Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение механизма распространения вирусной инфекции в растении-хозяине является одной из ключевых проблем современной фитовирусологии, открывающей фундаментальные подходы к пониманию вирусоустойчивости растений и получению новых вирусоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур. С другой стороны, в силу простоты организации вирусы растений служат удобной экспериментальной системой для изучения репликации и экспрессии вирусных геномов вообще.
Для активного межклеточного транспорта вирусного генома из зараженной клетки в соседнюю здоровую, происходящего в растениях через плазмодесмы, необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) (Atabekov and Dorokhov, 1984; Atabekov and Taliansky, 1990). Вирусные транспортные белки, как принято считать в настоящее время, модифицируют и используют клеточную систему активного транспорта молекул растения-хозяина. В связи с этим, изучение вирусных ТБ и РНК-белок и белок-белковых взаимодействий важно для понимания процессов межклеточных взаимодействий в растениях.
Основными объектами настоящей работы служили вирусы, принадлежащие к трем таксономическим группам: ТоЪато-, Вгото- и Luteoviruses. Организация геномов вирусов этих групп и их биологические особенности различны. Тем не менее, во всех трех группах межклеточный транспорт обеспечивается ТБ.
Специфическое взаимодействие нуклеиновой кислоты с белком является составной частью самых разных биологических процессов, к которым относится синтез белков и нуклеиновых кислот, самосборка надмолекулярных структур и т.д.
Удобной моделью для изучения РНК-белковых и белок-белковых взаимодействий является вирус табачной мозаики (tobacco mosaic virus, TMV). Преимущество TMV заключается в простоте строения (TMV состоит всего из двух компонентов: одноцепочечной РНК и одного типа структурного белка) и в возможности осуществления его сборки in vitro из РНК и белка (Fraenkel-Conrat and Williams, 1955). Для понимания тонких механизмов РНК-белкового узнавания при сборке TMV особый интерес представляет исследование различных мутантов. В связи с тем, что мутант М2519 является температурочувствительным (ts) одновременно по двум функциям (по сборке вирионов и транспорту вирусной инфекции), изучение свойств этого мутанта позволяет расширить наши представления, во-первых, об избирательности нуклеиново-белкового взаимодействия, и, во-вторых, о механизмах транспорта вирусной инфекции в растениях.
Вирус огуречной мозаики (cucumber mosaic virus, CMV) имеет чрезвычайно широкий спектр растений-хозяев и уже только по этой причине представляет большой интерес. Его штаммы обладают различной патогенностью и скоростью распространения по растениям; выяснение причин таких различий имеет не только теоретический, но и практический интерес.
Вирус скручивания листьев картофеля (potato leafroll virus, PLRV) является самым опасным вирусным патогеном картофеля, из года в год нанося значительный экономический ущерб во всём мире. PLRV является флоэмно-ограниченным вирусом, способным репродуцироваться только в клетках флоэмы (проводящей ткани) и не обнаруживаемый в клетках мезофилла. Понимание механизмов распространения внутри растениий, а также механизма переноса инфекции от одного растения к другому растению тлями, необходимо для борьбы с этой вирусной инфекцией.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов сборки вирусных частиц и распространения по растениям представителей трёх семейств фитовирусов.
В ходе работы решались следующие основные задачи:
-
Изучение причин образования дефектных вирусных частиц при сборке мутанта TMV М2519 in vitro при непермиссивной температуре и локализация участков инициации реконструкции в молекуле РНК М2519;
-
Изучение возможности комплементации ts-функций транспорта мутантов TMV М2519 и LSI вирусом-помощником;
-
Изучение влияния транспортного белка TMV трансгенных растений на накопление чужеродного вируса крапчатости красного клевера (red clover mottle virus, RCMV);
-
Изучение влияния нефункциональных и гетерологичных вирусных транспортных белков трансгенных растений на репродукцию TMV;
-
Изучение причин отличий в накоплении CMV, его штаммов и мутантов в различных растениях;
-
Определение возможности комплементации дефектных по транспорту мутантов CMV в трансгенных растениях, экспрессирующих ТБ (За белок);
-
Изучение возможности распростанения флоэмно-ограниченного вируса PLRV из проводящих тканей в клетки мезофилла в присутствии вируса-помощника;
-
Определение участков структурного белка PLRV, имеющих определяющее значение для сборки вирионов, распространения инфекции в растении и переносе вируса тлями.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что при непермиссивной температуре (33С) в клетках растений табака Nicotiana tabacum, зараженных ts-мутантом TMV М2519, синтезируется вирионная РНК и функционально активный структурный белок. В результате реконструкции in vitro при 33 образуются дефектные вирусные частицы (ДВЧ), чувствительные к РНКазе (РНК нормальных вирионов TMV защищена от действия рибонуклеаз). Определено положение чувствительного к действию РНКаз сайта в составе ДВЧ. Показано, что причиной образования ДВЧ является множественная инициация сборки вирионов. Таким образом, можно предполагать, что ts-фенотип сборки этого мутанта обусловлен температурочувствительностью самой молекулы РНК, проявляющейся в одновременном функционировании двух участков инициации реконструкции при непермиссиовной температуре.
В ходе исследований установлено, что функция транспорта (распространение из клетки в клетку) мутантов М2519 и LSI при непермиссиовной температуре может быть комплементирована вирусом-помощником. С другой стороны, комплементировать функцию сборки зрелых вирусных частиц у М2519 вирусом-помощником не удалось. Показано также, что комплементация транспорта может осуществляться не только родственным штаммом тобамовируса, но и таксономически весьма отдаленными вирусами растений, а также гетерологичными траснпортными белками в трансгенных растениях.
Показано, что нефункциональный ТБ, экспрессирующийся в трансгенных растениях, способен подавлять накопление близкородственного вируса, а полноценный ТБ может негативно сказываться на накоплении неродственных вирусов.
Продемонстрирована роль ТБ CMV в процессе транспорта вируса в ряде растений-хозяев, а также способность трансгенных по ТБ растений комплементировать не только различных мутантов CMV с дефектными ТБ , но и ряд других вирусов. В ходе детального изучения процесса формирования делеций в гене ТБ в составе дефектных РНКЗ CMV в трансгенных растениях было обнаружено, что все конечные стабильные формы РНКЗ мутантов имели исходную рамку считывания гена ТБ вне зависимости от характера первоначальной делеций.
Впервые продемонстрировано, что для межклеточного распространения CMV необходим лишь белок оболочки (СР) - но не сформированные вирионы.
С использованием мутантов по структурному белку PLRV определены аминокислотные последовательности, ответственные за сборку полноценных вирионов,
за распространение инфекции в ряде растений-хозяев и за способность этого вируса передаваться от растения к растению вектором-насекомым (тлями).
Практическая значимость работы. Вирус табачной мозаики (TMV), вирус огуречной мозаики (CMV) и вирус скручивания листев картофеля (PLRV) имеют широкий круг растений-хозяев и относятя к числу важнейших патогенов селькохозяйстивенных культур, нанося значительный экономический ущерб. В работе исследованы механизмы сборки вирусных частиц и распространения вирусной инфекции в растениях, понимание которых необходимо для получения новых вирусоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур и новых фундаменталных подходов к проблеме вирусоустойчивости растений в целом. В частности, результаты работы позволяют понять механизм транспорта вирусной инфекции в растениях, пораженных изученными вирусами, выяснить причины различной патогенности и скорости распространения по растениям-хозяевам CMV, механизм переноса PLRV от одного растения к другому растению тлями, что необходимо для борьбы с этой вирусной инфекцией, а также особености распространения вирусной инфекции в трансгенных растениях.
Полученные в работе данные вошли в курсы лекций, читаемых на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Апробация работы. Материалы работы были доложены на II Всесоюзном
симпозиуме «Штаммы вирусов растений» (Елгава, 1981), конференции «Вирусы
микроорганизмов» (Пущино-на-Оке, 1981), IV Советско-Западногерманском
симпозиуме «Структура генома» (Ереван, 1981), совещании ФЕБС «Структура и экспрессия вирусного генома» (Рига, 1991), Симпозиуме X годовщины Центра Сельскохозяйственной Биотехнологии Отто Варбурга «Молекулярная биология в селекции растений: теоретические, практические и легальные аспекты» (Реховот, Израиль, 1994), Конференциях Американского Общества Фитопатологии (Нэшвил, Теннесси, 1993; Монреаль, Канада, 1998; Анахайм, Калифорния, 2004), Конференциях Американского Общества Вирусологов (Мэдисон, Висконсин, 1995; Лондон, Онтарио, Канада, 1996), IX (Глазго, Шотландия, 1993) и X (Иерусалим, Израиль, 1996) Международных Вирусологических Конгрессах.
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 37 работ, в том числе 3 статьи в отечественных журналах, 18 статей в иностранных журналах, 6 статей в составе книг и сборников, 10 сообщений (тезисы конференций).
Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, в котором формулируются цели и задачи исследования, аналитический обзор литературы о сборке, структуре геномов TMV, CMV и PLRV, о комплементационном анализе вирусов растений, описание материалов и методов исследования, экспериментальную часть, обсуждения результатов, выводы и список цитируемой литературы. Общий объем работы составляет ... страниц, включая ... таблиц и ... русунков, список литературы содержит .... названий.
