Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 8
1.1. Эмбриональное развитие крупного рогатого скота 8
1.2. Причины эмбриональной смертности у крупного рогатого скота 13
1.3. Работы по предотвращению эмбриональной смертности крупного рогатого скота 26
II. Собственные исследования 30
2.1. Цель и задачи исследований 30
2.2. Материал и методика 31
2.2.1. Место иматериапы исследований 31
2.2.2. Изучение влияния биологически активных веществ на профилактику ранней эмбриональной смертности 44 у крупного рогатого скота 44
III. Результаты собственных исследований 47
3.1. Влияние лютеостабила на уровень эмбриональной смертности у коров 47
3.2. Влияние эмбриостабила на уровень эмбриональной смертности у коров 52
3.3. Производственные испытания эмбриостабила для повышения результативности осеменения у коров 58
3.4. Динамика содержания прогестерона и эстрадиола в крови коров в ранние сроки стельности до и после введения эмбриостабила 60
3.5. Экономическая эффективность снижения ранней эмбриональной смертности укоров 71
IV. Обсуждение результатов собственных исследований 73
Выводы 82
Практические предложения 83
Список литературы 84
- Эмбриональное развитие крупного рогатого скота
- Место иматериапы исследований
- Влияние эмбриостабила на уровень эмбриональной смертности у коров
- Динамика содержания прогестерона и эстрадиола в крови коров в ранние сроки стельности до и после введения эмбриостабила
Эмбриональное развитие крупного рогатого скота
Способность к воспроизведению зависит от нормального течения целого ряда процессов: гаметогенеза, оплодотворения, пренатального и постна-тального развития.
Оплодотворение представляет сложный комплекс физиологических процессов и реакций, в результате которых из гаплоидных гамет - мужской и женской, образуется новый организм, имеющий диплоидную генетическую структуру (29). Изучению процесса оплодотворения у млекопитающих посвящены работы и исследования многих ученых (1, 8, 26, 27, 43а, 65, 82,126, 133). Академик В.К. Милованов и профессор И.И. Соколовская в своих исследованиях (8, 27) установили последовательность событий, происходящих при оплодотворении разных видов сельскохозяйственных животных; и выяснили условия, необходимые для его осуществления.
В процессе оплодотворения различают четыре последовательных этапа. Во время первого происходит рассеивание клеток фолликулярного эпителия яйценосного бугорка и разрыхление лучистого венца. На втором этапе сперматозоиды проникают через прозрачную оболочку яйцеклетки, происходят контактные взаимодействия яйцеклетки и сперматозоида. По данным многочисленных исследований, сущность ее заключается в выделении ферментов, способствующих проникновению сперматозоида внутрь яйца (10, 26, 48, 82, 154). Яйцеклетка очень быстро реагирует на вхождение сперматозоида, и изменения, происходящие с ней, заключаются в активации внутриклеточных процессов, возобновлении второго мейотического деления и выделении направительного тельца. Начинается движение кортикальных гранул к поверхности ооцита, разрыв их, и выделение кортикального вещества с образованием оболочки оплодотворения. В исследованиях in vitro (133) было установлено, что при оплодотворении создается блок полиспермии, и нарушениє этого процесса приводит к различным отклонениям в эмбриональном развитии.
Наиболее важным и значимым, по мнению авторов, этапом в оплодотворении является третий, который заключается в проникновении сперматозоида в цитоплазму клетки. В яйцеклетку попадает мужской пронуклеус и одна из цен триолей. На четвертом же этапе наблюдается слияние пронукле-уса яйцеклетки, и пронуклеусом сперматозоида и происходит образование диплоидной зиготы. Было установлено, что при оплодотворении большое значение имеют взаимодействия гамет: гиногамонов и андрогамонов.
В исследованиях И.И. Соколовской (43а), К.Г. Газаряна, Л.В. Белоусо-ва (10), X. Густавсона (116), Т. Линареса (149) установлено, что первое деление дробления у крупного рогатого скота происходит в течение 48 часов после оплодотворения. Через 72 часа в яйцеводах коров можно обнаружить уже восьмиклеточный зародыш, на 4-й день - 12-ти клеточный (60, 96, 99, 103, 150, 116). В процессе дробления восстанавливается ядерно-плазменное отношение, характерное для клеток данного вида животного. Для дробления характерна особая структура клеточного цикла, в которой отсутствует фаза G2. Однако, при изучении процесса дробления у млекопитающих было выявлено, что у зародышей этого типа фаза G2 сохраняется, а геном, в отличие от других видов животных, начинает функционировать очень рано - уже на 2-4-клеточной стадии развития (31, 95, 96, 150). Эта особенность развития млекопитающих связана с ограниченным запасом питательных веществ в ооци-те.
Дальнейшие деления зиготы приводят к образованию многоклеточной морулы. На 5- и 6-й дни развития зародыш крупного рогатого скота насчитывает от 50-60 до сотен клеток (60,149,150,165). К 6-7 дню после оплодотворения начинается дифференцировка клеточной массы эмбриона: образуется трофобласт и внутренняя зародышевая масса. Эмбрион превращается в бластоцисту, имеющую полость, или бластоцель. К 9- и 10-му дню развития бластоциста освобождается от прозрачной оболочки, с этого момента начинается ее интенсивное удлинение (82, 96, 104, 165, 167). Скорость дробления и роста зародыша видоспецифичны и, по данным исследований, имеют большое значение для сохранения жизнеспособности зародыша (71, 116, 126, 179).
После выхода бластоцисты из прозрачной оболочки ее контакт с маточной средой становится очень тесным. Связь зародыша с материнским организмом у млекопитающих животных осуществляется на первых этапах в процессе имплантации. В результате проведенных исследований было установлено, что у крупного рогатого скота имплантация начинается с 11-14 дня развития эмбриона (44, 46, 48,183). У всех видов животных наиболее ранним признаком имплантации бластоцисты является увеличение сосудистой проницаемости эндометрия матки в месте нахождения зародыша (60, 183). Отмечено, что у коров этот процесс носит поверхностный характер (119).
Эмбриональный период развития млекопитающих животных сопровождается образованием сложного комплекса структурных образований, обеспечивающих тесное взаимодействие материнского организма и зародыша.
У всех видов млекопитающих, в том числе и у крупного рогатого скота, сохранение беременности связано с взаимодействием эндокринных систем матери и эмбриона (4, 5, 9, 27, 28а, 33, 43а, 44, 54, 58, 61,183).
Как показывают данные исследований, в процессе оплодотворения яйцеклетки и развитии зародыша основная роль принадлежит гонадотропным гормонам, выделяемым гипофизом, и стероидным гормонам (3, 21а, 36, 98, 99,118,122).
Место иматериапы исследований
Экспериментальная часть работы была проведена в период с 1999 по 2002 годы. Общая схема исследований представлена на рис.2.
Научно-производственные исследования были проведены на молочных фермах и комплексах племенных хозяйств в условиях АОЗТ «Щапово» Подольского района, АОЗТ «Малино» и ГПЗ «Большое Алексеевское» Ступинского района Московской области, а также в ГПЗ к-за им. Фрунзе Белгородской области. Для опытов были отобраны клинически здоровые животные по принципу аналогов по породе, возрасту, живой массе, состоянию репродуктивной функции с учетом интервала от отела до начала опытов. Продолжительность периода бесплодия была установлена по данным зоотехнического учета. Контроль за общим состоянием поголовья во время проведения исследований осуществляется по методикам, принятым в современной клинической диагностике.
В ходе исследований нами учитывались следующие показатели: сроки формирования групп, даты обработки исследуемыми препаратами, количество перегулов и даты осеменений, огоюдотворяемость от осеменения в первый и последующий половые циклы, индекс осеменения, сервис-период, кратность осеменения, процент оплодотворяемости, влияние молочной продуктивности на воспроизводительную функцию коров.
Животных осеменяли ректоцервикальным методом одно- и двукратно глубокозамороженным семенем в гранулах и соломинках.
Определение эффективности используемых препаратов определяли по методикам лаборатории эндокринологии ВИЖа. Концентрацию прогестерона и эстрадиола в крови исследуемых животных в первые дни после осеменения определяли иммуноферментным методом (ЦНМВЛ, 2001). Лабораторные исследования проводили в отделе биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных и эндокринологии ВГНИИЖа, ГУ Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Департамента ветеринарии МСХ РФ.
Опыты по изучению влияния лютеостабила проводили на 122 коровах. В опытах по применению эмбриостабила была использована 471 корова. Эффективность воздействий исследуемых препаратов определяли по срокам восстановления половой цикличности и наличия трехмесячной стельности. Статистическую обработку данных проводили по Е.К. Меркурьевой (1983). 1) Колхоз им. Фрунзе Белгородской области. Исследования проводились на коровах черно-пестрой породы в возрасте 3-7 лет, с живой массой от 550 до 600 кг и удоем за 305 дней лактации 5000 - 5360 кг молока (2001г.). Во всех исследованиях было использовано 245 голов крупного рогатого скота. В колхозе им Фрунзе (комплекс «Бессоновка») коровы содержатся при беспривязном содержании на щелевых полях с напольным хранением навоза. Опыты проводились в пастбищный и зимне-стойловый периоды с января 2000 года по июль 2002 года. Колхоз организован в 1931 году. Расположен в Юго-Западной части Белгородской области. Центральная усадьба его находится в селе Бессоновка в 32 км от районного и областного центра г. Белгорода и в 7 км от железнодорожной станции Долбино. Дорожная сеть на территории хозяйства развита в достаточной мере. Связь с административными центрами, пунктами сдачи с.-х. продукции и базами снабжения осуществляется по асфальтовым дорогам местного и федерального значения. Среднегодовая температура находится в пределах 6-7 градусов выше нуля, средняя температура в январе - минус 8С, в июле - плюс 20С. Среднегодовое количество осадков 500-510 мм. Выпадение осадков зачастую носит ливневой характер. Интенсивные засухи и суховейные явления отмечаются в 2-3 года из десяти. Почвы представлены типичными и выщелоченными черноземами. В целом почвенно-климатические условия хозяйства способствуют получению высоких и относительно стабильных урожаев основных сельскохозяйственных культур. Среднесуточные рационы кормления коров представлены в табл. 1. 2) ГПЗ «Большое Алексеевское» Ступинского района Московской области. Исследования проводились на коровах черно-пестрой породы в возрасте 3-7 лет, с живой массой от 550 до 600 кг и удоем за 305 дней лактации 4383 кг молока (2001г.). Во всех исследованиях нами было использовано 151 голов крупного рогатого скота. Опыты проводились в пастбищный и зимне-стойловый периоды с ноября 2000 года по февраль 2002 года. ГПЗ «Большое Алексеевское» основан в 1918 г., расположен в Ступинском районе Московской области, в 45 км от районного центра г. Ступино и в 100 км от г. Москвы. Дорожная сеть на территории хозяйства развита в достаточной мере. Связь с административными центрами, пунктами сдачи сельскохозяйственной продукции и базами снабжения осуществляется по асфальтовым дорогам местного и федерального значения. Средняя температура в январе - минус НС, в июле - плюс 17С. Среднегодовое количество осадков 600-650 мм. Опыты проводились в пастбищный и зимне-стойловый периоды с ноября 2000 года по февраль 2002 года. Маточное поголовье крупного рогатого скота размещено в четырехрядных типовых коровниках, каждый на 400 коров. Молодняк крупного рогатого скота размещается в непригодных для выращивания племенного молодняка помещениях. На молочных фермах механизированы наиболее трудоемкие процессы производства: доение, поение, уборка навоза, охлаждение молока, раздача сочных кормов. Среднесуточные рационы кормления коров представлены в таблице 2. 3) АОЗТ «Щапово», ферма «Батыбино» Подольского района Московской области. Исследования проводились на коровах черно-пестрой породы в возрасте 3-7 лет, с живой массой от 550 до 600 кг и удоем за 305 дней лактации 5000 - 5360 кг молока (2001г.). Во всех исследованиях нами было использовано 70 голов крупного рогатого скота.
Влияние эмбриостабила на уровень эмбриональной смертности у коров
Биогенные стимуляторы, или «вещества сопротивления», при введении в организм интенсифицируют обмен веществ, усиливают регенеративные свойства тканей, стимулируют ферментативные процессы и фагоцитоз, повышают биологический тонус и иммунную реактивность организма (Т.А. Мороз, 1990; A.M. Чомаев, 1997 и др.).
В разное время многие исследователи применяли различные тканевые препараты с целью снижения эмбриональной смертности (СЕ. Торосян, 1961; Ю.Г. Казаев, 1984; Б.А. Тимофеев, 1987; Н.М. Решетникова, Т.А. Мороз, 1990; и др.). Препараты использовались в постимплантационный период. Однако воздействие иммуностимуляторов на эмбрион в ранний период его развития, т.е. до имплантации, не изучено.
Целью нашей работы было установить влияние эмбриостабила на результативность осеменения при внутримышечном его введении в разные сроки, начиная с 1-го по 7-й день после осеменения. Исследования проведены на ферме «Батыбино» агрофирмы «Щапово» и АОЗТ «Малино» Московской области на коровах черно-пестрой породы с удоем более 5000 кг молока при привязном содержании. Коров осеменяли двукратно ректоцервикальным способом, стельность определяли ректальными исследованиями через 60 дней после осеменения.
Эмбриостабил вводили внутримышечно на 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- и 7-й дни после осеменения в дозе 5 мл на корову. Затем обработанных животных разделили на три группы. В первую группу были отобраны животные, которым эмбриостабил вводили на 1-, 2-, 3- и 4-й дни после осеменения; во вторую включили коров, обработанных данным препаратом на 5-, 6- и 7-й дни после осеменения. Контрольную группу составляли животные, которым вводили по 5 мл тривита. Полученные результаты в двух хозяйствах приведены в табл. 6 и 7.
Как показано в табл.6, результат введения эмбриостабила коровам фермы «Батыбино» АОЗТ «Щапово» был более эффективным, чем при обработке тривитом коров контрольной группы. Так, применение эмбриостабила на 1-, 2-, 3- и 4-й дни после осеменения повысило результативность осеменения на 19,5% (Р 0,1), а продолжительность сервис-периода уменьшило на 14 дней по сравнению с контролем. Применение же эмбриостабила на 5-, 6- и 7-й дни после осеменения повысило результативность стельности на 25% (Р 0.1), а продолжительность сервис-периода сократило на 22 дня по сравнению с контролем.
Аналогичные данные представлены и в табл. 7. Результат введения коровам фермы АОЗТ «Малино» эмбриостабила оказался более эффективным, чем при обработке тривитом коров контрольной группы. Так, применение эмбриостабила на 1-, 2-, 3- и 4-й дни после осеменения повысило результативность осеменения на 10%, продолжительность сервис-периода уменьшило на 34 дня по сравнению с контролем. Применение же эмбриостабила на 5-, 6- и 7-й дни после осеменения увеличило результативность осеменения на 23% (Р 0,1), при этом продолжительность сервис-периода уменьшилась на 32 дня по сравнению с контролем.
Из данных, приведенных в табл. 6 и 7 видно, что введение коровам эмбриостабила на ранних стадиях развития эмбриона позволяет значительно увеличить количество стельных животных благодаря снижению эмбриональной смертности. Причем самые лучшие результаты получены в группах, где эмбриостабил вводился на 5-, 6- и 7-й дни после осеменения. В этих исследованиях проанализировано воздействие эмбриостабила на сохранность эмбрионов в разные дни после осеменения (рис. 5 и 6).
Как показано на рис.5, результативность осеменения у животных, обработанных эмбриостабилом в 1-й день после осеменения, была на 11,7% выше, чем в контроле, во 2-й день - на 31,7%. Результаты при обработке эмбриостабилом на 3-й день были на 1,7% ниже, чем в контроле. Вместе с тем, начиная с 4-го дня, данные стали увеличиваться относительно данных контрольной группы. Так, с 4-го дня они уже на 20,6% выше, чем в контроле. Пик подъема приходился на 5-й день - на 40% (Р 0,05) больше по сравнению с контролем. На 6-й день результативность резко снизилась, и разница с контролем составляла только 13%. На 7-й день введения эмбриостабила показатели результативности осеменения увеличились на 31,7% по сравнению с животными контрольной группы.
Анализируя данные рис.6 мы видим, что оплодотворяемость при обработке в 1-й день после осеменения была на одном уровне с контролем; при обработке на 2-й день, показатели улучшились на 38% (Р 0,1) по сравнению с контролем. Показатели обработки эмбриостабилом на 3-й день после осеменения дали отрицательные результаты, т.е. оказались меньше на 4% по сравнению с контрольной группой. В дальнейшем, начиная с 4-го дня, разница в показателях результативности осеменения опытной и контрольной групп поднялась на 14%. При обработке препаратом на 5-й день после осеменения результативность стельности возросла на 27%, на 6-й день - всего на 6%. Самые лучшие результаты были получены при введении эмбриостабила на 7-й день после осеменения и составляли разницу в 40% (Р 0,05) по сравнению с животными контрольной группы.
Динамика содержания прогестерона и эстрадиола в крови коров в ранние сроки стельности до и после введения эмбриостабила
Уже на протяжении многих десятилетий во всем мире ведутся обширные исследования, направленные на предотвращение эмбриональной смертности у крупного рогатого скота с применением иммуностимулирующих и гормональных препаратов.
Разработанные в последние 10-15 лет методы и способы предотвращения эмбриональной смертности направлены главным образом на сохранение плода в постимплантационный период.
Все методы, разработанные для снижения процента гибели эмбрионов, показывают хорошие результаты. По нашим же наблюдениям, очень мало внимания уделяется ранним срокам беременности, а именно промежутку времени от осеменения до имплантации, хотя известно, что наибольший процент (70-80%) эмбриональной смертности приходится на период с 1-ого по 16-й дни после оплодотворения. Одним из перспективных направлений для повышения воспроизводства и увеличения стельности от первого осеменения является использование биогенных препаратов.
В последние годы намечается тенденция к снижению результативности получения стельности от первого осеменения. В некоторых случаях результативность снижается до 25-30%. Итогом служит возрастание числа спермо-доз на одну положительную стельность. Еще 10-20 лет назад эта проблема не считалась существенной, из-за довольно низких цен на одну спермодозу. Но в настоящее время в экономике страны произошли значительные изменения, и большинство молочных комплексов, племенных заводов и ферм находится на самоокупаемости. Кроме того, стоимость спермодоз значительно поднялась в цене, что существенно сказывается на затратах. А, учитывая тот факт, что для искусственного осеменения все чаще используется сперма элитных животных и подбор быков-производителей осуществляется на основе рекомендаций генетиков, стоимость спермодозы может быть весьма значительной. В данной ситуации остро назрела необходимость в разработках и исследованиях резкого сокращения числа спермодоз на плодотворное осеменение за счет увеличения результативности от первого осеменения.
Многочисленные экспериментальные данные различных исследователей показывают, что при искусственном осеменении оплодотворяемость достигает 98%. Однако на практике фактическая оплодотворяемость составляет 30-45% - остальные оплодотворенные клетки гибнут, прежде всего, на ранних стадиях развития.
По данным И.И. Соколовской, разница между истинной и фактической оплодотворяемостью обусловливается пренатальной гибелью зародышей. Эмбриональная смертность может приобретать катастрофическую величину и достигать 50%. В результате сводится на нет вся работа техников по искусственному осеменению, а в некоторых случаях, может служить одной из причин отказа специалистов от этого метода.
В последнее время ведутся масштабные исследования по разработке методов для снижения эмбриональной смертности.
В нашем литературном обзоре перечислено множество факторов, влияющих на эмбриональную смертность, но на наш взгляд основными из них, влияющими на жизнеспособность эмбриона, являются эндокринологический и иммунологический.
Основная причина попадания зародыша в неадекватные условия для своего развития в яйцеводах - неправильное время осеменения, которое очень сложно контролировать и которое бывает индивидуальным у каждого животного. Учитывая это, мы выдвинули гипотезу о влиянии эндокринологических факторов на раннюю выживаемость зародышей. В этом заключается новизна изучаемой проблемы.
Интерес представляет тот факт, что в отдельные дни после осеменения происходит существенное изменение соотношения концентрации прогестерона к концентрациям эстрогенов. Так, в день осеменения это соотношение составляет 71:1, к 5-ому дню оно достигает 400:1, 6 - 484:1, к 7-ому - 605:1, а к 11 дню 1014:1, т.е. происходит абсолютное и относительное увеличение количества в крови прогестерона при относительной стабильности концентраций эстрогенов (100а, 174а).
Не отрицая решающего значения этих гормонов на ранние этапы развития зародыша, необходимо обратить внимание на роль других эндокринных факторов, в частности, на такие жизненно важные соединения как про-стагландины. Сейчас уже ясно, что матка и желтое тело беременности содержат простагландиновые рецепторы. Это, прежде всего, белковые структуры, которые проявляют высокую селективность и являются медиаторами в процессах активирующих синтез простагландинов.
Считается, что существует потенциальная возможность влиять на физиологические процессы путем воздействия на рецепторы, а значит, можно сказать, что это направление в исследованиях весьма перспективно.
Представляет интерес и тот факт, что различные простагландины, например, ШТ сси ПГЕза воспринимаются одними и теми же рецепторами -это открывает большие перспективы на воздействие не только одного про-стагландина, а возможно, и целой группы простагландинов путем активации или, напротив, блокировки рецепторов.
По данным исследователей, имеется прямая связь между стероидами и образованием рецепторов к простагландинам. Например, эстрадиол стимулирует образование рецепторов к окситоцину, который в свою очередь взаимодействуя с вновь образовавшимися рецепторами, способствует выделению простагландинов из матки. Имеются литературные данные о лютеотропном действии простагландинов (155).
