Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Малые молекулы (р53, PUMA, Mdm2, р21) - ключевые участники патогенеза ревматоидного артрита (обзор литературы)... 10
1.1. Роль апоптоза в патогенезе ревматоидного артрита 10
1.2. Механизмы реализации антипролиферативных эффектов р53 белка... 11 1.3 PUMA молекула: альтернативный путь апоптоза
1.4. Mdm 2 молекула: основной антагонист р53- белка 18
1.5. р21 белок: феномен старения вместо апоптоза 22
Глава II. Материалы и методы 26
2.1. Клиническая характеристика больных 26
2.2. Методы лабораторного и инструментального исследования 30
Глава III. Результаты и обсуждения 35
3.1. Топохимия про- и антиапоптотических факторов в клетках костного мозга при ревматоидном артрите 35
3.2. Состояние факторов апоптоза в синовиоцитах при ревматоидном артрите 47
Заключение 62
Выводы 84
Практические рекомендации 86
Литература
- Механизмы реализации антипролиферативных эффектов р53 белка... 11 1.3 PUMA молекула: альтернативный путь апоптоза
- Mdm 2 молекула: основной антагонист р53- белка
- Методы лабораторного и инструментального исследования
- Состояние факторов апоптоза в синовиоцитах при ревматоидном артрите
Механизмы реализации антипролиферативных эффектов р53 белка... 11 1.3 PUMA молекула: альтернативный путь апоптоза
Роль р53 молекулы в регуляции метаболизма клетки и ответе на его изменения - область новейших и перспективных исследований. Известно, что р53 белок может быть активирован отклонениями в метаболизме (например голоданием) - ответ, опосредуемый АМФ-активированной протеинкиназой (AMP-activated protein kinase, АМРК), которая является ключевым компонентом клеточного ответа на биоэнергетический стресс [63]. Р53 протеин вызывает экспрессию ряда генов (включая ген АМРК), тормозящих активность киназы mTOR (mammalian target of rapamycin), центрального узла в контроле синтеза белка [30; 49].
Роль р-53 молекулы в развитии клеточных реакций на голодание и метаболический стресс проявляется в способности р53 регулировать феномен аутофагии, мембраноопосредованное «самопоедание» клетки, процесс лизосомального переваривания внутриклеточных компонентов. Аутофагия в условиях голодания способствует очищению от поврежденных органелл и других белковых субстанций, обеспечивая тем самым кратковременное выживание здоровых клеток.
Способность р53 инициировать аутофагию посредством активации лизосомальных белков, таких как DRAM (damage-regulated autophagy modulator) [42] или через репрессию белка mTOR находится в логической связи с антипролиферативной функцией аутофагии [70].
Однако взаимоотношения между р53 и аутофагией, очевидно, являются более сложными. Было показано, что базальный уровень р53 в цитоплазме обладает способностью ингибировать аутофагию [86]. Такими же сложными являются взаимоотношения между аутофагией и злокачественным ростом: показано, что р53 индуцированная аутофагия может, как тормозить рост опухоли, так и способствовать ему [19]. Каким образом определяется и координируется тип ответа на р53 индуцированную аутофагию - остается неизвестным.
Признание роли р53 в регуляции гликолиза, оксидативного стресса и процесса выживания клеток приводит к пониманию всей сложности сигнальных путей, связанных с этой молекулой. Адекватная регуляция функции р53 сопровождается антипролиферативными эффектами. В случае неадекватной регуляции р53 молекула может способствовать злокачественному росту [43]. Хотя позиция р53 в канцерогенезе довольно четко очерчена, роль ее в развитии иммунопатологических и воспалительных процессов остается весьма туманной. Изучение роли р53 в механизмах развития артритов первоначально ограничивалось определением его мутаций, что, как считалось, приводило к потере свойств р53 [50; 97]. Однако некоторыми авторами была отмечена повышенная склонность синовиоцитов к инвазивному росту при угнетении активности нормального р53 [72]. Восстановление локальной экспрессии р53 с помощью аденовирусной доставки последнего в воспаленные суставы кроликов сопровождалось регрессией воспаления СО [99]. Хотя причины повреждения молекулы р53 в клетках СО остаются неизвестными, понятно, что следствием этого является склонность синовиальной ткани к гиперпластическому росту с повышенной инвазивностью. Эта гипотеза была подтверждена в одном исследовании на модели коллаген-индуцированного артрита у мышей с отсутствием р53 молекулы, что ассоциировалось с большей тяжестью артрита, высокой гиперпластичностью синовии и падением активности апоптоза [98]. Было показано, что ненарушенная экспрессия р53 на локальном и системном уровне способствует снижению тяжести антиген-индуцированного артрита, тогда как потеря функций р53 ведет к увеличению тяжести и выраженности воспаления [67; 68]. При этом авторами было отмечено, что р53 влияет на точность иммунного ответа, благодаря воздействию на антиген-специфическую Т-клеточную активацию и модуляции освобождения цитокинов.
Таким образом, ключевая роль р53 в развитии апоптоза и его участие в патогенезе аутоиммунных артритов несомненны. Вместе с тем, то, что апоптоз не является единственным феноменом в арсенале р53 молекулы, стало очевидным с открытием белка PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis).
PUMA молекула: альтернативный путь апоптоза PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis) относится к семейству Bcl-2 белка, эволюционно стабильной ключевой группе регуляторов апоптоза [100]. PUMA - единственный ВНЗ (Bcl-2 homology domain 3) протеин, кодируемый геном, который является мишенью р53 и необходим для высвобождения цитоплазматического р53 от связи с антиапоптотическим белком Bcl-XL с последующей активацией митохондриальной мембраны, т.е. инициирующий митохондриальный путь апоптоза [36].
Необходимость PUMA для развития апоптоза в ответ на активацию р53 молекулы во многих тканях была подтверждена рядом экспериментальных работ [34; 100; 104]. Эффекты, наблюдаемые в отношении апоптоза у мышей отрицательных по PUMA белку (PUMA -/-) были схожи с таковыми у мышей отрицательных по р53 белку (р-53 -/-), подразумевая эффекторную функцию PUMA в р53-опосредованном апоптозе [100]. Анализ результатов ряда исследований, посвященных PUMA-опосредованному апоптозу, позволяет сделать вывод, что степень экспрессии PUMA и взаимодействие с белком р53 определяется видоспецифичностью клетки, состоянием р53 молекулы и видом стимулирующего фактора [100]. Например, при облучении мышей гамма-излучением повышенная экспрессия PUMA белка, индуцированная р53-зависимым апоптозом, была обнаружена в различных клетках и тканях, таких как эмбриональные фибробласты, нейроны, тимоциты, клетки гемопоэза, селезенки и кишечных ворсинках [61]. Факторы, изменяющие окислительно-восстановительный гомеостаз в клетках, например гипоксия, аноксия, оксидативный стресс и активные формы кислорода, способны стимулировать экспрессию PUMA как in vitro, так и in vivo. Так, гипоксия приводила к повышенной экспрессии PUMA и р53 молекул у мышей в клетках почек, кардиомиоцитах, нервных клетках и клетках толстого кишечника [101].
Mdm 2 молекула: основной антагонист р53- белка
Мазки клеток красного костного мозга изготавливали сразу после взятия пункции, подсушивали при комнатной температуре в течении 10 минут, фиксировали при комнатной температуре в 4% параформальдигиде на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4 (ФБ) в течение 5 минут. После чего препараты промывали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБС) рН 7,4 три раза по 10 минут и хранили при температуре 4С.
Для приготовления замороженных срезов ткани синовиальной оболочки образцы фиксировали в 4% параформальдигиде на ФБ в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем трехкратно промывали в трех сменах ФБС (по ЗО минут в каждой) и помещали материал в криопротектор - 15% раствор сахарозы на ФБС на 24 часа. После чего образцы ткани помещал в среду Neg 50 (Thermo Scientific, USA), замораживали на замораживающем столике при температуре -45" С и готовили срезы толщиной 10-15 мкм на криостате Криостат НМ 560 Cryo-Star (Thermo Scientific, USA).
Иммуногистохимическое исследование образцов костного мозга и синовиальной оболочки выполнялось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук.
В образцах красного костного мозга и синовиальной оболочки с использованием непрямого иммуноцитохимического окрашивания изучали экспрессию малых молекул р53, PUMA, р21 и Mdm2.
Замороженные срезы синовиальной оболочка коленного сустава окрашивались по сходной методике.
Подготовка материала для обработки антителами включала в себя несколько этапов. Замороженные срезы синовиальной оболочка коленного сустава и мазки клеток красного костного мозга дофиксировали метанолом и демаскировали антиген обработкой микроволнами в 0,1 М цитратном буфере (рН 6,0) в течение 20 минут. После охлаждения до комнатной температуры препараты промывали дистиллированной водой 3 раза по 5 минут. Затем материал промывали в ФБС, и обрабатывали 0,1% Тритоном Х-100 на ФБС в течение 30 мин. Для блокировки неспецифического связывания антител материал обрабатывали 1 час в растворе 10% бычьего сывороточного альбумина (БСА) на ФБС. После чего проводили инкубацию с первичными антителами в течение 24 часов при 4 С. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела мыши к белкам р53 и р21 в рабочей концентрации - 1:100, а также поликлональные кроличьи антитела к белкам PUMA и Mdm2 в рабочей концентрации 1:50 приготовленные на 10% БСА в ФБС. Для контроля неспецифического связывания вторичных антител использовали препараты инкубированные в 10% БСА на ФБС, время инкубации составляло 24 часа при при 4 С. Затем как "контрольные" так и "опытные" препараты промывали в ФБС, три раза по 10 минут. После чего их обрабатывали 1,5 часа вторичными антивидовыми антителами (против иммуноглобулинов мыши и кролика) меченными флуоресцентной меткой Alexa 488 в рабочем разведении 1:500 на 1% БСА на ФБС. После инкубации материал промывали в ФБС. Ядра докрашивали DAPI и заключали в среду Vectashield (Vector, USA). Наличие зеленой иммунофлуоресценции указывало на присутствие в клетках исследуемых антигенов. Анализ препаратов проводили с использованием микроскопа Axio Imager Z2 с флуоресцентным модулем снабженного системой совмещенной флуоресценции COLIBRI (Carl Zeiss, Германия).
Количественный анализ иммуннопозитивных клеток или апоптотический индекс (АИ) определяли как отношение общего числа клеток в поле зрения (№ бщ.) к количеству клеток, содержащих р53, р21, PUMA и Mdm 2 (Nx) по формуле АИ= (Nx 100)/ № бщ. Данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением t-критерия достоверности по Стьюденту (РОД).
Иммуноцитохимическое исследование образцов синовиальной оболочки выполнялось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук.
Образцы ткани синовиальной оболочки фиксировали в 4% параформальдигиде на ФБ в течении 1 часа. После фиксации материал сутки промывали в нескольких сменах ФБС при комнатной температуре. После промывки образцы обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации и заливали в смолу LR White (SIGMA, USA) согласно рекомендациям производителя. Ультратонкие срезы материала изготавливали на ультрамикротоме Leica UC6 (Leica, Германия), помещали на никелевые бленды покрытые бутваром.
Перед обработкой первичными антителами ультратонкие срезы промывали в ФБС - три раза по 15 минут в каждой смене. Затем для блокировки неспецифического связывания материал обрабатывали в 10 % растворе БСА на ФБС в течение 1 часа. После чего помещали в первичные антитела - моноклональные антитела мыши к белкам р53 и р21, поликлональные кроличьи антитела к белкам PUMA и Mdm2 разбавленные 10% БСА на ФБС в рабочей концентрации 1:20. Время инкубации составило 24 часа при 4 С. Для контроля неспецифического связывания вторичных антител использовали образцы обработанные 10% БСА на ФБС без добавления антител. После чего препараты промывали в 5% БСА на ФБС 3 раза по 15 минут. Затем материал обрабатывали вторичными антивидовыми антителами, меченными коллоидным золотом с размером частиц 9 нм и 11 нм, разбавленными в соотношении 1:50 в 5% БСА на ФБС, время инкубации составило 3 часа при комнатной температуре. Затем материал промывали 1% БСА на ФБС, переводили в ФБС и дофиксировали сайты связывания антител 0,1% раствором глутарового альдегида на дистиллированной воде. Затем образцы промывали дистиллированной водой три раза по 15 мин.
Методы лабораторного и инструментального исследования
Многие авторы обсуждают роль лизиновых остатков, расположенных в концевом сегменте С-окончания, в активации р53 белка. [48; 64]. Первый, К120 (лизин 120) ацетилируется в ответ на повреждение ДНК и увеличивает экспрессию гена белка PUMA, но не гена белка Mdm2 [84; 88]. Второй сайт ацетилирования, К164, модифицируется соактиватором транскрипции рЗОО и СВР (CREB-binding protein) и, очевидно, является необходимым для индукции экспрессии большинства целевых генов белка р53 [83]. В случае мутации всех шести лизиновых остатков концевого сегмента С-окончания молекулы р53 в сочетании с мутацией К120 и К164 сайтов результатом является новый протеин (p538KR), инертный по своей сути. Эта мутантная форма протеина утрачивает транскрипционную активность необходимую для стимуляции экспрессии большого количества целевых генов, включая гены, кодирующие р21, PUMA, Вах и PIG3 (р53-inducible gene 3). Mdm2 промоутер является существенным исключением: экспрессия Mdm2 вызывается белком p538KR аналогично обычному белку р53.
Полученные нами результаты позволяют предполагать, что на ранней стадии РА происходит мутация белка р53, ведущая к тотальному угнетению основных механизмов апоптоза, реализуемых белками PUMA, р21, но не влияющая на активность молекулы Mdm2, которая на таком фоне в полной мере реализует антиапоптотические эффекты.
Таким образом, складывается впечатление, что молекулу Mdm2 можно рассматривать в качестве перспективной мишени для разработки новых лекарственных препаратов, с целью повышения интенсивности программированной клеточной смерти синовиальных клеток на ранней стадии РА. Перспектива регуляции активности белка р53 в случае его мутации - невысока.
Сравнивая уровень экспрессии в клетках красного KM проапоптотических молекул между собой (р53, PUMA, р21), можно отметить, что наименьший уровень экспрессии наблюдается у белка PUMA на ранней и поздней стадиях РА (Таблица 7, рис. 22, Таблица 8, рис. 23). Кроме того, количество PUMA- позитивных клеток в красном КМ на поздней стадии не превышает количества Mdm2- позитивных клеток. Таким образом, наблюдается угнетение PUMA- опосредованного пути апоптоза как на ранней, так и на поздней стадии РА в клетках красного КМ.
Противоположная тенденция наблюдается в клетках СО, независимо от стадии РА: уровень экспрессии белка PUMA имел максимальный уровень среди всех изучаемых молекул, в том числе и Mdm2 на ранней стадии артрита.
Резюмируя вышесказанное, можно утверждать о тотальном угнетении митохондриального или PUMA- опосредованного пути апоптоза в клетках красного КМ в сочетании с максимальным уровнем экспрессии белка PUMA в клетках СО, независимо от стадии РА. По нашему мнению, весьма интенсивное присутствие молекул белка PUMA на ранней стадии РА в синовиоцитах не исключает, что митохондриальный путь апоптоза пролиферирующих клеток СО является основным при РА.
Каким образом это может быть связано с патофизиологией РА? Ряд авторов показали, что дисрегуляция активности белка PUMA связана непосредственно с активным статусом В-лимфоцитов [39; 61; 91].
Авторам удалось показать, что экспрессия белка наблюдается непосредственно в скоплениях В-лимфоцитов в так называемых зародышевых центрах СО, напоминающих по своему фенотипу лимфому Беркитта. Следовательно, основная задача PUMA протеина - обеспечить апоптоз активированных В-лимфоцитов на самых ранних стадиях РА. Однако, эта цель не реализуется, при сохраняющейся высокой активности самого белка. Механизм нивелирования проапоптотического эффекта PUMA белка в отношении В-лимфоцитов на ранних стадиях, при формально высокой активности последнего, до конца не расшифрован. PUMA реализует апоптоз посредством связывания и прямого антагонизма с пятью другими белками семейства Вс1-2 и, возможно, прямой стимуляцией ещё одного проапоптотического белка Вах [60; 104].
Вместе с тем, удалось показать, что эффекты PUMA могут быть нейтрализованы другим представителем семейства Вс1-2 белков, белком Мс1-1, антиапоптотическим белком по своей сути. Этот белок является критическим для процесса формирования зародышевых центров и формирования В-клеточной иммунологической памяти [92]. Совместная экспрессия протеинов PUMA и MCL-1 выявлена некоторыми авторами на ранних стадиях активации В-лимфоцитов [39].
Кроме того, ряд исследований обозначил ещё один белок-кандидат в антагонисты PUMA эффектам в отношении В-лимфоцитарного иммунитета-Al/Bfl-1 [41; 65].
Надо отметить, что нейтрализующий эффект этого белка был отмечен уже на ранних стадиях антиген-зависимой активации В-лимфоцитов.
Таким образом, складывается впечатление, что PUMA опосредованный механизм регуляции активности, антиген-стимулированных В-лимфоцитов является одним из ведущих механизмов завершения иммунного ответа. Однако, он не реализуется в полной мере при РА в СО поражённых суставов, вследствие антагонизма белков Мс1-1 и Al/Bfl-1. В этих условиях повышение активности белка PUMA, который имеет и без того высокую степень экспрессии в СО суставов при РА, по-видимому, не приведёт к желаемому терапевтическому эффекту в виде прогрессивного апоптоза антиген-стимулированных В-лимфоцитов.
Состояние факторов апоптоза в синовиоцитах при ревматоидном артрите
Боль в суставах не только ограничивает объем движений у больных с РА, но и резко снижает качество жизни больных. Для оценки качества жизни больных РА используют HAQ (Health Assessment Questionnaire). Индекс HAQ считается наиболее удачным инструментом для оценки качества жизни и определения эффективности терапии при проведении рандомизированных клинических исследований при РА [3]. Обнаружение сильной положительной корреляционной связи между индексом HAQ, находящимся в диапазоне средних значений (1,0-1,9), и молекулой PUMA (+0,73, t99%=l,4) на ранней стадии РА, может служить прогностическим индексом снижения качества жизни у больных с ранней стадией РА.
Несмотря на тотальное угнетение апоптоза на ранней стадии РА, сильные корреляционные связи отмечены между проапоптотическими молекулами и индексом активности PA DAS28. Так, выявлена положительная связь между молекулами р53 (+0,85, t99%=3,5), PUMA (+0,76, t99%=2,3) с одной стороны и индексом активности PA DAS28, находящимся в диапазоне, соответствующему высокой степени активности PA (DAS28 5,1), с другой. Последнее обстоятельство указывает на практическую значимость определения уровня экспрессии белков Р53 и PUMA у больных с ранней стадией РА.
Достоверная связь между молекулой PUMA и индексом активности РА DAS28, индексом оценки качества жизни HAQ как на ранней (+0,73), так и на поздней (+0,91) стадиях РА иллюстрирует отмеченную выше патофизиологическую роль самой молекулы. В этой связи трудно переоценить прикладную значимость исследования уровня экспрессии белка PUMA, как биологического маркера прогрессирования РА.
К начальным рентгенологическим признакам РА относят периартикулярное утолщение и уплотнение мягких тканей и околосуставной остеопороз, что по классификации соответствует I стадии по Штейнброкеру [11]. Сильная корреляционная связь между ранними структурными изменениями в суставах и проапоптотическими молекулами р53 (+0,83, t99%=2,9) и PUMA (+0,94, t99%=5,5) указывает на прямую связь между количеством клеток, экспрессирующих данные белки, и рентгенологическим прогрессированием РА. Таким образом, молекулы р53 и PUMA могут рассматриваться в качестве маркеров возможного прогрессирования структурных изменений в суставах у больных РА уже на ранних стадиях заболевания.
Активизация экспрессии главного проапоптотического белка р53 на поздней стадии РА сопровождается прямой связью количества последней с неэрозивным вариантом РА (+0,8, t99%=3,6). Эрозивный вариант РА на поздней стадии коррелировал с количеством антиапоптотической молекулы Mdm2 (+0,7, t99%=2,9). Неэрозивную форму РА считают более благоприятным вариантом течения артрита. У 2/3 пациентов структурные изменения (эрозии) суставов возникают очень быстро, уже в течение первых двух лет с момента начала болезни. Установлено, что предотвращение структурных повреждений в дебюте РА способствует сохранению функциональной активности пациентов в долговременной перспективе [11]. В связи с этим, определение уровня экспрессии молекулы р53 на ранних стадиях РА с целью оценки перспективы развития эрозивных повреждений суставов было бы весьма полезным.
Антитела к ССР не только являются диагностическим маркером, но и имеют большое значение в развитии РА. Серопозитивный по антителам к ССР РА составляет 70-80% всех случаев РА. Эти антитела обнаруживают на самых ранних стадиях и даже до клинической манифестации заболевания. Появление антител связывают с более активным течением заболевания и более выраженной деструкцией суставов [11; 20]. Наличие достоверной положительной связи между серонегативным по антителам к ССР вариантом РА и молекулой PUMA позволяет рассуждать о возможном влиянии PUMA-опосредованного пути апоптоза на процесс цитруллинирования. Чем больше клеток экспрессирует белок PUMA, тем ниже активность цитруллинирования белков у пациентов с поздней стадией РА. При установленной регуляторной функции белка PUMA в отношении В- и Т-клеточного иммунитета это кажется вполне логичным, поскольку феномен избыточного цитруллинирования белков при РА сопряжён с высокой интенсивностью антителогенеза. К сожалению, такая тенденция выявлена только на поздней стадии РА, а не на ранней, когда скорость прогрессии структурных изменений в суставах определяет долгосрочный функциональный прогноз. Поэтому использование молекулы PUMA в качестве прогностического индекса деструктивных изменений на поздней стадии РА теряет смысл.
Таким образом, основываясь на достоверных корреляционных связях между малыми молекулами и индексами активности РА и структурных изменений в суставах, выявленных в ходе нашего исследования, молекулы р53, PUMA и Mdm2 можно рассматривать в качестве полезных индексов, дающих дополнительную информацию о характере течения и прогнозе при РА (Табл. 9).
Показатели достоверных корреляционных связей между показателями распределения р53-, р21-, PUMA- и Mdm2-иммунореактивных клеток костного мозга и синовиальной оболочки и индексами активности РА и структурных изменений в суставах на ранней и поздней стадиях РА
В качестве иллюстрации приводим клинический пример вариантов экспрессии изучаемых молекул на фоне проведения биологической противовоспалительной терапии генно-инженерным препаратом ритуксимаб.
Больная П., 1948 года рождения, наблюдается у ревматолога по поводу ревматоидного артрита, эрозивного варианта, серопозитивного по антителам к RF Ig М и антителам к ССР, с внесуставными проявлениями (ревматоидные узелки, амиотрофии) с 1980 года. С начала заболевания больная последовательно получала следующую базисную противовоспалительную терапию: гидроксихлорохин 250 мг 1 раз в день (с октября 1980 года по ноябрь 1990 года, препарат был отменен в связи с недостаточной эффективностью), метотрексат 15 мг 1 раз в неделю внутримышечно (с апреля 2004 года по июнь 2009 года, препарат был отменен в связи с непереносимостью), а также различные НПВП. В 2009 году больной было проведено эндопротезирование обоих коленных суставов по поводу вторичного гонартроза R IV ст. На момент забора костного мозга в рамках нашего исследования индекс активности заболевания DAS28 находился в диапазоне средних значений (3,2-5,1), индекс качества жизни HAQ составлял 0,75, рентгенологические изменения в суставах соответствовали 4 стадии по Штейнброкеру, титр антител к RF Ig М составлял 401 Ед/мл, титр антител к ССР составлял 132,9 Ед/мл. До забора ткани костного мозга больной было проведено 2 курса анти-В-клеточной терапии препаратом ритуксимаб по стандартной схеме (суммарная доза ритуксимаба составила 4000 мг). На фоне лечения анти-В-клеточной терапией препаратом ритуксимаб активность заболевания снизилась, индекс активности заболевания DAS28 составил 2,7, индекс качества жизни HAQ составил 0,4, что соответствует низкой активности РА.
