Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 7
1.1 Актуальность проблемы 7
1.2 Цели и задачи работы 9
1.3 Научная новизна работы 9
1.4 Практическая значимость 10
1.5 Апробация работы 10
2. Обзор литературы 12
2.1 Роль генов stellate в сперматогенезе drosophila melanogaster 12
2.1.1 Система генов crystal-Stellate 14
2.1.2 Эволюция системы генов crystal-Stellate 16
2.1.3 Гены Stellate — основная мишень piPHK-зависимого сайленсинга в терминальных тканях самцов Drosophila теlanogaster 21
2.1.4 Белок Stellate, партнёры и посттрансляционные модификации 24
2.2 Транскрипционная регуляция у эукариот 32
2.2.1 Области контроля транскрипции. Белки регуляторы транскрипции 32
2.2.2 Способы инициации транскрипции 34
2.2.3 Основные регуляторные элементы корового промотора 36
2.2.3.1 ТАТА-бокс 36
2.2.3.2 TFIIB recognition element (BRE). BREu uBREd 38
2.2.3.3. Инициатор (Inr) 39
2.2.3.4 Downstream Promoter Element (DPE) 40
2.2.3.5 Motif ten element (MTE) 41
2.2.3.6 Трехчастная организация послестартового корового промотора DCP (downstream core promoter) 43
2.2.3.7 Downstream core element (DCE) 44
2.2.3.8 Элементы, функционирующие независимо от ТАТА-бокса или инициатора (ХСРЕ1, XCPE2,MED-1) 44
2.2.3.9 ТСТмотив (полипиримидиновый инициатор) 45
2.2.3.10 CpG островки 47
2.2.4 Проксимальные промоторные элементы 48
Е-бокс (enhancer box). Суперсемейство транскрипционных факторов ЪНЬН 49
2.2.5 Дистальные регуляторные элементы 52
2.2.6 Модели транскрипционной регуляции с помощью регуляторных элементов минимального промотора 53
2.2.7 Семенник-специфичные промоторы Drosophila 55
2.2.8 Особенности транскрипции генов при сперматогенезе у Drosophila 59
Заключение 61
3. Материалы и методы 62
3.1 Биоинформатические методы 62
3.1.1 Поиск участков связывания транскрипционных факторов 62
3.1.2 Оценка дивергенции промоторов 62
3.2 Биологические материалы 62
3.3 Линии Drosophila и генетические скрещивания 63
Мобилизация Р-элементов Stel34-lacZuStel34-E2M-lacZ 64
3.4 Стандартные молекулярно-биологические методы 64
3.5 Создание трансгенных конструкций Stel34-E123M-lacZ и Stel34-E2M-lacZ. 64
3.6 Трансформация эмбрионов Drosophila 65
3.6.1 Подготовка и тренировка стада 65
3.6.2 Сбор эмбрионов и инъекции 66
3.6.3 Сбор эмбрионов после инъекций 67
3.7 Анализ активности р-галактозидазы в семенниках трансгенных мух 67
3.8 Выделение ядерных экстрактов 69
3.9 Гель-шифт 70
3.9.1 Зонды 70
3.9.2 Получение двуцепочечных зондов 71
3.9.3 Кинирование и очистка зондов 71
3.9.4 Гель-шифт и супер-шифт 72
3.10 Детекция транскриптов dUSF 73
3.11 Получение антител к белку dUSF 74
3.11.1 Создание конструкций pQE30 -fUSF и pQE30 USF 74
3.11.2 Экспрессия конструкций pQE30 -fUSF иpQE30 USF и очистка рекомбинантных белков 76
3.11.3 Иммунизация мышей рекомбинантными белками 6His-fUSF и 6HisUSF и получение антисывороток 77
3.12 Иммуноферментный сорбционный анализ (ELISA) 77
3.13 Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ 78
3.14 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов целых семенников и конфокальная микроскопия 79
4. Результаты 81
4.1 Идентификация ис-регуляторных участков в промоторе генов Stellate 81
4.2 Идентификация фактора, связывающего Е-боксы в промоторе гетерохроматиновых генов Stellate 92
4.3 Оценка значимости ис-регуляторных элементов в составе промотора
гетерохроматиновых генов Stellate in vivo 106 4.4 Детальное картирование промотора гетерохроматиновых генов Stellate 109
4.5 Дивергенция в промоторной области генов pNACtes 112
4.6 Репрессия активности трансгенов в Х-хромосоме 116
5. Обсуждение 118
6. Выводы 125
7. Список цитируемой литературы 126
8. Благодарности
- Научная новизна работы
- Белок Stellate, партнёры и посттрансляционные модификации
- Поиск участков связывания транскрипционных факторов
- Иммунизация мышей рекомбинантными белками 6His-fUSF и 6HisUSF и получение антисывороток
Научная новизна работы
Гены Stellate формируют два кластера в Х-хромосоме, один находится в эухроматине (участок 12Е1-2 карты политенной Х-хромосомы), другой в гетерохроматине (участок h26 митотической прометафазной карты Х-хромосомы) (Hardy et al, 1984; Livak 1984; Palumbo et al, 1994; Tulin et al, 1997). Различные линии D.melanogaster несут разное число повторов Stellate, от 15-50 до 150-400 копий (Palumbo et al., 1994). Кодируемый ими белковый продукт гомологичен регуляторной Р-субъединице протеинкиназы СК2, СК2Р (Livak 1990; Bozzetti et al, 1995). В Y-хромосоме расположены высокогомологичные генам Stellate повторы Su(Ste) {Suppressor of Stellate) также известные как локус crystal (Hardy et al, 1984). Повторы Su(Ste) несут нарушенные ОРС и не транслируются, но транскрибируются в обоих направлениях (Balakireva et al, 1992; Aravin et al, 2001). В норме экспрессия генов Stellate в семенниках подавлена посттранскрипционно с помощью коротких piPHK, образующихся при процес синге антисмысловых транскриптов Su(Ste) (Aravin et al, 2001; Vagin et al, 2006). Полная или частичная потеря повторов Su(Ste) приводит к гиперэкспрессии генов Stellate, к нарушениям мейоза и частичной или полной стерильности самцов. При этом белок Stellate формирует большое количество игловидных или звездчатых кристаллов в сперматоцитах (Hardy et al, 1984; Palumbo et al, 1994; Bozzetti et al, 1995).
Растворимая форма белка Stellate, обнаруженная в ядрах сперматоцитов самцов с делецией повторов Su(Ste), взаимодействует с каталитической а-субъединицей протеинкиназы СК2, СК2а, и вызывает модуляцию фосфорилирования ряда мишеней СК2 в ядре (Egorova et al,
2009). Кроме того, белок Stellate подвергается посттрансляционному триметилированию по остатку лизина К92, структурно мимикрируя триметилирование гистона НЗ по остатку К9 (Egorova et al, 2009). Не исключено, что именно триметилированная форма Stellate играет ключевую роль в аберрантном мейотическом процессе за счёт изменения фосфорилирования ядерных хромодоменных белков, участвующих в когезии и/или расхождении гомологичных хромосом и сестринских хроматид в мейозе.
Повторы Stellate эволюционно фиксированы и сохраняют высокую гомогенность в геноме D. melanogaster (Tulin et al, 1997; Kogan et al, 2000). Гены Stellate представляют собой основную мишень ріРНК-сайленсинга в семенниках/), melanogaster (Aravin et al, 2001; Nagao et al, 2010). Т.о. для поддержания фертильности самцов и воспроизводства вида необходима интактная система генов Ste-Su(Ste) и корректная работа piPHK-зависимой машины сайленсинга.
Остаются неизвестными как эволюционный смысл возникновения Ste-Su(Ste) системы, так и точный механизм вызываемого гиперэкспрессией Stellate патогенеза. У других близкородственных видов Drosophila подобной системы не обнаружено. Возникновение, эволюция и регуляция Ste-Su(Ste) системы остается предметом интенсивных исследований (Kalmykova et al, 1997; 2002; Usakin et al, 2005; Nishida et al, 2007; Nagao et al, 2010; Kogan et al, 2012). Однако до настоящего времени о транскрипционной регуляции экспрессии генов Stellate было известно немного.
В ходе данной работы было проведено функциональное картирование промотора генов Stellate, в результате которого в составе минимального промоторного учаска были обнаружены три г/ис-регуляторных элемента, известных как Е-боксы (CANNTG). Один и тот же фактор из ядерного экстракта семенников (dUSF, транскрипционный фактор из семейства bHLH, basic Helix-Loop-Helix) взаимодействовал со всеми тремя Е-боксами in vitro. С помощью репортерного анализа была показана необходимость Е-боксов для семенник-специфической транскрипции с использованием данного промотора in vivo. Полученные данные позволили охарактеризовать новый тип семенник-специфического промотора, определяющего смысловую транскрипцию не только повторов Ste-Su(Ste), но и другого семейства семенник-специфичных генов. 1.2 Цели и задачи работы
В работе представлен анализ семенник-специфичного промотора генов семейства Stellate. Впервые обнаружены в промоторной области три близко расположенных цис-регуляторных участка, известных как Е-боксы, с которыми взаимодействует один транскрипционный фактор - dUSF семейства bHLH (basic Helix-Loop-Helix). Для dUSF впервые показана его тканеспецифичная экспрессия у D. melanogaster.
С использованием избирательно мутагенизированных репортерных конструкций показано, что для эффективной семенник-специфичной транскрипции с промотора Stellate in vivo необходимы ненарушенные Е-боксы, причем наиболее важным регуляторным элементом является Е-бокс 2. Сравнительный анализ последовательностей промоторов генов Stellate, Su(Ste) и pNACtes позволил установить, какие из Е-боксов являются общими для всех генных семейств. Был также обнаружен потенциальный сайт связывания неизвестного транскрипционного фактора в промоторной области двух генов семейства fiNACtes, несущих делецию Е-бокса 2 в промоторе. Поскольку мы не обнаружили Е-боксов в составе известных семенник-специфичных промоторов, то промотор Stellate может рассматриваться как новый тип промотора, ответственный за семенник-специфичную транскрипцию. С помощью анализа экспрессии репортерных конструкций P{Ste703-lacZ} и P{6Stellate-Ste703-lacZ}, встроенных в различные хромосомы, мы впервые показали, что активность эндогенного промотора семенник-специфичных генов Х-хромосомы определяется контекстом хроматина Х-хромосомы в терминальных клетках самцов и является сниженной вдвое по сравнению с таковой в аутосомах. Это позволяет говорить о двух уровнях репрессии генов Stellate, один из которых реализуется на уровне хроматина, приводя к частичному подавлению их транскрипции, а другой основан на посттранскрипционном ріРНК-сайленсинге, обеспечивающем полную репрессию этих генов.
Нарушения слаженного механизма работы генетической системы Ste-Su(Ste) приводит к значительным дефектам сперматогенеза, воспроизводства и поддержания вида. И если о посттранскрипционном сайленсинге генов Stellate с помощью ріРНК в настоящий момент известно довольно много, то о регуляции транскрипции генов Stellate данных чрезвычайно мало. В работе охарактеризован новый тип тканеспецифичного промотора, выявлены цис-регуляторные участки и идентифицирован взаимодействующий с ними фактор. Результаты данной работы расширяют наши знания о механизмах тканеспецифичной экспрессии генов, о транскрипционной регуляции разных генных семейств, обладающих одинаковым промотором и о влиянии Х-хромосомного контекста на экспрессию Х-сцепленных генов на премейотических стадиях сперматогенеза.
Обзор литературы состоит из двух разделов. В первой части обобщены современные представления о происхождении и организации генетической системы crystal-Stellate, о транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов Stellate. Также обсуждаются возможные механизмы патогенеза, вызванного гиперэкспрессией белка Stellate. Вторая часть посвящена описанию организации эукариотических промоторов, регуляции транскрипции на уровне промоторов, отдельно рассматривается организация промоторов семенник-специфичных генов и регуляция их экспрессии.
Белок Stellate, партнёры и посттрансляционные модификации
ТСТ мотив представлен практически во всех промоторах рибосомальных генов Drosophila и человека, и, по-видимому, отсутствует в геноме S. cerevisiae (Parry et al, 2010). Мотив ТСТ обнаружен в промоторах генов, кодирующих факторы инициации и элонгации трансляции (Ef2b, eIF-5A, Int6/eIF3-S6 и eIF3-S8), тРНК-синтетазу (Aatsyr) и полиА-связывающий белок (рАЪр). Всего в геноме дрозофилы обнаружено около 120 мотивов ТСТ (включая рибосомные гены) (Parry et al, 2010), что соответствует приблизительно 1% промоторов. Мотив ТСТ — пример корового промоторного элемента, вовлеченного в регуляцию сети генов (network), его можно отнести к редким, но биологически значимым элементам. Для транскрипционной активности наиболее важными являются шесть центральных нуклеотидов мотива ТСТ (YCTTTY), которые очень напоминают консенсус инициатора (TCAKTY у Drosophila) (Parry et al, 2010). Очищенный TFIID практически не взаимодействует с ТСТ-зависимым коровым промотором гена RpLPl несмотря на сходство мотива ТСТ с Inr, с которым TFIID взаимодействует (Chalkley and Verrijzer, 1999). Т.е. мотив ТСТ не является функциональным аналогом Inr.
Мотив ТСТ не может заменять Inr для обеспечения базальной транскрипционной активности. Однако, единственная замена Т-на-А в триплете ТСТ, приводящая к появлению триплета ТСА, может превращать мотив ТСТ в активный инициаторный элемент, обеспечивающий транскрипционную активность и связывание TFIID. Основанная на работе мотива ТСТ транскрипционная система функционирует по фундаментально отличному механизму, нежели хорошо изученная транскрипционная система, включающая Inr и TFIID. Примечательно, что отличие одного нуклеотида (А вместо Т) в последовательностях Inr и мотива ТСТ отвечает за их различные транскрипционные свойства (Parry et al, 2010).
В дальнейшем был выполнен анализ кандидатных факторов, которые могут служить посредниками при транскрипции генов, содержащих мотив ТСТ. Установлено, что для транскрипции таких генов необходим фактор TRF2 (TBP-related factor 2) (Wang et al, 2014). Несмотря на то, что TRF2 похож на ТВР, он не взаимодействует с ТАТА-боксами, и его ДНК-мишени ранее не были известны. При сверхэкспрессии TRF2 увеличивалась транскрипция генов с ТСТ-мотивами в промоторах, но не генов с ТАТА-содержащими промоторами. При снижении содержания TRF2 в изучаемых системах уменьшалась транскрипция генов с ТСТ мотивами, но не с ТАТА-боксами (Wang et al, 2014). Также было показано, что TRF2 преимущественно локализуется в промоторах ТСТ-содержащих генов, хотя непосредственное взаимодействие TRF2 с ДНК по-прежнему не продемонстрировано. Таким образом, установлено, что для транскрипции ТСТ-содержащих генов используется транскрипционная система, основанная на TRF2, отличная от хорошо известных транскрипционных систем, использующих ТВР (Wang et al, 2014).
В геноме позвоночных основания цитозина в динуклеотидах CG (или CpG) обычно метилированы и представлены 5-метилцитозином. В результате спонтанного дезаминирования 5-метилцитозин может превращаться в тимин. Эта мутация (нарушение спаривания T/G) детектируется с низкой эффективностью и не репарируется ферментами ДНК репарации, например, тимин-ДНК-гликозилазой (TDG), что приводит к статистической недопредставленности динуклеотидов CG в геноме позвоночных. Однако существуют протяженные участки ДНК, т. н. CpG островки, богатые динуклеотидами CG (содержание выше 50%) по сравнению с остальным геномом (Bird, 1986; Gardiner-Garden and Frommer, 1987). Эти кластеры динуклеотидов CpG преимущественно неметилированы, тогда как в остальном геноме 70-80% CpG островков метилировано (Bird, 1999).
Протяженность CpG островков составляет от 0.5 до 2 т.п.н., в среднем 1т п. н. В CpG островках сосредоточены промоторы разнообразных генов. Как правило, CpG островки не содержат ТАТА-бокса или DPE, но несут множественные мотивы CG-боксов, с которыми взаимодействуют Spl и родственные ему транскрипционные факторы (Macleod et al, 1994) (таблица 3).
Транскрипционная активность генов часто регулируется с помощью метилирования цитозинов CpG динуклеотидов в промоторной области. Активность плотно метилированных промоторов подавлена, главным образом за счет связывания репрессорных белков, например, Spl, который может быть как репрессором, так и активатором транскрипции в ответ на физиологические стимулы (Macleod et al, 1994). Неметилированные промоторы остаются активными, кроме того для них характерно формирование открытой структуры хроматина.
У позвоночных свыше 50% промоторов располагаются в CpG островках (Suzuki et al, 2001). Промоторы с CpG островками часто имеют дисперсный паттерн инициации транскрипции и обнаруживаются у генов «домашнего хозяйства». На основании этих находок возникла гипотеза, что дисперсные промоторы ассоциированы с генами «домашнего хозяйства» и расположены в CpG островках. Эта модель была общепризнанной до полногеномного анализа транскрипционных паттернов у Drosophila. Поскольку метилирование CpG динуклетидов у Drosophila чрезвычайно низко, CpG динуклетиды возникают в геноме с нормальной частотой и CpG островков не существует. Таким образом, у Drosophila фокусные и дисперсные промоторы существуют в отсутствие CpG островков (Rach et al, 2011; Hoskins et al, 2011). Связь между CpG островками и дисперсной транскрипцией не является строгой.
У дрожжей Saccharomyces cerevisiae регуляция связывания TFIID с коровыми промоторными элементами зависит от регуляторной последовательности UAS (upstream activating sequence), расположенной за несколько сот пар нуклеотидов от промотора. Абсолютное большинство генов дрожжей содержат одну последовательность UAS, обычно состоящую из двух-трех близко расположенных сайтов связывания для 1-2 различных транскрипционных факторов (Allison, 2007).
У многоклеточных эукариот гены содержат несколько проксимальных промоторных элементов, расположенных в 5- области относительно корового промотора на расстоянии 70-200 пар нуклеотидов от TSS. Сайты узнавания для транскрипционных факторов тяготеют к организации в кластеры. Функция проксимальных промоторных элементов состоит в увеличении частоты инициации транскрипции, что наблюдается только в случае близкого расположения к TSS. Транскрипционные факторы, взаимодействующие с проксимальными промоторными элементами, не всегда оказывают прямое активирующее или репрессирующее действие, а могут выступать в качестве «буферных элементов», привлекающих к коровому промотору «дальнодействующие» регуляторные элементы (энхансеры и др.).
Поиск участков связывания транскрипционных факторов
Для обнаружения г/ис-регуляторных участков в минимальном промоторе генов Stellate был применен метод гель-шифта (gel shifting, EMSA). В качестве зондов были использованы радиоактивно меченые по 5 -концу двуцепочечные олигонуклеотиды длиной 27-37 нт, полностью перекрывающие последовательность минимального промотора — Stel, Ste2, Ste3 и Ste4 (рисунок 15).
В качестве белкового экстракта мы использовали ядерный экстракт семенников самцов дикого типа (линия yw), где экспрессия генов Stellate подавлена. Мы исходили из предположения, что транскрипция генов Stellate идет на одинаково высоком уровне как в линии yw, так и в линии cry. На настоящий момент нет данных о котранскрипционном саилесинге генов Stellate, поскольку главным участником этого процесса является белок PIWI (Le Thomas et al, 2013), мутации по которому не приводят к формированию мутантного фенотипа Stellate (Vagin et al, 2006), и который в сперматоцитах, где экспрессируются гены Stellate, не обнаружен. Кроме того, согласно данным Kotelnikov et al, 2009 регуляция экспрессии генов Stellate осуществляется преимущественно на посттранскрипционном уровне, поскольку на фоне crystal не изменяется количество несплайсированных транскриптов, тогда как количество сплайсированных возрастает.
Метод гель-шифта основан на детекции изменения подвижности радиоактивно меченого зонда при взаимодействии с белками. Если белки, взаимодействующие с данным зондом, отсутствуют, то он будет двигаться в геле без задержки (см. дорожки №1, 5, 9 и 13 без экстракта на рисунке 17). Если один или несколько белков взаимодействуют с зондом, его подвижность снижается. На проявленном радиоавтографе можно видеть формирование одной или нескольких полос с разной подвижностью (например, дорожки №2, 6 и 14 на рисунке 17).
Мы детектировали эффективное связывание зондов Stel, Ste2 и Ste4 с белками после инкубации с ядерным экстрактом семенников самцов дикого типа с формированием специфичных ДНК-белковых комплексов с одинаковой электрофоретической подвижностью (далее обозначен как С1) (рисунок 17 дорожки №2, 6 и 14). Важно отметить, что для зонда Ste2 характерно образование двух комплексов, помимо комплекса С1, мы детектировали также формирование комплекса С2, обладающего большей электрофоретической подвижностью (рисунок 17 дорожка №6).
Специфичность обнаруженных ДНК-белковых комплексов была продемонстрирована так же с помощью гель-шифта. В каждом из трех случаев добавления 50-кратного избытка немеченого специфического двуцепочечного олигонуклеотида было достаточно для эффективного подавления формирования комплекса (рисунок 17 дорожки №3, 7 и 15), тогда как добавление такого же количества немеченого неспецифического двуцепочечного олигонуклеотида не оказывало влияния на связывание зондов (рисунок 17 дорожки №4, 8 и 16). В качестве неспецифического олигонуклеотида была использована последовательность SteO, расположенная в промоторе Stellate непосредственно перед зондом Stel.
Помимо основных комплексов С1 и С2 мы наблюдали формирование других ДНК-белковых комплексов, однако сигнал от таких комплексов был значительно слабее, кроме того, добавление избытка немеченых как специфических, так и неспецифических олигонуклеотидов эффективно предотвращало появление сигнала от таких комплексов. Например, комплексы, образующиеся с зондом Ste3 (рисунок 17 дорожка №10), исчезают как при добавлении избытка немеченого Ste3 (рисунок 17 дорожка №11), так и при добавлении избытка неспецифического олигонуклеотида SteO (рисунок 17 дорожка №12). Поэтому, мы предположили, что такие ДНК-белковые взаимодействия специфичными не являются. дорожка
Поскольку все три ДНК-белковых комплекса обладали одинаковой подвижностью в геле, мы предположили, что один и тот же транскрипционной фактор из ядерного экстракта семенников связывается с одинаковыми г/ис-регуляторными сайтами в каждом из трех зондов.
При взаимодействии с ядерным экстрактом семенников зонд Ste2 формирует ДНК-белковый комплекс с наибольшей интенсивностью сигнала. Этот зонд несет палиндромную гексануклеотидную последовательность CACGTG, т.е. содержит известную регуляторную последовательность - Е-бокс (Е-бокс 2, -47 —42 нт). Присутствие данной последовательности также было предсказано с помощью программы TESS (рисунок 16, последовательность подчеркнута).
С помощью выравнивания последовательностей зондов Stel и Ste 4 относительно Ste2 мы также обнаружили в их составе по одному вырожденному непалиндромному Е-боксу -CATCTG (Е-бокс 1, -87 - -82 нт) и CAAGTG (Е-бокс 3, +18 - +23 нт) соответственно (рисунок 18, рисунок 16 - соответствующие последовательности выделены). И если Е-бокс 1 был предсказан программой TESS в том же месте от -87 до 82 нт, то Е-бокс 3 программа TESS не обнаружила.
Таким образом, мы предварительно картировали три потенциальных г/ис-регуляторных участка в минимальном промоторе гетерохроматиновых генов Stellate, два из которых совпали с предсказанными биоинформатически (рисунок 16, последовательности подчеркнуты). Затем мы проверили, насколько тканеспецифичным является фактор, взаимодействующий с регуляторными участками в минимальном промоторе генов Stellate. Для этого мы провели гель-шифт эксперименты с ядерными экстрактами из соматических тканей. Так гель-шифты с ядерными экстрактами из эмбрионов (0-12 часов) (рисунок 19) и из голов мух (рисунок 20) демонстрируют формирование ряда других комплексов с отличной от С1 электрофоретической подвижностью.
Результаты гель-шифта с мечеными зондами Stel, Ste2, Ste3 и Ste4. В ядерном экстракте семенников детектируется образование одного ДНК-белкового комплекса С1 с зондами Stel, Ste2 и Ste4, тогда как в ядерном экстракте 0-12 часовых эмбрионов формируется несколько комплексов с различной подвижностью со всеми зондами. При этом в ядерном экстракте из голов, по-видимому, содержится неизвестный фактор, который специфически взаимодействует с зондом Ste3 (рисунок 20), поскольку при добавлении избытка неспецифического конкурента комплекс не разрушается, тогда как добавление избытка «холодного» Ste3 приводит к полному исчезновению этого комплекса. Возможно, этот фактор является транскрипционным репрессором, поскольку в головах гены Stellate, по-видимому, экспрессируются на чрезвычайно низком уровне, что не позволяет детектировать их белковый продукт (Egorova et al, 2009). Таким образом, мы показали, что белковый фактор, взаимодействующий с зондами Stel, Ste2 и Ste4, по-видимому, является тканеспецифичным, он содержится в семенниках, но не в соматических тканях Drosophila melanogaster.
Иммунизация мышей рекомбинантными белками 6His-fUSF и 6HisUSF и получение антисывороток
Выбор зондов для анализа промоторов генов fiNACtes2 и fiNACtes4 с помощью гель-шифта. Последовательности Е-боксов 1 и 2 приведены в красных рамках. Зонд NAC1 частично перекрывается с зондом Stel и несет точечную замену центрального С на Т (выделено синим шрифтом) в Е-боксе 1. Зонд NAC2 содержит область, перекрывающуюся с зондом Ste2. Серым цветом показан фрагмент 16 нт с Е-боксом 2 в зонде Ste2, отсутствующий в промоторах генов fiNACtes2 и fiNACtes4, что приводит к возникновению AT-богатого участка в зонде NAC2 (выделен жирным шрифтом).
Мы обнаружили, что при добавлении к ядерному экстракту семенников зонда NAC1 формируется ряд комплексов с различной подвижностью (рисунок 38, левая панель). Однако при добавлении как избытка немеченого специфического зонда NAC1, так и неспецифических зондов SteO и Ste2, сигнал от таких комплексов исчезает, что свидетельствует об их неспецифичности.
Таким образом, точечная замена в Е-боксе 1 полностью разрушает сайт связывания для dUSF в промоторах генов fiNACtes2 nfiNACtes4.
Тогда как, при добавлении зонда NAC2, соответствующего области с делецией 17 нт, в ядерном экстракте семенников образуется специфичный ДНК-белковый комплекс СЗ (рисунок 38, правая панель). Специфичность комплекса СЗ была продемонстрирована с помощью гель-шифта. При добавлении 100-кратного избытка немеченого специфичного олигонуклеотида NAC2 комплекс СЗ не формировался, а при добавлении такого же количества избытка немеченого олигонуклеотида Ste2 так же не разрушало комплекс СЗ, что свидетельствует о том, что dUSF с последовательностью NAC2 так же не взаимодействует. Результаты гель-шифта с зондами NAC1 и NAC2. В ядерном экстракте семенников содержится белковый фактор, который специфично взаимодействует с зондом NAC2 и образует комплекс СЗ. Добавление 100-кратного избытка немеченого специфичного нуклеотида подавляет образование комплекса, добавление такого же количества неспецифичного нуклеотида не нарушает формирование СЗ, что свидетельствует о его специфичности. Добавление 100-кратного избытка немеченого Ste2 (с совершенным Е-боксом), также не нарушило формирование комплекса.
Мы предполагаем, что этот элемент с возможной крестообразной структурой может представлять новый недавно возникший в процессе эволюции генных семейств Ste-Su(Ste) и fiNACtes сайт связывания для белков класса AT-hook.
В соматических клетках Drosophila гены, расположенные в Х-хромосоме, подвергаются дозовой компенсации, т.е. в соматических клетках у самцов активность генов в единственной Х-хромосоме вдвое выше, чем каждого из генов в Х-хромосоме самок. Дозовая компенсация обеспечивается привлечением к Х-хромосоме самца комплекса белков MSL (male-specific lethal) и ацетилированием гистона Н4 по положению К16 (ацетил-Н4К16) (Gelbart and Kuroda, 2009; Avner and Heard, 2001; Lucchesi et al, 2005). Дозовая компенсация не распространяется на терминальные клетки самцов, где хроматин Х-хромосомы лишен ряда белков комплекса MSL и не обогащен позитивной модификацией ацетил-Н4К16 (Rastelli and Kuroda, 1998; Meiklejohn et al, 2011).
Однако известны данные о необычном поведении трансгенных конструкций, в которых репортерные гены находятся под контролем семенник-специфичных промоторов (Hoyle at al, 1995; Hense et al, 2007). Инсерции трансгенов в эухроматиновые области аутосом по активности значительно превышали Х-хромосомные встройки, что позволило некоторым авторам предполагать существование механизмов преждевременной инактивации всей Х-хромосомы по аналогии с инактивацией Х-хромосомы в пахитене у млекопитающих (Hense et al, 2007; Vibranovsky et al, 2009). Относительно этой теории развернулась широкая дискуссия, вопрос остается открытым и поныне.
Мы решили сравнить активность репортерного гена под контролем промотора гетерохроматиновых генов Stellate (в конструкциях P{Ste703-lacZj и P{6Stellate-Ste703-lacZj) при встраивании трансгенов в аутосомы и Х-хромосому.
Для этого мы определяли активность Р-галактозидазы у одиночных встроек трансгенных конструкций в Х-хромосому и сравнивали ее с активностью одной копии трансгена в аутосомах, т.е. проводили сравнение активности Р-галактозидазы у гемизигот. Было обнаружено, что экспрессия трансгенов в Х-хромосоме, снижена на 53-63%, по сравнению с экспрессией таких же трансгенов, локализованных в аутосомах (рисунок 39).
Анализ промоторных областей, определяющих семенник-специфичную транскрипцию генов, свидетельствует об относительно малом их размере в сравнении с промоторами генов, активных в соматических тканях (White-Cooper, 2010, таблица 6). В данной работе функционально охарактеризован минимальный проксимальный промотор, отвечающий за семенник-специфичную транскрипцию генов Stellate.
Ранее было показано, что для обеспечения высокоуровневой экспрессии репортерного гена Р-галактозидазы lacZ в семенниках самцов cry Y достаточно 134 нт фрагмента 5 - области гена Stellate (Aravin et al, 2001). Фрагмент гетерохроматиновых генов Stellate размером 134 нт содержит проксимальную область промотора размером 101 нт в 5 -области перед стартом транскрипции (TSS) и 33 нт 5 -транскрибируемой области, включающую стартовый кодон AGT, слитый с ОРС lacZ. Этот промотор не содержит канонических TATA - или СААТ-боксов, характерных для многих эукариотических промоторов, однако содержит последовательности Inr и DPE (рисунок 15; Kutach and Kadonaga, 2000).
