Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 8
1.1 Общая характеристика рода 8
1.1.1 Внешний вид 8
1.1.2 Систематическое положение вида 9
1.1.3 Распространение 10
1.1.4 Социальная структура и размножение 11
1.1.5 Пища и кормодобывательные стратегии 13
1.1.6 Численность 14
1.1.7 Адаптации 17
1.1.8 Филогеографическая структура вида 17
1.2 Природа и климат Командорских островов 19
1.2.1 Краткая физико-географическая характеристика Командорских островов 19
1.2.2 Климат Командорских островов 20
1.2.3 Растительный и животный мир островов 20
1.3 Командорские подвиды песца 21
1.3.1 Современные представления о систематическом положении Командорских подвидов песца .21
1.3.2 История командорских популяций песца 25
1.3.3 Экологические особенности островные командорских подвидов песцов 29
Невозможность миграции 29
Богатые кормовые ресурсы 30
Отсутствие хищничества и межвидовой конкуренции 30
Понуляционная структура 31
1.3.4 Генетические исследования командорских песцов и не выясненные/спорные вопросы 32
1.4 Митохондриальный геном позвоночных 33
1.5 Главный Комплекс Гистосовместимости 36
1.6 Генетические особенности островных популяций 40
Глава 2 Материалы и методы : 44
2.1 Полевые исследования и методы их обработки 44
2.1.1 Сбор материала 44
2.1.2 Качество выборки 45
2.1.3 Контроль за загрязнением 50
2.1.4 Выделение суммарной ДНК из мышц и кожи 50
2.1.5 Подбор праймеров для анализа контрольного региона мтДНК 52
2.1.6 Амплификация фрагмента контрольного региона мтДНК 53
2.1.7 Амплификацию фрагмента второго экзона гена главного комплекса гистосовместимости второго класса DRB1 53
2.1.8 Очистка ПЦР продуктов 53
Выделение из геля 53
Очистка ПЦР продукта с помощью щелочной фосфотазы и экзонуклезы 54
2.1.9 Определение первичной последовательности нуклеотидов ДНК 54
Очистка продуктов сиквенсной нолимеразной цепной реакции: 57
2.2 Статистическая обработка молекулярно-генетических данных 59
2.2.1 Выравнивание последовательностей 59
2.2.2 Выбор оптимальной эволюционной математической модели 60
2.2.3 Дифференциация популяций. 61
2.2.4 Скорректированная межгрушювая генетическая дистанция 61
2.2.5 Эффективная численность самок 61
2.2.6 Медианные сети гаплотипов 61
2.2.7 Построение деревьев 62
Глава 3 Исследование полиморфизма мтднк у командорских песцов 62
3.1 Сбор образцов 62
3.2 Качество выборки 62
3.3 Исследование контрольного региона мтДНК у командорских песцов 63
3.3.1 Гаплотипическое (h) и нуклеотидное (я) разнообразие последовательностей командорских песцов 66
Глава 4 Степень генетической изоляции командорских популяций песцов 74
Глава 5 Происхождение, история и время изоляции командорских песцов 77
5.1 Происхождение командорских популяций песцов
5.2 Определение времени изоляции командорских подвидов песцов 80
Глава 6 Анализ второго экзона гена drb1 в популяциях командорских песцов.. 84
6.1 Анализ полиморфизма второго экзона гена DRB1 в популяции песцов о. Медный 84
6.2 Анализ полиморфизма второго экзона гена DRB1 в популяции песцов о. Беринга 89
6.3 Трансспецифичный полиморфизм по генам МНС в семействе псовых 90
Выводы: і 94
Приложение 1 95
Благодарности
- Внешний вид
- Подбор праймеров для анализа контрольного региона мтДНК
- Исследование контрольного региона мтДНК у командорских песцов
- Определение времени изоляции командорских подвидов песцов
Введение к работе
Актуальності, темы. На всем ареале песца обычно выделяют 10 подвидов Ареалы шести подвидов не разделены непреодолимыми физическими преградами, что, благодаря зимним миграциям песцов, обеспечивает высокую степень панмиксии видовой популяции Только два подвида обитают в условиях полной островной изоляции, на Командорских островах на границе видового ареала, Alopex lagopus semenovi на о Медный и A I bermgensis на о Беринга Командорские популяции песцов привлекают интерес генетиков как объекты с рядом уникальных параметров Были изучены аллозимная изменчивость песцов о Беринга (Засыпкин, Засыпкина, 1998) и хромосомный карнотип песцов о Медный (Буланова, 2003) Островные изолированные популяции предоставляют идеальную возможность для изучения влияния островной изоляции на молекулярную эволюцию (Woolfit and Bromham, 2005) Как объект исследования командорские популяции имеют большую ценность для разработки фундаментальных проблем популяционной экологии, популяционного моделирования и генетики
Целый ряд авторов отмечал, что по ряду поведенческих и морфологических признаков командорские подвиды песцов заметно отличаются друг от друга и от материковых подвидов На основании этих различий высказывалось предположение о полной изолированности популяций, доказать такую изолированность можно только посредством генетического анализа Предпринятая попытка оценить степень островной изоляции Командорских популяций песцов (Giffen et al, 2007) была проведена на крайне малых выборках, а полученные в работе результаты противоречат ряду биологических и исторических фактов
Отсутствие единого мнения о статусе командорских популяций песцов, их уникальности и степени изоляции, а так же о генетическом состоянии популяций послужило предпосылкой для проведения данной работы
Цепи н задачи исследования Цель данной работы изучить генетический полиморфизм в популяциях песцов командорских островов по нейтральным и селективно значимым маркерам (контрольному региону мтДНК и ГКГ -DRB1) и оценить современное состояние подвидов Для достижения цели были поставлены следующие задачи
Изучить полиморфизм контрольного региона мтДНК песцов популяций о Беринга и о Медный,
Провести сравнение контрольного региона мтДНК с аналогичными данными о материковых песцах
Оценить степень островной изоляции командорских подвидов песца
Определить происхождение и время наступления изоляции популяций
Оценить полиморфизм гена ГКГ —DRB1 в популяциях о Медный и о Беринга
Научная новизна С помощью молекулярно-генетических методов проведено сравнение командорских популяций песцов между собой и с материковыми популяциями Исследованы степень островной изоляции, а так же предпринята попытка выяснить, происхождение популяций командорских островов и время островной изоляции Получена подробная характеристика контрольного региона мтДНК (основного маркера при изучении внутривидового полиморфизма), которая показала уникальность гаплотипов командорских песцов Полученные результаты показывают, что командорские песцы формируют отдельную, генетически обособленную от других популяций группу В данной работе впервые приведены результаты исследования полиморфизма одного из наиболее полиморфных ядерных маркеров - гена DRB1 главного комплекса гистосовместимости
(ГКГ) Показано отсутствие полиморфизма по второму экзону гена DRB1, отвечающего за иммунный ответ на чужеродные антигены В работе заложены основы для дальнейшего углубленного анализа генов главного комплекса гистосовместимости в командорских популяциях песцов
Теоретическое значение. Полученные данные крайне важны для понимания влияния изоляции на судьбу островных популяций Появляется редкая возможность изучения и установления связи между островной изоляцией и генетическими характеристиками естественных популяций диких животных
Практическая значимость полученных результатов Обнаруженный в популяции песцов о Медный мономорфизм по нейтральным и селективно значимым маркерам подтверждает необходимость принятия мер по охране и постоянному мониторингу за состоянием популяции
Апробация работы Основные результаты диссертации доложены на Студенческой конференции по Охране Природы (Student Conference on Conservation Science, Cambridge, UK, 2001), на международной конференции «Териофауна России и сопредельных территорий» (Москва, 2003), на VII международной научной конференции «Сохранение биоразнообразия Камчатки и прилегающих морей» (Петропавловск-Камчатский, 2006), на VIII международной научной конференции «Сохранение биоразнообразия Камчатки и прилегающих морей» (Петропавловск-Камчатский, 2006), на 87е" ежегодной встрече Американской Ассоциации Маммологов (87th annual meeting of American Society of Mammalogists - Albuquerque, New Mexico, USA, 2007), на 6041 Международном Симпозиуме по физиологии, поведению и охране диких животных (6th International Zoo and Wildlife Research Conference on Behaviour, Physiology and Genetics, Berlin, Germany, 2007), на Международная научная конференция «Молекулярно-генетические основы сохранения биоразнообразия млекопитающих Голарктики» (Черноголовка, 2007)
Публикации По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 в рецензируемых журналах из списка ВАК
Структура и объем диссертации Материал диссертации изложен на 120 страницах, включая 12 таблиц и 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав обсуждения результатов, выводов, приложения и списка литературы Список цитированной литературы содержит 178 публикации (в тч 38 отечественных и 140 зарубежных публикаций)
Влагодариости Работа была выполнена при финансовой поддержке Камчатского института экологии и природопользования ДВО РАН, г Петропавловск-Камчатский И была бы невозможна без участия Александра Михайловича Бурдина Я признательна всем, кто помогал мне на разных этапах этой работы Прежде всего, хочу выразить огромную благодарность моим научным руководителям Александру Александровичу Колесникову и Михаилу Ефимовичу Гольцману за научное руководство, терпение, внимание и помощь в работе Хочу выразить глубокую благодарность моему рецензенту Анне Андреевне Банниковой Я признательна всем членам экспедиции Биологического ф-та МГУ на Командорские острова, помогавшим мне в сборе материала Сергею Николаевичу Сергееву, Ольге Александровне Филатовой, Илье Александровичу Володину, Сергею Владимировичу Загребельному, Ольге Александровне Мочаловой Я благодарна коллегам по лабораториям Юлии Владимировне Малеевой, Екатерине Андреевне Бессолицыной, Алексею Валерьевичу Федякову, Татьяне Михайловне Кулинич, Наталье Юрьевне Воробьевой, Елену Кудинову за атмосферу выручки и взаимопонимания Я признательна Дарье Александровне Чудаковой, Анне Ивановне Плошнице, Павлу Александровичу Сорокину, Марине Владимировне Холодовой, Николаю Александровичу Формозову, принимавших участие в обсуждении полученных результатов Отдельно я хочу поблагодарить моих родителей, мужа и дочь Григория и Аглаю Цидулко за помощь, терпение и поддержку
Внешний вид
В период размножения песцы строго территориальны, нора используется только одной семьей. Пары могут не распадаться и сохранять семейный участок более 5 лет. Обычно семьи живут отдельно, однако могут селиться и колониями по 2—3 семьи (Овсяников, 1993). Площадь участка обитания семьи песцов- колеблется от 2 до 125км2. Площадь участка обитания существенно больше на внутренних территориях, где основу рациона составляют грызуны 15-36км2 (Angerbjorn et al., 1997). В прибрежных районах она существенно меньше: в Исландии 9-19км2 (Hersteinsson and Macdonald, 1982), в Гренландии 10-14км2 (Birks and Penford, 1990), на Аляске 5-21км2 (Eberhardt et al., 1982); на Шпицбергене 10-125км2 (Frafjord and; Prestrud , 1992). На о. Медный участки вытянуты вдоль береговой полосы и протяженность их 1-2 км (Гольцман и др., 2003). Значительную часть года песец проводит, кочуя.впоисках пищи. Ко времени размножения песцы возвращаются в те местности, откуда откочевывали осенью—зимой, и либо занимают готовые норы, либо выкапывают новые.
Течка происходит в марте—апреле, беременность длится 49—57 дней. Традиционно плодовитость песца считается самой высокой среди хищных млекопитающих (Чиркова, 1967; Tannerfeldt-, Angerbjorn, 1998). Средние размеры выводков меняются в широком диапазоне от 2.8 на Крысьем о-ве (Алеутские о-ва) (Berns, 1969) до 9.6 на о-ве Врангеля (Овсяников с соавт., 1991; Овсяников, 1993) и 11.2 - в Норвегии (Frafjord and Prestrud, 1992). Размеры выводков, в районах с полевками и леммингами, значительно больше, чем в береговых районах (в среднем 9.2 щенка и - 5.9, соответственно) (Frafjord 1993). Размер- выводка. определяется доступностью кормовых ресурсов и степенью их предсказуемости (Tannerfeldt, Angerbjorn, 1998). Самец вместе с самкой заботится о потомстве. Белые песцы рождаются покрытые темным, дымчато—бурым мехом, голубые — почти коричневые. Щенки открывают глаза на 9—18 день. С трех недельного возраста основу рациона щенков составляет в основном мясо. В 8-10 недельном возрасте щенки начинают покидать нору и активно осваивают родительский участок, а самки-помощники в этот период обычно уходят из семьи (Hersteinsson and Macdonald, 1982). В возрасте полугода щенки достигают размера родителей: Размножаться могут уже на следующий год, хотя полного развития достигают лишь»на второй год.
Песец всеяден; в его рацион вида входит 125 видов, животных и 25 видов растений (Audet et al, 2002), однако рацион отдельных особей сильно зависит от места обитания. По типу местообитания, и как следствие, пищевым предпочтениям и выделяют два экотипа (Dalen et al., 2002) песцов - "лемминговые" и "береговые".
"Лемминговые" песцы, обитающие в континентальной тундре, целиком зависят от колоний леммингов- (Lemmus spp. и Dicrostonyx spp.), которые- являются их основной пищей и летом и в течение зимы (Macpherson, 1969; Angerbjorn et al., 1999). Всего от 5% до 10% их летнего рациона, составляют другие кормовые объекты:, куропатки {Lagopus mutus), мигрирующие болотные птицы, пищевые отбросы на мусорных свалках, ягоды. (Eberhardt et al., 1982). Отмечены нападения песцов на детенышей северных оленей . {Rangifer tarandus) (Kaikusalo and Angerbjorn 1995; Prestrad, 1992; Elmhagen et al, 2000) и ягнят (Hersteinsson, 1996). Зимой рацион таких песцов, кроме леммингов, включает летние запасы (Chesemore, 1975), попавших в капканы зверей; падаль, также белых куропаток и гусеш {Lagopus spp.) (Sovada- et al., 2001). От обилия и доступносиглеммингов, зависит численность, распределение, оседлость и другие особенности экологии "лемминговых" песцов (Гептнер, Наумов,. 1967). Каждые три-четыре года численность леммингов резко сокращается вследствие неблагоприятных погодных условий, недостатка пищи, стресса, пресса хищников или комбинации этих факторов: В-результате песцы лишаются своего основного корма, что приводит к сокращению их численности на обширных пространствах.
"Береговые" песцы, обитают вдоль побережья и питаются в основном выбросами моря: как выброшенной на берег, так и добытой рыбой,-морскими беспозвоночными, останками морских млекопитающих, водорослями: Разнообразие и относительная стабильность кормовых ресурсов?делают кормовые стратегии этих песцов более универсальными (Hersteinsson and Macdonald, 1996). Представители этого экотипа нередко охотятся на птичьих базарах; на лежбищах ластоногих поедают последы и павших животных, иногда охотятся на новорожденных детенышей (Наумов-и др.«, 1981). В зимний период они»часто сопровождают белых медведей; поедая останки убитых ими морских млекопитающих (Гептнер; Наумов; 1967; Paetkau et al., 1999). Разница, между периодически. меняющимся пищевым ресурсом, таким, как лемминги и более стабильными морскими выбросами обусловила разные жизненные стратегии экотипов. (Dalen et ai, 2005): "Лемминговые" песцы в пик численности леммингов успешно переживают зиму и весной приступают к размножению. При, этом они выводят гораздо больше щенков,, чем в обычные годы (Tannerfeldt & Angerbjbrn, 1998). В" течение одного года численность популяции может вырасти в десятки, а иногда и в сотни раз, достигая своего максимума следующей зимой. Такой репродуктивный взрыв совершенно не типичен для "береговых" песцов.
Подбор праймеров для анализа контрольного региона мтДНК
Митохондриальная ДНК позвоночных представляет собой небольшую кольцевую молекулу размером 15-20kb (Вооге, 1999). мтДНК располагается по всему матриксу митохондрий и содержит всего 37 генов, кодирующих две рРНК (12S и 16S рРНК), 22 тРНК, 13 полипептидов и» некодирующую контрольную область, содержащую, сайты инициации транскрипции обеих цепешмтДНК и сайт инициации репликации Н-цепи (Anderson, 1991). Для митохондриального генома млекопитающих характерна» компактность и отсутствие интронов; что видимо, является наследием прокариотической организации генома. Межгенные участки отсутствуют или. крайне малы, на их долю у млекопитающих приходится всего 67 н.п. Исключение составляет главная некодирующая область или контрольный регион.
Для митохондриальной ДНК характерен ряд уникальных биологических свойств: быстрый темп мутирования и как следствие высокий уровень изменчивости, огромное количество копий в каждой клетке, материнский характер наследования и отсутствие рекомбинации (Wilson, 1985; Avise, 1994). Митохондриальная ДНК изменяется со скоростью 0,5-2% за 1 миллион лет, что всреднем в 10-15раз быстрее, чем скорость изменений в ядерных генах с аналогичными функциями (Neckelmann et al., 1987; Wallace et al., 1997). Высокая скорость накопления мутаций в мтДНК связана с тем, что ДНК-полимераза, участвующая в репликации мтДНК обладает меньшей точностью, чем соответствующая ДНК полимераза ядра, а в митохондриях отсутствуют эффективные системы.репарации ДНК. В связи с активными окислительно-восстановительными процессами, в митохондриях постоянно присутствуют в достаточно высоких концентрациях свободные радикалы, что может приводить к модификации нуклеотидных оснований и в итоге к нуклеотидным заменам при последующих репликациях. Асинхронный тип репликации также может быть причиной высокой мутабильности. Скорость эволюции1 каждого митохондриального гена зависит от таких факторов, как функциональная значимость генного продукта и его нуклеотидный состав (Avise, 1994). Наибольшая1 скорость мутаций обнаружена в контрольном регионе. Размеры контрольного региона отличаются у разных групп позвоночных животных (Вооге, 1999). У млекопитающих длина контрольного региона около 1200 п.н., что составляет примерно 7% протяженности всей молекулы мтДНК. Однако на этом участке сосредоточенно более 20% полиморфных позиций всей мтДНК (Horai et al., 1995). Это связано с тем, что значительная часть, последовательности контрольного региона доступна для нейтральных мутаций (точечных мутаций, делеций, тандемных повторов) (Hoelzel et al, 1994). Скорость изменения в нём В 5 раз выше, чем в остальных фрагментах мтДНК (Birky et al., 1983; 1989). Пр№ этом, центральный участок контрольного региона эволюционирует гораздо медленнее, чем крайние участки. Поэтому его используют для решения задач систематики, а гипервариабельные участи, расположенные по краям - для детального анализа популяционной структуры вида (Arctander et ah, 1996). Так как митохондрии наследуются через цитоплазму яйцеклетки, то мтДНК передаётся только по материнской линии (Giles et al., 1980). Материнский характер наследования мтДНК неоднократно подвергался сомнению. Существуют цитологические данные, свидетельствующие о том, что в.некоторых случаях в яйцеклетку при оплодотворении попадают митохондрии сперматозоида. Эксперименты, проведенные на эмбрионах мышей, показали, что на начальных стадиях развития зародыша в клетках могут быть обнаружены молекулы мтДНК отцовского типа. Однако на более поздних стадиях отцовские митохондрии элиминируются (Cummins 2000; Kaneda et al., 1995). В. настоящее время нет достоверных данных, свидетельствующих в пользу отцовского или» смешанного типа наследования мтДНК у других млекопитающих.
С материнским типом наследования мтДНК связано и отсутствие выявляемой рекомбинации. Очевидно, что если- в организм потомства попадают митохондрии только одного родителя, все молекулы- в них идентичны. Вопрос о наличии рекомбинации! в, митохондриях тоже явился предметом ожесточенных дискуссий. Отсутствие рекомбинации ставилось под сомнение, из-за высокого уровня изменчивости мтДНК. Параллельные мутации в- разных линиях мтДНК, интерпретировались как результат рекомбинации (Elson et al., 2001; Kivisild and Villems, 2000; Macaulay et al., 1999). Также отсутствие рекомбинации ставилось, под сомнение, из-за выделения ферментативных комплексов, способных катализировать рекомбинацию in vitro (Awadalla et al., 1999; Hagelberg et al., 1999). Поскольку однозначных доказательств рекомбинации мтДНК не выявлено, считается; что ее наследование носит клональный характер. И вся мтДНК рассматривается как один локус.
Исследование контрольного региона мтДНК у командорских песцов
Нуклеотидное разнообразие последовательностей (я) составило для берингийских песцов 0.003 (S.D.= 0.002) при анализе 610 н.п. и 0.005 (S.D.= 0.003) при анализе 292 н.п., в то время как для материковых песцов эта величина составила 0,009 (Dalen et al., 2005). Полученные данные подтверждают, что, по сравнению с материковыми, для островных изолированных популяций характерно снижение генетического разнообразия (Frankham , 1997). Так для сравнения, у других представителей псовых нуклеотидное разнообразие последовательностей (я) составило: у серых волков {Canis lupus) 0.0260 (Vila et al., 1999), у койотов (Canis latrans) 0.0460, у диких африканских собак {Lucaon pictus) 0.0145 (Girman et al., 2001). Почти все представители псовых прошли в последнее время через уменьшение численности и фрагментацию ареала, так что значения нуклеотидного разнообразия для них в целом ниже, чем для представителей других семейств.
У песцов о. Беринга было обнаружено семь гаплотипов контрольного региона. мтДНК, у песцов о. Медный - только один гаплотип (табл. 7; рис.6). Эти данные практически отражают историю популяций. Долгое время численность песцов обеих популяций была-стабильно высокой, несмотря на островную изоляцию и активное промысловое использование. Однако, в результате эпизоотии 70-80х годов XX века произошло резкое снижение численности медновских песцов до нескольких десятков особей (Наумов и др., 1981; Овсяников и др., 1981; Гольцман-и др; 2003; Goltsman et ah, 1996), а популяция о. Беринга лишь незначительно сократила свою исходную численность. Очевидно, что общее снижение численности могло сопровождаться и утратой гаплотипов на о. Медный.
Известно, что долговременное выживание изолированных популяций сильно зависит от площади обитания (Сулей, 1983; Франклин, 1983) поскольку уровень генетического разнообразия может кореллировать с размерами острова - чем меньше остров, тем ниже уровень полиморфизма. Подобная взаимосвязь, продемонстрирована в работах, проведенных на островных популяциях австралийских кустарниковых крыс (Hinten et ah, 2003) и калифорнийских островных лис (Wayne et al., 1991). Таким образом, так как площадь о. Беринга почти на порядок превышает площадь о. Медный (1667 и 186 км , соответственно) (см. рис.11), можно предположить, что еще до эпизоотии генетическое разнообразие в популяции песцов о. Медный было значительно меньше, нежели на о. Беринга. Косвенным доказательством этого, может служить больший морфологический полиморфизм среди берингийских песцов. Так, только на о. Беринга редко, но встречались белые песцы, местного происхождения (Ильина, 1950). Не исключено, что популяция песцов о. Медный и до эпизоотии конца XX века была мономорфной по контрольному региону мтДНК. Однако более правдоподобным нам представляется утрата генетического разнообразия в результате резкого снижения численности. Косвенным доказательством этого может служить то, что после эпизоотии численность популяции так и не восстановилась (Гольцман и др., 2003) и уже не менее 14 лет составляет 60-90 взрослых особей, то есть, приблизительно, 10-15% от исходной численности. Известно, что при увеличении гомозиготности на 10% общая репродуктивная способность популяции может снизиться на 25% (Франклин, 1983). Вполне возможно, что медновская популяция находится в состоянии инбредной депрессии. Рис. 11. Командорские острова. Черными точками отмечены места взятия проб. Диаграммы соответствуют частоте встречаемости гаплотипов
В недавно опубликованной работе Гиффена с соавторами (Geffen et ah, 2007) были представлены результаты анализа первого гипервариабельного фрагмента контрольного региона мтДНК Командорских песцов. Образцы для этой работы были предоставлены М.Е. Гольцманом в 1994 году. Для четырех песцов с о. Беринга было выявлено 2 гаплотипа, а для семи песцов с о. Медный - 3 гаплотипа. К сожалению, авторы статьи не приводят номера последовательностей контрольного региона для командорских песцов в генетической базе данных GenBank, однако д-р Гиффен, любезно предоставил нам последовательности трех, полученых им, медновских гаплотипов, когда статья еще не была принята к публикации. Один гаплотип идентичен, выявленному нами, а предоставленные последовательности двух других гаплотипов содержали нуклеотидные замены в позициях, константных у 60 командорских песцов (наши данные) и 191 континентального песца (данные взяты из генетической базы данных GenBank; 29 последовательностей от 191 песца). Кроме этого, выявленные замены находились в непосредственной близости от мест неуверенного определения последовательности нуклеотидов (см. рис.12 а, б.)
Выравнивание последовательностей командорских и континентальных песцов. Альтернативные гаплотипы песцов о. Медный выявленные Гиффеном: MdiDl и MdiD2. Стрелками отмечены нуклеотидные замены в позициях константных у всех других песцов Так же д-р Гиффен подтвердил наше предположение, что выявленные дополнительные гаплотипы мтДНК у медновских песцов встречались в единичном экземпляре, т.е. пять из семи проанализированных образцов являются носителями гаплотипа, идентичного выявленному нами (Med).
К сожалению, мы не знаем, строился? анализ (Geffen et al., 2007) на основании предоставленных нам последовательностей, или в работе были использованы более точные последовательности (без неопределенных нуклеотидов), отсутствие последовательностей в генетической базе данных не позволяют нам об этом судить. Исходя из предоставленных нам д-ром Гиффеном данных, мы полагаем, что выявленные им- новые гаплотипы являются артефактом. В пользу нашего предположения свидетельствует и тот факт, что популяция-о. Медного демонстрирует крайне низкий уровень генетического полиморфизма по результатам микросателлитного анализа (Geffen et ah, 2007) самый-низкий уровень из всех исследованных популяций (см, табл. 8).
Определение времени изоляции командорских подвидов песцов
Мономорфизм, выявленный у находящихся на грани исчезновения островных популяций псовых (медновских песцов и островных калифорнийских лис), видимо, связан с тем, что островные популяции характеризуются более низким уровнем генетического разнообразия, чем материковые (Frankham, 1997). Как уже говорилось ранее, уровень генетического разнообразия может кореллировать с размерами острова - чем меньше остров,-..тем ниже уровень полиморфизма; (HintemefaL, 2003). Так, у калифорнийских островных лис обитающих: на; крупных островах,, выявлен высокий! уровень полиморфизма: А популяция лис с маленького и наиболее поздно- колонизированного острова: Єаю Николас демонстрирует отсутствие изменчивости по целому ряду нейтральных генетических; маркерові (Gilbert et al:,. 1990;: Goldsteim et aL, І999; Roemer et aL, 2001a, 2002). днако эта; зависимость, не: всегда срабатывает в отношении генов FKT. Так, против ожидания мономорфными по гену DRB1 оказались песщж с большого: островаСанТСлементе, полиморфные по целому ряду» нейтральных маркеровл (Gilbert: etaU 1990; Goldsteins? aL, 1999;: Roemer et aL 2001,2002). А лисы; обитающиенасамоммаленьком острове СанЬїиколасе, продемонстрировали высокий уровень гетерозиготносте иаллельного разнообразия: (Aguilar et aL, 2004);что весьманеожиданноеще шпотому, чтоша островах, с которых.шло заселение СанНиколаса - Сан?Мигеле щСан;Клементе (см; рис. 16) лисы:по гену DRBT мономорфны..
Авторы, объясняют такот результат тем;, что? ot Сан Николас колонизировался несколько раз, что; однако, не;отразилось5вшыявленном там единственном уникальном гаплотипе мтДНК. Также авторы выдвигают предположение, что последующий генетический дрейф- в предковых популяциях с островов Сан Мигель и Сан Клементе привел к утрате там альтернативных аллелей. Однако один из самых компетентных популяционных генетиков, занимающихся- исследованием комплекса гистосовместимости в природных популяциях, Hedrick (2004) подвергает сомнению и полученный результат и сделанные из него выводы.
Выявленный у медновских песцов мономорфизм может быть как причиной, так и следствием эпизоотии. Но более вероятно, что истина где-то посередине. Вероятно,.что объединенное воздействие островной изоляции, дрейфа генов и жесткого селективного отбора по качеству меха в период островного звероводства, могло привести к значительному снижению генетического разнообразия. Первые тревожные симптомы появились еще в 1930-е годы, когда зоотехники Командорского зверосовхоза отмечали, что "медновский песец...окончательно потерял свою былую пышность и.чистоту окраса...основное стадо - это "...мелкие, куцые, без признаков.настоящей ости, не песцы, а выродки" (Ильина, 1950). В малых изолированных популяциях, при небольших различиях по приспособленности между генотипами, дрейф генов приобретает решающее значение.. Менее адаптивный аллель-может зафиксироваться в популяции, а более адаптивный. утрачен. Чем, меньше численность популяции, тем сильнее изменяет частоту аллеля даже случайная гибель особей. В этой связи необходимо отметить, что на о. Медный добыча в первоначальный период проводилась, без каких либо ограничений, а в период островногозвероводствазначительно-возросла - изымалось до половины популяции (Ильина, 1950; Загребельный 2002). Вероятно, эпизоотия 70-80х годов XX века возникла уже на фоне низкого полиморфизма по генам ГКГ.
Полученные результаты указывают на то,, что у Медновской популяции песцов отсутствует резерв,изменчивости по второму экзону гена DRB1. Проведенные нами исследования свидетельствуют о наличии в популяции инбредной депрессии и показали отсутствие полиморфизма по одному из самых вариабельных генов ГКГ. 6.2 Анализ полиморфизма второго экзона гена DRB1 в популяции песцов о. Беринга
Были проанализированы 5 образцов от песцов с о. Беринга и один континентальный песец с полуострова Гыдан. Для всех образцов были получены консенсусные (полученные в результате согласования данных по обеим цепям) нуклеотидные последовательности второго экзона гена DRB1 размером 207 нуклеотидных пар. Все исследованные образцы оказались гетерозиготами, что подтверждалось наложениями пиков на сиквенсе (см. рис. 17). Количество гетерозиготных позиций на аллель варьировало от 2 до 17, что не позволяет выявить индивидуальные аллели без дальнейшего клонирования. Для выделения аллелей необходимо клонировать образцы и сиквенировать минимум 5 клонов для получения достоверных результатов (Murray etal, 1995). Считается, что при сиквенировании 5 клонов существует небольшая вероятность (Р = 0, 0625) не выявить все аллели в гетерозиготе, при условии, что каждая аллель амплифицируется с равной частотой (Murray et al, 1995). Такая работа является темой отдельного исследования и не входит в рамки нашей работы.
Гетерозиготные позиции в последовательности второго экзона гена DRB1 отмечены стрелками. Замена цитозина на аденин обозначена как М, тимина на гуанин - К, цитозина на гуанин - S. Однако уже на основании этих данных мы можем судить о том, что полиморфизме популяции песцов о. Беринга по гену DRB1 гораздо выше, чем в популяции о. Медный.
Наличие сходных ГКГ аллелей у представителей разных видов родственных таксонов характерно для многих организмов (Edwards & Hedrick, 1998). Клейн (Klein, 1986) назвал этот феномен трансспецифичным полиморфизмом. Трансспецифичный полиморфизм по генам МНС выявлен и у псовых (Hedrick et al. 2000а). При анализе ГКГ, выяснилось, что все характерные для койотов аллели перемешаны, на филогенетическом древе, с аллелями волков и собак, а некоторые аллели оказались общими для представителей разных видов (Hedrick et al., 2002). Что бы оценить положение единственного выявленного у песцов аллеля гена DRB1, было проведено сравнение 50 последовательностей гена DRB1 от разных представителей псовых (см. табл. 3. в главе материалы и методы) (см. рис. 18).
