Содержание к диссертации
Введение
2. Введение 6
2.1. Актуальность темы 6
2.2. Цель и задачи исследования 8
2.3. Научная новизна 9
2.4. Практическая значимость работы 9
2.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту 10
2.6. Апробация работы 10
2.7. Публикации 11
2.8. Объем и структура диссертации 11
2.9. Благодарности 11
3. Обзор литературы... 12
3.1. Бисаитспецифические иммуноглобулины и гибрндомные гибридомы 12
3.2. Применение бисайтспецифнческих антител 15
3.3. Моноклональные антитела в диагностике вирусных болезней 18
3.4. Диагностика КЧС 21
3.5. Применение органических люминофоров в биологии и медицине .26
3.6. Заключение по обзору литературы 30
4. Собственные исследования 31
4.1. Материалы и методы 31
4.1.1. Материалы 31
4.1.2. Методы 36
4.1.2.1. Иммунизация и контроль иммунного ответа у мышей 36
4.1.2.2. Получение и клонирование гибридом 36
4.1.2.3. Изоляция субклонов гибридомных клеток, резистентных к 8-азагуанину и 5-бром-2-дезоксиуридину 37
4.1.2.4. Кариологический анализ гибридомных клеток 37
4.1.2.5. Приготовление культуры клеток мышиных спленоцитарных макрофагов 37
4.1.2.6. Криоконсервирование гибридомных клеток и восстановление их после хранения в замороженном состоянии 38
4.1.2.7. Продукция асцитных жидкостей, содержащих моноклональные антитела 38
4.1.2.8. Double-antigen-вариант иммуноферментного анализа 38
4.1.2.9. Фракционирование иммуноглобулинов методом гельпроникающей хроматографии 39
4.1.2.10. Очистка бисайтспецифических моноклональных антител методом иммуноаффинной хроматографии ...39
4.1.2.11. Электрофорез в ДСН-ПААГ 40
4.1.2.12. Иммуноблотинг 40
4.1.2.13. Иммуноэлектрофорез 43
4.1.2.14. Определение концентрации белка 43
4.1.2.15. Приготовление коньюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой43
4.1.2.16. Определение класса и субкласса моноклонального иммуноглобулина 43
4.1.2.17. Методы статистического анализа 44
5.2. Результаты собственных иследований 45
5.2.1. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к флуоресцеину 45
5.2.2. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к IgG свиньи 47
5.2.2.1. Очистка IgG свиньи 49
5.2.2.2. Иммунизация мышей препаратом IgG свиньи и контроль иммунного ответа 53
5.2.2.3. Видовая специфичность моноклональных антител к IgG свиньи54
5.2.2.4. Диагностическая ценность МКА к IgG свиньи 57
5.2.3. Получение квадром, продуцирующих бисайтспецифические иммуноглобулины к ФИТЦ и IgG свиньи 64
5.2.3.1. Получение субклонов гибридомных клеток с мутантным НАР- фенотипом 65
5.2.3.2. Исследование стабильности HAT' -субклонов 67
5.2.3.3. Получение квадром, продуцирующих бисайтспецифические моноклональные иммуноглобулины 68
5.2.3.4. Частичная очистка бисайтспецифических МКА с помощью одноступенчатой иммуноаффинной хроматографии 69
5.2.3.5. Испытание тест-системы иммуноферментного анализа на модели вируса трансмиссивного гастроэнтерита в биологических объектах на основе бисайтспецифических моноклональных иммуноглобулинов 71
6. Обсуждение 73
7. Выводы 78
8. Практические предложения 79
9. Список цитированной литературы
- Практическая значимость работы
- Применение бисайтспецифнческих антител
- Изоляция субклонов гибридомных клеток, резистентных к 8-азагуанину и 5-бром-2-дезоксиуридину
- Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к IgG свиньи
Практическая значимость работы
Разработка G. Kohler и С. Milstein метода получения МКА явилось прорывом в развитии теории и практике иммунологических исследований, стала толчком в изучении антигенной структуры, картировании антигенных детерминант в первую очередь микроорганизмов [6, 18, 40, 41, 64, 87].
В процессе совершенствования гибридомной технологии был создан новий вид гибридом, так называемые гибридомные гибридомы [19, 82, 83, 93, 100, 107,110].
Методы получения би-АТ делятся на химические генноинженерные и кле-точноинженерные [51]. Химические подходы заключаются в разделении молекулы иммуноглобулина на фрагменты и последующей ковалентной ассоциации их посредством различных кросс линкеров, которая приводит к получению гибридных молекул. В качестве кросс линкеров наиболее часто используются N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionate (SPDP), N,N -o-phenylene-dimale-imide, є-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), 4-(N-male-imido-methyl)-cyclohexane-l-carboxylic acid 3-sulfo-n-hydroxy-succinimide ester (Sulfo-SMCC), N,N -bis(3-maleimido-propionyl)-2-hydroxy-l,3-propanediamine и др. [43, 44,52,66,88,89].
Конструирование би-АТ по методу Brennan М. et al. [39] основано на химической реассоциации моновалентных фрагментов Ig, диссоциированных на субъединицы посредством избирательного S-сульфонирования, в результате которого тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов не разделяются, но разрушаются дисульфидные связи между тяжелыми цепями в районе шарнирного участка. Полученные фрагменты модифицируют в -SH и З-карбоксил-4-нитро-тиофенолатную формы в присутствии избытка 5,5 -дитио-бис-(2 13 нитробензойной кислоты) и используют затем для рекомбинации. Реакцию рекомбинации проводят с помощью электродиализа, удаляющего высвобождающиеся ионы S-тиофенолата. Димерные формы гибридных Ig очищают с помощью гельпроникающей хроматографии. Выход основного продукта по результатам FPLC составляет 45-80 %. Основными недостатками химических методов являются высокие экономические затраты, частичная потеря активности Ig в результате денатурации и/или конформационных дислокаций.
Генно-инженерный метод получения бисайтспецифических антител базируется на современных достюкениях молекулярной биологии. Принцип метода заключается в конструировании плазмидных или фаговых векторов и трансдук-ции последних в клетки-реципиенты [4, 7-9, 50, 86, 121].
Для клонирования фрагментов генов иммуноглобулинов, используют главным образом челночные векторные плазмиды такие как pSV2 gpt и pSV2 neo [8, 9]. Обе плазмиды содержат ранний промотор и участок начала репликации ДНК из вируса SV40 и ген ампициллиназы, обеспечивающий резистентность к ампициллину при амплификации и скрининге клонов в Е. coli. Наиболее часто в качестве клеток-реципиентов используют линии миеломных клеток Ag8 Х63, J558L и SP2/0, а также полученные на их основе клоны гибридом.
Клеточно-инженерный метод конструирования биологических систем, продуцирующих би-МКА, основан на классических приемах фузионной и селекционной техники, принятых в гибридомной технологии. Использование техники клеточного слияния с целью получения гибридомных гибридом, секрети-рующих би-МКА, было впервые описано в 1983 г Milstein С. и Cuello А.С. [81].
Основным преимуществом данного метода является возможность конструирования стабильных клеточных линий - продуцентов, в которых синтез и секреция би-МКА происходит «естественным» путем. Это особенно важно в тех случаях, когда необходимо присутствие интактной части Fc-фрагмента в молекуле иммуноглобулина [38, 124]. Получение квадром, по сравнению с методикой получения триом, имеет несколько существенных преимуществ, заключающихся в том, что используются две стабильные линии гибридомных клеток. Причем МКА, продуцируемые ими, охарактеризованы заранее по своим иммунохимическим свойствам: антигенной специфичности, аффинности антигенсвязывающих сайтов, изотипу Н и L-цепей [123].
Классическая техника слияния клеток с целью получения гибридомных гибридом свободна от недостатков химического и трудностей генно-инженерного метода. Вместе с тем она требует наличия необходимых родительских клеточных линий, чувствительных к селективным средам или определенного подхода к постфузионному отбору гибридов.
При получении исходных клонов родительских гибридом используется НАТ-среда, и большинство клеток в данных популяциях имеют HAT -фенотип. По этой причине провести позитивную селекцию гибридов между различными гибридомами с использованием традиционной процедуры не возможно. В современной литературе описываются различные подходы к селекции этих клеточных гибридов путем модификации гено- и/или фенотипа исходных партнеров, или путем введения в них "временных витальных маркеров" позволяющих сортировать гибриды с применением современных проточных цитофлюоримет-ров.
Применение бисайтспецифнческих антител
Поликлональные антисыворотки нестандартны по уровню активности и очень часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным и даже невозможным их использование в высо-кочувствительных тест системах.
Поскольку все МА одного гибридомного клона имеют одинаковую специфичность, одинаковы по аффинности, относятся к одному классу и подклассу иммуноглобулинов, они наиболее приемлемы для разработки высокочувствительных, специфичных и воспроизводимых методов диагностики болезней, в особенности когда необходима точная дифференциация антигенно родственных возбудителей болезней.
Внедрение гибридомной технологии послужило мощным импульсом для развития методологии создания тест-систем нового поколения, свидетельством чего являются многочисленные публикации об использовании МА в качестве диагностических реагентов при герпесвирусных инфекциях, гепатите А и В, бешенстве, оспе, клещевом энцефалите, кори, чуме КРС, лейкозе птиц и КРС, гриппе птиц, ЛДР, ВГБК и других вирусных, бактериальных и паразитарных инфекциях [27, 26, 46, 58, 70, 84, 90, 102, 125].
Полученные моноклональные антитела против изотипов иммуноглобулинов крупного рогатого скота, специфически реагирующие с IgG, IgGl, IgG2, применены для приготовления конъюгатов и выявления антител к ротавирусу иммуноферментным методом. Установлено, что моноклональные антитела против изотипов иммуноглобулинов крупного рогатого скота могут быть успешно использованы при изучении гуморального местного иммунитета телят, инфицированных ротавирусами [116]. Получены и использованы в диагностических целях моноклональные антитела к коронавирусу, вызывающему энтерит [1, 98, 99] , и к вирусу, вызывающему диарею крупного рогатого скота [59]. Моноклональные антитела в настоящее время широко используются для изучения различных вирусных антигенов. Это позволило точнее идентифицировать их структуру, изучить антигенные домены и определить последовательности, ответственные за инфекционность, сделало возможным синтез пептидов, способных индуцировать специфический иммунный ответ. С помощью моноклональ-ных антител разработан высокочувствительный вариант иммуноферментного метода для идентификации вируса лейкоза крупного рогатого скота [96], дифференциации различных штаммов вируса бешенства [25, 105], обнаружения присутствия общих и специфических детерминант на частицах 146S и 12S вируса ящура [80]. Использование МА в серологических реакциях позволило провести дифференцировку близкородственных вирусов и послужило основой для разработки высокочувствительных и специфичных методов диагностики ряда вирусных болезней.
Так, актуальная для практической ветеринарии проблема дифференциации возбудителей КЛО, ЭГБО и БИ была решена с применением МА. Эти вирусы антигенно родственны между собой, антитела вырабатываемые животными в ответ на инфицирование одним вирусом могут перекрестно реагировать с другим вирусом. Поэтому для постановки точного диагноза необходимо тщательно идентифицировать выделенный вирус. Применяемые для этих целей серологические методы на основе поликлональных антител не позволяют четко дифференцировать эти вирусы [58].
Моноклончльные антитела применяют при диагностике инфекционных болезней в качестве антиглобулиновых реагентов, конъюгированных с флюоро-хромом, ферментом или изотопом для выявления специфических антител. Известно, что первичный антительный ответ на воздействие антигена характеризуется увеличением специфических иммуноглобулинов класса М. Выявление антител класса М приобрело большое значение в серологических исследованиях. Этот метод позволяет диагностировать острую вирусную инфекцию. Метод иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител использован для выявления IgM-специфических антител к респираторному син-цитиальному вирусу крупного рогатого скота. Этот метод позволяет выявлять ранние стадии инфицирования животных, определять кинетику антителообра-зования в поствакцинальный и постинфекционный периоды [120].
Моноклональные антитела к IgM можно использовать для обнаружения IgM-содержащих клеток в тканях, IgM в сыворотке крови и клеток, несущих на своей поверхности IgM. Важная область применения моноклональных антител к IgM — диагностика ранних форм инфекции. Моноклональные антитела к субклассам иммуноглобулина крупного рогатого скота получены слиянием клеток селезенки иммунизированных мышей указанными антигенами с клетками мие-лом.
Моноклональные антитела к субклассам иммуноглобулинов применяются с целью выделения и очистки IgGl и IgG2 крупного рогатого скота, а также для замены поликлональных антисывороток в иммунологических исследованиях, в том числе и для оценки иммунного статуса организма животных.
Следует отметить, что гибридомная технология открывает новые возможности по широкому использованию антител для диагностики и лечения в качестве высокоэффективных и легко получаемых в препаративных количествах реагентов, расходы на получение которых с развитием соответствующих технологий постоянно снижаются. Моноклональные антитела нашли применение в научной практике как диагностические реагенты в серологических реакциях, применяемых для типирования клеток крови и тканей, идентификации микроорганизмов и онкогенов.
Изоляция субклонов гибридомных клеток, резистентных к 8-азагуанину и 5-бром-2-дезоксиуридину
Для исследования хромосомного набора гибридомные клетки, пассируемые в культуре, засевали с начальной плотностью 5x10 клеток/см; и после инкубации в течение суток при 37 С обрабатывали 30-50 мин при той же температуре колхицином в конечной концентрации 0,3 мкг/см [85]. Затем клетки выдерживали 10 мин в 0.5 %-ном растворе калия хлорида при температуре 37 С и осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 800 об/мин с последующей фиксацией смесью метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 на холоду. Осадок ресуспендировали в фиксаторе и наносили каплями на влажные охлажденные стекла. Препараты высушивали на воздухе в течение 7-ми суток и окрашивали по Романовскому-Гимза. В каждом случае анализировали не менее 50 метафазных пластинок.
Культуру клеток спленоцитарных макрофагов аутбредных мышей готовили по общепринятой методике [103]. Перед использованием культуру макрофагов проверяли на отсутствие контаминации микрофлорой методом световой микроскопии.
Криоконсервированию подвергали культуры гибридомных клеток, находящиеся в логарифмической фазе роста, образующие сплошной монослой, или клетки, выращенные в перитонеальной полости мышей сингенной линии при получении асцитных жидкостей. Перед замораживанием клетки подвергали микроскопическому исследованию на отсутствие контаминации микрофлорой. Количество живых клеток оценивали по эксклюзии трипанового синего. Крио-консервацию клеток и восстановление их после хранения в условиях низких температур (минус 70 С, минус 196 С) осуществляли по методу, описанному Oi V.T., Herzenberg L.A. [81].
Асцитические жидкости, содержащие моноклональные антитела, получали по методам, описанным Новохатским А.С. с коллегами [25], а также рядом других авторов [24, 57].
Полистироловые 96-луночные пластины сенсибилизировали, внося в лунки по 100 мкл свиных IgG в концентрации 5-10 мкг/лунку в 0.05 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе рН 9.6 и инкубировали их в течение 18-20 ч при 4 С. Затем пластины отмывали водопроводной водой и делали блокировку лунок по 200 мкл ФБР-ТК в течение 1 часа при 37 С. После отмывки пластины в каждую лунку добавляли по 100 мкл культурального супернатанта квадром или фракции аффинно очищенных би-МКА.Пластины инкубировали в течение 1 часа при 37 С, после чего отмывали. Далее вносили в лунки по 100 мкл рабочего разведения конъюгата ФИТЦ-пероксидаза и инкубировали пластины 40 мин. при 37 С. Все разведения антигена, антител и конъюгата готовили на ФБР-ТК с добавлением 0.1 % твина-20. Затем десятикратно отмывали водопроводной водой и вносили в лунки по 100 мкл субстратного раствора. Через 60 мин пластины денситометрировали с использованием 8-канального сканирующего спектрофотометра Multiskan Р340 при X — 405 нм. Учет результатов проводят по соотношению величин экстинкции в лунках с исследуемым и контрольным (свежая культуральная среда) материалом (S/N). Положительными пробы исследуемого материала считают в том случае, если это соотношение больше или равно 2.1.
Глобулиновые фракции из асцитических жидкостей выделяли общепринятым методом солевой преципитации (сульфатом аммония 50 %-го насыщения) [31]. Преципитат собирали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 мин., супернатант декантировали. Осадок растворяли в минимальном объеме ФБР и осветляли центрифугированием при тех же режимах.
Осветленный супернатант вносили в колонку (2.6x95 см) с ультрагелем АсА34, уравновешенную тем же буферным раствором, установив скорость потока в пределах 0.5 см7мин с использованием соответствующего хроматогра-фического оборудования фирмы Pharmacia - LKB. По окончании хроматографии колонку регенерировали стартовым буферным раствором, а препарат МКА концентрировали и переводили в 0.05 М Na-фосфатный буферный раствор, рН 7.3, диализом, сохраняли при 4 С в присутствии 0.08 % NaNs.
Антигенную специфичность полученных фракций антител подтверждали с помощью твердофазного непрямого варианта энзимного иммуноанализа.
Бисайтспецифические МКА из культурального супернатанта или асцитиче-ской жидкости очищали иммуноаффинной хроматографией с использованием антигенного иммуносорбента [10]. Для приготовления последнего антиген (пе-роксидаза хрена, RZ 3.0; Sigma, USA) коныогировали с CNBr-активированной сефарозой-4В, руководствуясь рекомендациями фирмы-изготовителя. Перед хроматографией тотальную фракцию иммуноглобулинов осаждали (NH4)2S (50 % насыщения). Преципитат собирали центрифугированием (2000 об/мин, 20 мин.), растворяли в минимальном объеме 0.05 М Na-фосфатного буферного раствора, рН 7.3, содержащем 0.15 М NaCl и 0.05 % твина-20 (стартовый буферный раствор), и вносили в колонку (1x5 см) с иммуносорбентом, уравновешенным тем же буферным раствором, установив скорость потока в пределах 10-15 см7час. Затем колонку промывали стартовым буферным раствором до отсутствия поглощения при 280 нм. Элюентом сорбированных на иммобилизованном антигене антител служил 0.1 М HCI-глициновый буфер, рН 2.2. Элюат нейтрализовали 0.5 М трис-НС1 буферным раствором, рН 8.0. Колонку с иммуносорбентом регенерировали стартовым буферным раствором, а препарат МКА концентрировали и переводили в 0.05 М Na-фосфатный буферный раствор, рН 7.3, диализом и сохраняли при 4 С в присутствии 0.08 % NaNs.
Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к IgG свиньи
Использование гибрид-гибридомных клеток как модельных систем для исследований открывает перспективы в изучении многих фундаментальных вопросов генетики и физиологии клетки, а также расширения наиболее важных задач прикладной вирусологии - конструирование клеток продуцентов бисайт-специфических моноклональных антител, которые могут послужить основой для приготовления диагностических и терапевтических препаратов векторного действия [107].
Основной трудностью при получении квадром является негативная селекция исходных родительских партнеров-гибридом по причине HAT - фенотипа последних. В настоящее время для получения квадром используют две стратегии гибридизации клеток.
Первый основан на гибридизации одного из родительских партнеров, несущего два фенотипических маркера, один из которых, как правило, рецессивен, с клетками другого родительского партнера "дикого типа". Второй - на гибридизации клеток исходных клонов, каждый из которых имеет по одному доминантному или рецессивному маркеру. Методически придание исходным гибри-домам маркерного фенотипа можно подразделить на четыре подхода: путем трансгеноза, посредством селекции к токсическим препаратам, модификацией внешних и внутренних белков клетки флюоресцирующими красителями, обработкой клеток цитотоксическими прпаратами необратимого действия, а также их сочетанием [33, 63, 78]. В 60-70-х годах был предложен ряд систем селекции клеточных гибридов, основанных на использовании для слияния генетически маркированных линий клеток. Наибольшее распространение получила т. н. система аминоптеринового блока основного пути биосинтеза ДНК с использованием НАТ-среды [73, 74]. В настоящее время эта система используется в подавляющем большинстве работ по получению гибридных клеток. С целью изоля ции квадром по данной системе селекции одной из исходных гибридом придают дефект по тимидинкиназе, а другой - дефект по гипоксантингуанинфосфорибо-зилтрансферазе, фенотипически проявляющиеся в способности клеток к пролиферации в присутствии 5-бром-2-дезоксиуридина (5-BDU) и 8-азагуанина (8-AG), соответственно, что и обеспечивает чувствительность их к НАТ-среде.
При слиянии таких клеток происходит комплементация ферментных дефектов, обеспечивающая выживание гибридов.
С целью получения генетически маркированных субклонов гибридомных клеток с фиксированным фенотипом, пригодных для получения гибридомных гибридом (квадром) с селекцией только на НАТ-среде на основе полученных ранее клонов мышиных гибридом, продуцирующих МКА к ФИТЦ и IgG свиньи проводили ступенчатую селекцию с аналогами пуриновых-8-AG (10-100 мкг/см ) - и пиримидиновых - 5-BDU (10-300 мкг/см )-нуклеотидов.
На основе полученных ранее клонов гибридом F7 и 3D1 к флуоресцеину, путем ступенчатой селекции провели их адаптацию к 5-бромдезоксиуридину (10-300 мкг/см"1) (табл.5). По окончании адаптации был проведен контрольный высев на НАТ-среде, действие которой вызвало 100 %-ную гибель клеток. Из этого можно сделать следующий вывод: получены субклоны клеток мышиных гибридом с фиксированным фенотипом (присутствием фермента ГГФРТ). При этом такие признаки, как онкогенность, способность индуцировать асцитные формы опухолей при инокуляции гаплоидентичным мышам, сохранились, что свидетельствует о детерминированности мутантного фенотипа по доминантному типу.
Аналогично, на основе полученных ранее клонов гибридом Е11 и В6 к IgG свиньи путем ступенчатой селекции в присутствии 8-азагуанина (10-100 мкг/см ), были получены 8-AG субклоны (табл. 6).
Исследовали стабильность HAT -субклонов. В качестве сравнительных параметров использовали характеристики специфичности МКА, скорости клеточной пролиферации и уровня антителопродукции, онкогенного действия в организме гаплоидентичных мышей.
Из данных, представленных в таблице 7, видно, что такие исходные признаки как специфичность продуцируемых клетками моноклональных иммуноглобулинов, пролиферация и антителопродукция клеток мутантных субклонов, а также способность индуцировать асцитные формы опухолей у сингенных животных полностью сохраняются.
Анализ экспрессии клетками мутантных субклонов HAT -фенотипа и, следовательно, селективных маркерных свойств, продемонстрировал их стабильность в процессе культивирования in vitro и in vivo в течение 24 месяцев (срок наблюдения). Через каждые три месяца при культивировании этих клеток на среде с HAT или одним из двух токсических аналогов нуклеотидов, входящий в ее состав, при концентрации 10э-10 клеток, появления ревертантов не обнаружено.
Таким образом, доказано сохранение культурально-морфологических, про-лиферативных, селективных маркерных свойств и характеристик антителопродукции мутантных субклонов гибридомных клеток в процессе культивирования in vitro и in vivo. При культивировании мутантных субклонов на селективной НАТ-среде, для исследованного числа клеток (10э-10 ) ревертанты не обнаружены.
Получение биологической системы - квадромы, продуцирующей би-МКА к иммуноглобулину G свиньи и флуоресцеину, проводили на основе слияния двух антителопродуцирующих мутантных субклонов гибридных клеток.
Процедуру слияния проводили при помощи ПЭГ-1500 [65]. Клетки родительских мутантных субклонов гибридных клеток 3D1 и В6 брали в соотношении 1:1. Образование клонов наблюдали на 5-7 сутки. Скрининг проводили твердофазным непрямым иммуноферментным анализом с использованием антимышиных иммуноглобулинов кролика меченных пероксидазой [34]. Для сенсибилизации полистерола использовали раздельно IgG свиньи и ФИТЦ-БСА в концентрации 5-Ю мкг/лунку.
В результате клонирования в полужидком агаре и дальнейшего культивирования из общего количества гибридных гибридом были отобраны две квадромы 4В6 и 14F10, стабильно продуцирующие би-МКА к IgG свиньи и флуоресцеину [53]. Титры антител в культуральной жидкости к IgG свиньи были 1:256, а к флуоресцеину - 1:27-1:81. В асцитической жидкости титр антител к IgG свиньи квадромы 4В6 составил 1:8000-1:128000, квадромы 14F10- 1:16000-1:256000, а к флуоресцеину 1:4000-1:16000 и 1:4000-1:32000, соответственно.
Клоны квадром отличались высокой стабильностью. 100 % субклонов, по-лученых при вторичном реклонировании, секретировали би-МКА.
На основании проведенных исследований были разработаны «Методические рекомендации по клеточно-инженерному конструированию гибридомных гибридом (квадром, триом) - продуцентов бисайтспецифических моноклональ-ных иммуноглобулинов», утвержденные директором ВНИИВВиМ 28 июня 2001 г.
