Содержание к диссертации
______ . _ ___ ._ __СіРл
Список использованных сокращений 4
Введение 5
! ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.2.
1.1. Вирус Западного Нила (ВЗН) 14
Инфекционные свойства ВЗН 21
1.2. 1. Патогенез 21
1. 2. 2. Заболевание, вызываемое ВЗН у животных 23
1. 2. 3. Инфекция ВЗН у людей _ _ _'_33_
1.3.
1. 2. 4. Генетические основы патогенности и адаптивных свойств 37 ВЗН
Экология ВЗН , 39
1.3. 1. Ареал ВЗН _ _______ __ _ ! 39
1.3.2. Циркуляция ВЗН в природе _____ l 40
__!-3-A-J Природный резервуар 40
1._3__2.2. Трансмиссивные циклы ВЗН __ 43
1. 3. 3. Влияние факторов окружающей среды на передачу ВЗН
трансмиссивным путём _ 52_
1.4.
Юг Западной Сибири как новая эндемичная территория для ВЗН^ ] J>6^
J. .4. L Исследования ВЗН в Сибири (исторический аспект) 56
1. 4. 2. Краткая физико-географическая и фаунистическая харак- і
теристика южной части Западно-Сибирской равнины 58
1. З.) Заключение обзора литературы 64
\TJU^^2j^TE?HA^H}4ET0^1 _" _ " 66_
2. ЬрВыбор места сбора полевого материала и характеристика сезонов^ _ 66
2.2. Исследуемый материал _ _ t 70
2.2. 1. Сбор полевого материала 70
2. 2. 2. Материал от сельскохозяйственных животных J72
2. 2. 3. Клинический материал 73
2.3.
Методы__ _ _ 73
2. 3. 1. Иммунологические методы 1 74
2.3.2^ Малекулярно-биологические методы _____ ___ __ _ 77
2.3.3. Вирусологические методы _ _ _ 82
2.4.
Статистическая обработка результатов ___ _ 83
3. 1
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ _ 84
Цигжуляция ВЗН в экосистемах на юге Западной Сибири 84
3. 1. 1. Краткая характеристика мест сбора материала _ __-?___
3.1.2. Распределение маркеров ВЗН у позвоночных животных , _ 87 __
3. 1.3. Экология, численность и распределение маркеров ВЗН у
кровососущих членистоногих і 101_
3. 1.4. Влияние климатических параметров сезона на зараженность
ВЗН участников трансмиссивного цикла и возможность
формирования местных очагов циркуляцииJB3H 119 _
3. 1.5. Участие в трансмиссивном цикле ВЗН случайных хозяев - '128
сельскозяиственных животных и людей
1.5. 1. Сельскохозяйственные животные 128
j 3.1.5. 2. Люди 130
3 9 ' Изучение генетического разнообразия ВЗН, циркулирующего на юге
', Западной Сибири _ 139
_4. | Заключение JLM
_5-_i Выводы _____ _ ____ 148.
Литература 15^
Приложения 171
Список использованных сокращений
а. о. аминокислотные остатки
БОЕ бляшкообразующая единица
ВЗН вирус Западного Нила
ВКЭ вирус клещевого энцефалита
ИФА иммуноферментный анализ
кДа килодальтон
кДНК комплементарная ДНК
ЛЗН лихорадка Западного Нила
м. в. молекулярный вес
н. о. нукдеотидные остатки
НСО Новосибирская область
ОГЛ омская геморрагическая лихорадка
оз. озеро
ОТ-ПЦР обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
ПЦР полимеразная цепная реакция
р. река
РН реакция нейтрализации
РТГА реакция торможения гемагглютинации
с. село
ТНХК Томский нефтехимический комбинат
ТУ Территориальное управление
ФСБ фосфатно-солевой буфер
ІДНС центральная нервная система
ЦПД цитопатическое действие
ЦРБ Центральная районная больница
CDC Центр по контролю за заболеваниями (США, г. Атланта)
dNTP дезоксинуклеотидтрифосфаты
EDTA этилендиамин тетраацетат
Введение к работе
Актуальность исследования
Вирус Западного Нила (ВЗН), этиологически связанный с лихорадкой Западного Нила (ЛЗН), относится к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus, антигенному комплексу японского энцефалита [31]. Впервые вирус был выделен из крови больного в 1937 году в Уганде, провинция Западный Нил [28], откуда и пошло его название. Основными позвоночными хозяевами вируса в природе являются птицы, в качестве переносчиков выступают кровососущие комары {Diptera, Culicidae) различных видов [28]. Основной трансмиссивный цикл вируса Западного Нила поддерживается при постоянной передаче вируса в цепочке птица <-» комар, от комаров вирус передается другим позвоночным животным [189]. Основная роль в поддержании циркуляции вируса в природных очагах среди позвоночных животных принадлежит птицам; с птицами может быть также связан занос вируса на неэндемичные территории [30, 128]. Роль других позвоночных в этом процессе менее значительна из-за недостаточного для заражения комаров уровня вирусемии [28].
Круг восприимчивых к ВЗН позвоночных животных чрезвычайно широк и включает в себя диких и домашних птиц [68, 81, 140], млекопитающих (включая людей) [78, 187], а также некоторые виды рептилий [191], что указывает на значительную экологическую пластичность этого вируса. Клиническая картина вызываемой им инфекции у восприимчивых животных и человека варьирует от бессимптомных форм до лихорадки и летальных форм менингоэнцефалита.
Исторически ареал ВЗН включает в себя Африку, Южную и Центральную Европу, Австралию и Южную Азию [31, 180]. В России ВЗН активно циркулирует на территории Волгоградской, Астраханской, Ростовской областей и в Краснодарском крае [2, 182]. Расширение ареала ВЗН было отмечено в 1999 году, когда вирус был впервые выявлен в США; в настоящее время он распространился практически по всей территории этой страны [138, 127, 181]. Позднее вирус был обнаружен в Канаде, Мексике [136, 192] и некоторых странах Латинской Америки [122, 211].
На протяжении нескольких десятилетий с момента открытия ВЗН отмечались в основном спорадические случаи ЛЗН у людей в пределах эндемичных территорий. В конце 90-х годов прошлого века вспышки ЛЗН были отмечены в нескольких европейских странах [205, 175], Израиле [78], а также впервые на североамериканском континенте [171]. Почти во всех вспышках была высока доля больных с тяжелой формой менингоэнцефалита; уровень летальности колебался от 4% (Румыния) до 12,5% (США) [175, 171]. В 1999 году подобная вспышка ЛЗН была зарегистрирована и на юге России, в Волгоградской области и Краснодарском крае, где также имели место случаи менингоэнцефалита с летальным исходом [57, 115]. Филогенетический анализ изолятов ВЗН, выделенных во время вспышек в различных частях ареала в конце прошлого - начале нынешнего столетий, показал принадлежность большей части из них к генотипу 1а [79], что указывает на способность к экспансии именно этого генотипа ВЗН.
В связи с усилением патогенности вируса Западного Нила на эндемичных и новых территориях, а также благодаря его быстрой адаптации к новым видам хозяев, ЛЗН в настоящее время рассматривают как классический пример возникающего и вновь возвращающегося (emerging-reemerging) инфекционного заболевания [29]. Для эффективного контроля над этими процессами особая роль отводится регулярному мониторингу циркуляции ВЗН как в традиционных очагах, так на новых территориях.
Первые предположения о возможном заносе ВЗН перелётными птицами в Западную Сибирь и попытки его обнаружения следует отнести к 60-70 гг. прошлого века [30]. В те годы были обследованы сыворотки крови более чем от тысячи перелетных птиц, гнездящихся на побережье оз. Малые Чаны, и у части из них был выявлены антитела к ВЗН [7]. Антитела к вирусу были также обнаружены в сыворотках крови людей [6]. Имеется также сообщение о выделении ВЗН из полевого материала на территории Омской области [2], однако, достоверной информации о выделенном изоляте в реферируемых журналах, а также в базе GenBank найти не удалось. Следует отметить, что обследования птиц и людей проводились на территории, где циркулируют другие флавивирусы — вирус ОГЛ и ВКЭ, имеющие с ВЗН выраженный антигенный перекрест в серологических реакциях. Не занижая ценность выполненных исследований, трудно говорить о возможности проведения в то время достоверной дифференциальной диагностики ВЗН от других флавивирусов с использованием лишь серологических методов. Спустя длительное время, в 2002 г. гликопротеин и РНК ВЗН были обнаружены в образцах головного мозга диких перелётных птиц - двух видов чирков и грачей; филогенетический анализ западносибирских вариантов ВЗН также показал их принадлежность генотипу 1а [9].
Установление факта заноса ВЗН на неэндемичную территорию не даёт ответа на вопрос о возможности формирования местных очагов циркуляции,-вируса. Исходя из особенностей трансмиссивного цикла ВЗН, показателем его циркуляции на определенной территории является выявление вируса или его маркеров (гликопротеин оболочки и РНК) у кровососущих членистоногих и других, кроме птиц, позвоночных животных, связанных с членистоногими-переносчиками трофическими связями. Кроме этого, на эффективность' передачи вируса позвоночным животным, участвующим в трансмиссивном цикле, оказывают влияние определённые факторы окружающей среды, при наличии которых формируются благоприятные условия для активности членистоногих переносчиков и репликации вируса в их организме.
Таким образом, для оценки возможности формирования местных очагов циркуляции ВЗН на юге Западной Сибири необходимо было провести в местах вероятного заноса ВЗН комплексное эколого-вирусологическое исследование различных экосистем. Экологическая компонента должна включать в себя характеристику животных сообществ с целью определения участников трансмиссивного цикла вируса, характеристику климатических параметров сезона, влияющих на существование и активность членистоногих, а также на репликацию вируса в их организме. Вирусологическая составляющая подразумевает выявление вирусных маркеров (гликопротеина Е и вирусной РНК) у животных, участвующих в трансмиссивном цикле ВЗН, изучение возможности вовлечения в циркуляцию вируса случайных хозяев — сельскохозяйственных животных и людей, а также молекулярно-генетический анализ выделенных вариантов вируса.
Основная цель - настоящего исследования заключается в выявлении особенностей циркуляции ВЗН в разных ландшафтно-экологических условиях на юге Западной Сибири и оценке возможного формирования очагов циркуляции ВЗН.
Для достижения поставленной цели необходимо было выполнить следующие задачи: в местах вероятного заноса ВЗН в разных ландшафтных зонах юга. Западной Сибири выбрать природные экосистемы с наличием потенциальных участников трансмиссивного цикла ВЗН - птиц, мелких млекопитающих, кровососущих комаров и иксодовых клещей; провести сбор и анализ образцов от потенциальных участников трансмиссивного цикла для установления факта циркуляции среди них ВЗН; - провести сравнительный анализ степени зараженности ВЗН участников трансмиссивного цикла с учётом климатических параметров сезона исследования для оценки возможного формирования природных очагов циркуляции ВЗН на юге Западной Сибири; исследовать возможность вовлечения в трансмиссивный цикл ВЗН случайных участников - сельскохозяйственных животных и людей; изучить генетическое разнообразие ВЗН, циркулирующего на юге Западной Сибири.
Научная новизна и практическая значимость
По результатам комплексных эколого-вирусологических исследований показана возможность формирования на юге Западной Сибири очагов циркуляции ВЗН, не связанных с сезонным заносом вируса перелётными птицами.
Впервые с использованием современных иммунологических и молекулярно-биологических методов была показана циркуляция ВЗН у диких птиц с разным миграционным статусом, мелких млекопитающих и иксодовых клещей на юге Западной Сибири.
Впервые в условиях региона выявлена зависимость между уровнем зараженности участников трансмиссивного цикла ВЗН и климатическими характеристиками сезона исследования. Было показано, что основным параметром, влияющим на зараженность ВЗН участников трансмиссивного цикла, является длительность периода с температурным режимом >26С в сезоне.
На основании данных серологического мониторинга здоровых доноров и диагностики случаев заболевания, вызванного ВЗН у жителей Новосибирской области, показана эпидемическая напряжённость западносибирского очага циркуляции-ВЗН, а также в структуре инфекционных заболеваний населения в Новосибирской области установлена новая' нозологическая форма -лихорадка Западного Нила.
Филогенетический анализ полевых и клинических изолятов ВЗН, выделенных на юге Западной Сибири в 2003-2006 гг. показал их принадлежность к генотипу 1а и выявил генетическую близость со штаммами ВЗН, изолированными от погибших пациентов во время вспышки ЛЗН в 1999 г. в Волгограде, что свидетельствует о наличии эпидемического потенциала у ВЗН, циркулирующего на юге Западной Сибири.
Материалы диссертации вошли в отчёты: - по Договору между ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и Новосибирским областным фондом поддержки науки и высшего образования при Администрации Новосибирской области по теме «Идентификация и генотипирование вируса Западного Нила, циркулирующего в Новосибирской области»; - по научной теме гранта РНП.2.1.1.7515 ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы».
Совместно со специалистами ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Новосибирской области разработан Приказ «О мерах по диагностике лихорадки Западного Нила у людей в Новосибирской области», вступивший в силу с августа 2006 года.
Основные положения, выносимые на защиту показана циркуляция вируса Западного Нила среди диких птиц с разным миграционным статусом, мелких млекопитающих и иксодовых клещей в различных экосистемах юга Западной Сибири; зараженность ВЗН участников трансмиссивного цикла в экосистемах, юга Западной Сибири зависит от длительности периода с температурами >26С в сезоне. В степной, лесостепной зонах и подзоне осиново-берёзовых лесов юга Западной Сибири показано формирование природных очагов ВЗН, не связанных с сезонным заносом; - показана эпидемическая напряжённость западносибирского очага циркуляции ВЗН на основании данных серомониторинга сельскохозяйственных животных и здоровых доноров, а также по выявлению случаев заболевания, вызванного ВЗН у жителей Новосибирской области; - полевые и клинические изоляты ВЗН, выделенные в Западной Сибири в 2003-2006 гг., принадлежат к генотипу 1а и имеют высокий уровень гомологии с патогенными для людей штаммами ВЗН, изолированными на юге России.
Вклад автора
Автор непосредственно принимала участие в сборе и иммуноферментном анализе полевого материала из Новосибирской области; в сборе, иммуноферментном анализе клинического материала от здоровых доноров и выделении ВЗН из материала от заболевшего человека, в подготовке проб полевого материала из Томской области и статитстической обработке результатов.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 20 публикаций, в том числе 6 статей в отечественных реферируемых журналах.
Материалы исследований были представлены на Всероссийской научной конференции «Сибирская зоологическая конференция» (Новосибирск, 2004), Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных» (Покров, Владимирская область, 2004), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты» (Омск, 2004), Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004), Межрегиональной научной конференции «Паразитологические исследования в Сибири и на Дальнем Востоке» (Новосибирск, 2005), Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005), Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: Проблемы здравоохранения и военной медицины» (Санкт-Петербург, 2005), Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006), Международном семинаре «Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza», (Новосибирск, 2007), III Межрегиональной научной конференции, посвященной 80-летию профессора К.П. Фёдорова (Новосибирск, 2009).
Работа была выполнена в 2003 - 2008 годах. Раздел работы, посвященный изучению клещевых инфекций у иксодовых клещей, млекопитающих и диких птиц в Томской области был поддержан грантом
РНП.2.1.1.7515 ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы». Исследования клинического материала от заболевших людей утверждены Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», название проекта «Выявление случаев заболевания, вызванного вирусом Западного Нила у людей в Новосибирской области» (утвержден 10.02.2006).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 170 страницах, содержит 25 таблиц и 10 рисунков. Состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», выводов и списка литературы. Список литературы содержит 217 источника, из них 159 иностранных.
Благодарности
Автор выражает благодарность научному руководителю к.б.н. A.M. Шестопалову и своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа: - сотрудникам отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» к.б.н. Е.В. Протопоповой, к.б.н. В.А. Терновому, к.б.н. Е.В. Чаусову, к.б.н. Н.Л. Тупоте, С.Н. Коноваловой, д.б.н., проф. В.Б. Локтеву; ведущему научному сотруднику лаборатории экологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва) к.б.н. М.Ю. Щелканову; сотрудникам Института систематики и экологии животных (ИСиЭЖ) СО РАН к.б.н. А.Г. Мирзаевой, к.б.н. А.В. Друзяке, к.б.н. Т.А. Дупал, к.б.н. А.К. Юрлову, Ю.А. Смирновой, к.б.н. В.А. Шило, д.б.н. С.Н. Борисову, к.б.н. Ю.А. Юрченко; специалистам ТУ Роспотребнадзора по Новосибирской области А.П. Федянину и к.м.н. Л.В. Самойловой; заведующему вирусологическим отделом Новосибирской межобластной ветеринарной лаборатории к.в.н. В.И. Аксёнову; сотрудникам кафедры зоологии позвоночных Томского государственного университета д.б.н., проф. Н.С. Москвитиной, С.С. Москвитину, д.б.н. В.Н. Романенко, к.б.н. И.Г. Коробицыну, к.б.н. В.Н. Курановой, к.б.н. СИ. Гашкову, Н.В. Ивановой, Н.П. Большаковой; а также коллегам из отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» за консультативную помощь и поддержку в написании диссертации.
