочисленны нейроны и отростки с электронно-плотными гранулами, образующие контакты с мышцами крючьев и отдельными волокнами вблизи покровов (тегумента). У процеркоида с первого дня заражения хозяина наблюдается интенсивное удлиннение отростков, связанных многочисленными синаптическими контактами с формирующейся субтегументальной мускулатурой и содержащих электронно-плотные гранулы. На стадии плероцеркоида в области сколекса становится заметным соответствие в расположении мышечных волокон субтегумента и нервных терминалей, в том числе содержащих электронно-плотные гранулы и образующих синаптические контакты. У половозрелых цестод огромное количество нервных отростков, содержащих электронно-плотные гранулы пронизывают мощно развитую мускулатуру крючьев и теменной области (Biserova et al., 1991; Бисерова, 1997; Бисерова, Корнева, 1999). Таким образом, по-видимому, периферическая нервная система появляется в онтогенезе Т. nodulosus первой, и иннервирует мышцы тела цестоды на всех стадиях развития, сохраняя один из ультраструктурных признаков - электронно-плотные гранулы диаметром от 50-70 нм до 120-140 нм.
К сожалению, данных о строении нервной системы процеркоидов для сравнительного анализа совершенно недостаточно. Известно, что у процеркоида Diphyllobothrium dendriticum на переднем конце тела, совместно с отростками фронтальных желез и мышечными клетками, расположена группа крупных нейронов размером 10-15мкм (Wikgren, 1986). Форма нейронов неправильная, ядра лопастные, цитоплазма содержит электронно-плотные везикулы диаметром 50-70нм. Кроме того, в заднем конце тела обнаружены нейроны второго типа. Они имеют меньшие размеры перикариона (6-8мкм) и содержат более крупные (150-200 нм) электронно 83 плотные везикулы и являются, по мнению автора, неиросекреторными
(Wikgren, 1986). Это соответствует данным, полученным нами для Т. nodulosus, у которого так же отмечено два типа нейронов с электронно-плотными гранулами разного диаметра.
Особую роль в концентрации центральной нервной системы играют глиальные оболочки, объединяющие отдельные нервные элементы в компактный орган с единой внутренней средой. У инвазионного процеркоида Triaenophorus nodulosus среди нервных пучков располагаются отростки клеток, формирующие стенки экскреторных каналов (Рис. 18 а-г), играющие роль глиаподобных элементов, однако полноценная глиальная оболочка центральной нервной системы отсутствует. Формирование нервной системы проходит с незначительным опережением, по отношению к выделительным каналам, что связано с отсутствием дегенерации первичных нейронов онкосферы, но в целом параллельно с формированием вторичной выделительной системы. К поверхности формирующегося экскреторного канала прилегают компактные скопления нервных отростков, соответствующие главным стволам, а цитоплазматические отростки клеток, формирующих стенки экскреторных каналов, часто обнаруживаются в толще нервных пучков. У процеркоида после 8-го дня развития нервный ствол расположен параллельно и в непосредственной близости от выделительного канала. Однако у процеркоида мы не наблюдали полноценной оболочки, окружающей нервные элементы развивающейся центральной нервной системы. Глиаподобная оболочка окончательно формируется на стадии раннего плероцеркоида. Кроме клеточных элементов в формировании оболочек центральной нервной системы цестод принимают участие фибриллы межклеточного матрикса (Бисерова, Сальникова, 2002; Бисерова, 2004; Бисерова, Корнева, 2006). Тесное взаимодействие нервной и выделительной систем, характерно также для взрослой стадии Triaenophorus nodulosus (Бисерова, 1997; 1997 а).
Lineolepis scutigera (Cyclophyllidea)
Семенники и семявыносящие канальцы. Стенки семенников в зрелых маточных проглоттидах лишены ядер и образованы тонким цитоплазматическим слоем, базальная и апикальная мембраны которого лишены каких-либо выростов и впячиваний. С наружной стороны стенку семенника окружает базальный матрикс, вблизи которого наблюдается концентрация межклеточных фибрилл.
У семявыносящих канальцев ядра локализуются в крупных наружных выпячиваниях эпителиального слоя, вместе с тем базальная мембрана образует многочисленные округлые цитоплазматические выросты. Внутренняя поверхность семявыносящего канальца помимо ламеллярных выростов несет реснички.
Семяпровод. Для семяпровода на внебурсальном и внутрибурсальном его участках характерны различные морфологические признаки. На внебурсальном участке стенки длинного извитого семяпровода образованы тонким синцитиальным эпителиальным слоем, немногочисленные ядра которого располагаются в толще эпителия. Внутренняя поверхность эпителия покрыта ламеллярными выростами и редкими ресничками. С базальной стороны эпителий семяпровода подостлан матриксом и отдельными волокнами кольцевых мышц (рис. 28 а). При входе в бурсу цирруса семяпровод расширяется и образует некрупный семенной пузырек, в стенке которого в гиалоплазме некоторых из ядер концентрируются расширенные цистерны ШЭПР. Мышечный слой, окружающий семенной пузырек, становится непрерывным, утолщается и прикрепляется к базальному матриксу многочисленными полудесмосомами, что обеспечивает способность к сокращению семенного пузырька и порционный выход половых продуктов. У эпителия внутрибурсального участка семяпровода (или так называемого семяизвергательного канала) появляются некоторые морфологические отличия. Ламеллы на внутренней поверхности семяизвергательного канала по мере приближения к дистальному концу укорачиваются и утолщаются, реснички исчезают. Увеличивается толщина слоя кольцевой мускулатуры и складчатость эпителиального слоя. Ядра локализуются в полости канала, соединяясь с эпителиальным слоем цитоплазматическими «мостиками». В дистальном отделе семяизвергательного канала был обнаружен рецептор, ресничка которого имеет короткий корешок и располагается в эпителиальной ямке. Апикальная поверхность сенсорного окончания связана с тегументом концевой десмосомои, замыкающей также пору тегумента, а тело рецептора имеет асимметричный вырост. Бурса цирруса. Небольшая бурса цирруса N. mogurndae снаружи ограничена несколькими слоями разнонаправленных мышечных волокон. Между семяизвергательным каналом и наружной мышечной стенкой бурсы цирруса располагаются слои тонких цитоплазматических отростков и некрупные одноклеточные предстательные железы. Цитоплазматические отростки, заполняющие бурсу цирруса, образованы мышечными клетками как кольцевой мускулатуры семяизвергательного канала, так и наружного мышечного слоя бурсы. Эти отростки не содержат миофибрилл и клеточных органоидов, в цитоплазме наблюдаются в основном элементы цитоскелета (рис. 28 б).
Клетки предстательных желез в бурсе цирруса зрелых проглоттид немногочисленны, в них не наблюдается интенсивных синтетических процессов и гипертрофированного развития ответственных за это клеточных органоидов. Отростки предстательных желез наполнены мелкими электронно-плотными секреторными гранулами разнообразной формы, выходы локализованы в дистальной части семяизвергательного канала. Морфогенез. У Nippotaenia mogurndae начальные этапы морфогенеза полового протока весьма сходны с процессом описанным выше для Proteocephalus torulosus. Процесс формирования половых протоков начинается с агрегации малодифференцированных клеток, в результате чего образуется однослойный многорядный плотный тяж (Рис. 27 а). Клетки демонстрируют высокий уровень синтетической активности. Аутофагические процессы в центральной части тяжа приводят к образованию полости (Рис. 27 б), одновременно слияние клеток тяжа формирует многоядерную синцитиальную стенку полового протока, вокруг которой появляются волокна базального матрикса. Из окружающей паренхимы мигрируют малодифференцированные клетки, впоследствии дифференцирующиеся в кольцевую мускулатуру протока и прикрепляющиеся к базальному матриксу полудесмосомами (Рис. 27 в). На апикальной мембране эпителиального слоя, ограничивающего половой проток, появляются цитоплазматические ламеллы, а в цитоплазме наблюдается формирование многочисленных везикул. Ядра выпячиваются над поверхностью эпителия, некоторые из них отшнуровываются и элиминируются (Рис. 27 в; 29 б, в). У Nippotaenia mogurndae элиминируются не все ядра, некоторые остаются на поверхности дефинитивного эпителия, соединяясь с ним тонкими цитоплазматическими выростами (Рис. 27 е; 29 г).
Параллельно процессу элиминации ядер завершается формирование сумки цирруса. Малодифференцированные клетки дифференцируются во внешние мышечные слои бурсы, отделяющие копулятивный аппарат от окружающей паренхимы. Толщу бурсы цирруса заполняют многочисленные уплощенные отростки мышечных клеток, расположенные между эпителием репродуктивного протока и внешним мышечным краем бурсы. На заключительном этапе дифференцировки у Nippotaenia mogurndae
