Введение к работе
Актуальность проблемы. Биогенные полиамины спермин (Spm), спермидин (Spd) и их предшественник путресцин (Put) присутствуют в клетках всех типов в mM-mM концентра-циях и жизненно необходимы для их нормального роста. Высокое внутриклеточное содержа-ние Spm и Spd определяет разнообразие их клеточных функций, многие из которых остаются все еще малоизученными, что обеспечивает поступательное развитие этой области биохимии (см.обзор: Casero R.A. & Pegg A.E. In: Polyamines: Methods and Protocols, Methods in Molecu-lar Biology, 720, 3-35. Springer Science+Business Media, LLC. 2011). При физиологическом значении рН полиамины существуют в форме поликатионов. Spd и Spm взаимодействуют с ДНК, РНК и нуклеопротеидами, служат регуляторами активности топоизомераз, рестриктаз, а также ферментов биосинтеза ДНК и РНК. Полиамины участвуют в регуляции транспорта Са2+ митохондриями, являются модуляторами NMDA рецептора и эффекторами транспорта K+, а также регулируют процесс полимеризации тубулина. Spd служит единственным доно-ром аминобутильного остатка, необходимого для посттрансляционной модификации (прев-ращение остатка лизина в гипузин – Ne-(4-амино-2-оксибутил)-L-лизин) фактора инициации трансляции eIF-5A, жизненно необходимого для всех эукариот. Наконец, Spd входит в состав трипанотиона – важнейшего метаболита протозойных паразитов.
Аналоги Spm и Spd являются одним из основных инструментов исследования фермен-тов метаболизма и клеточных функций полиаминов. Соответственно, направленное создание новых биологически активных производных полиаминов, расширение семейства весьма не-многочисленных функционально-активных миметиков частично взаимозаменяемых Spm и Spd, изучение взаимодействия этих аналогов с ферментами метаболизма полиаминов, а так-же их активности на уровне культуры клеток и in vivo представляется вполне актуальным.
Целью работы являлись: (i)- разработка удобных способов получения системы неиз-вестных ранее С-метилированных аналогов Spd, N1-ацетил-Spd и Spm; (ii)- синтез неописан-ных ранее оптических изомеров a-метилполиаминов; (iii)- создание нового типа зарядодефи-цитного аналога Spm (SpmTrien) на основе триэтилентетрамина, а также ацетильных и бис-этильных производных SpmTrien; (iv)- получение оригинальных биологически активных гид-роксиламин содержащих аналогов Spm и агматина (последнее потребовало создания нового метода гуанидилирования аминооксигруппы); (v)- исследование взаимодействия С-метили-рованных аналогов полиаминов и SpmTrien с ДНК; (vi)- изучение взаимодействия синтезиро-ванных веществ с ферментами метаболизма полиаминов и их эффектов в культуре клеток и in vivo.
Научная новизна. Разработаны удобные схемы синтеза системы неизвестных ранее С-метилированных аналогов Spd, Spm и N1-ацетил-Spd, позволяющие получать эти соедине-ния с высокими выходами из доступных исходных веществ и в количествах, необходимых для проведения экспериментов in vivo. Получены неизвестные ранее оптические изомеры a-метилполиаминов и N-ацетил-a-MeSpd. Синтезирован оригинальный зарядодефицитный аналог Spm – SpmTrien и его биохимически-значимые производные. Разработаны удобные схемы синтеза аминоокси- и окса-аналогов Spm, а также бисубстратных ингибиторов спермин/спермидин-N1-ацетилтрансферазы (SSAT) на основе аминоокси аналогов Spd и Spm. Впервые показано, что трифлат ди-Вос-гуанидина количественно гуанидилирует аминооксигруппу, что позволило получить ряд функционально-замещенных алкоксигуани-динов, включая и неизвестные ранее гидроксиламин-содержащие аналоги агматина.
Исследовано взаимодействие синтезированных С-метилированных производных Spd и Spm с ферментами метаболизма полиаминов, их влияние на антизим-зависимые пути регу-ляции гомеостаза полиаминов, а также способность аналогов восстанавливать рост клеток с истощенным пулом полиаминов. Оказалось, что биохимические свойства аналогов определя-ются положением метильной группы. Введение метильной группы в a-положение обеспечи-вает катаболическую устойчивость a-метилспермидина (a-MeSpd), но не a-метилспермина (a-MeSpm). Показано, что среди аналогов этого типа лишь g-метилспермидин (g-MeSpd) является функционально-активным метаболически устойчивым миметиком спермидина (g-MeSpd не является субстратом ни SSAT, ни сперминсинтазы, но способен восстанавливать рост клеток с истощенным пулом полиаминов), что открывает новые возможности для иссле-дования клеточных функций катаболически неустойчивых и легко взаимопревращающихся Spm и Spd. Найдено, что b-метилспермидин (b-MeSpd), в отличие от подавляющего боль-шинства аналогов Spd и остальных С-метилированных производных Spd, практически не ин-дуцирует биосинтез антизима – небольшого белка блокирующего проникновение полиами-нов в клетку, а также вызывающего диссоциацию орнитиндекарбоксилазы на субъединицы и осуществляющего их доставку в 26S протеосомы. Использование хиральных аналогов a-ме-тилированных полиаминов позволило впервые показать, что сперминоксидаза, дезоксигипу-зинсинтаза и ацетилполиаминооксидаза (АРАО), природные субстраты которых ахиральны, обладают стереоспецифичностью и найти изящный способ регулирования стереоспецифич-ности АРАО. Установлено, что a-метилполиамины способны выполнять жизненно важные функции их природных прототипов в культуре нормальных и опухолевых клеток, а также и in vivo, предотвращая развитие острого панкреатита у SSAT-трансгенных крыс и стимулируя регенерацию печени после частичной гепатэктомии в условиях дефицита Spm и Spd. Таким образом, впервые показано, что введение метильной группы в заданное положение поли-аминного скелета и изменение конфигурации хирального центра позволяет тонко регулиро-вать биохимические свойства аналогов полиаминов, а соответствующие производные и ана-логи представляют собой ценные инструменты исследования клеточных функций и метабо-лизма Spm и Spd in vitro и in vivo.
Практическая ценность работы. Повышенное содержание Spm и Spd в опухолевых клетках, жизненная необходимость полиаминов для развития возбудителей малярии, сонной болезни и лейшманиоза, а также наблюдаемые нарушения метаболизма полиаминов у боль-ных панкреатитом и диабетом формируют прикладную составляющую исследований клеточ-ных функций Spm и Spd и поиска новых регуляторов их метаболизма. Правомерность подоб-ного подхода подтверждается успешным использованием a,a-дифторметилорнитина (DFMO) для лечения поздних стадий сонной болезни (Burri C.C. & Brun R. 2003. Parasitol.Res. 90, S49-S52) и противоопухолевой активностью терминально N,N’-бис-алкилированных производных полиаминов, являющихся супериндукторами SSAT (см.обзор: Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev.Drug Discov. 6, 373-390). В настоящей работе впервые показано, что a-MeSpd спосо-бен предотвращать развитие острого панкреатита у SSAT-трансгенных крыс, возникающего в ответ на активацию фермента. Найдено, что активно транспортируемый в L.donovani 1-гуани-диноокси-3-аминопропан (GAPA), в отличие от других ингибиторов орнитиндекарбоксилазы, эффективно препятствует размножению резистентных к сурьма-содержащим препаратам форм паразита, что открывает новые возможности для практической полиаминотерапии лейшманиоза.
Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на: Polyamine Gordon Research Conference (Connecticut College, New London, CT, USA, June 2001); International Con-ference devoted to 100-year anniversary of Acad. A.E.Braunstein (Moscow, Russia, May 2002); International Conference on Biogenic Amines (Trento, Italy, June 2002); Biogenic Amines COST 922: Health implications of dietary amines (Trento, Italy, May 2004); The IX spring meeting of synthetic chemistry (Kuopio, Finland, June 2006); 1st International Conference on the Role of Poly-amines and their Analogs in Cancer and Other Diseases (Tivoli, Italy, September 2006); Biochemi-cal Society COST Action 922: Health Implications of Dietary Amines (Aberdeen, Scotland, UK, October 2006); COST B22 expert meeting "Polyamines and parasites" (Stockholm, Sweden, Sep-tember 2007); International Conference “Polyamine: Forty Years of Mammalian Ornithine Decar-boxylase” (Kuopio, Finland, June 2008); XI International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins (Vienna, Austria, August 2009); 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases (Tivoli, Italy, December 2010); Polyamine Gordon Research Conference (Waterville Valley, New Hampshire, USA, June 2011); International Conference “Biogenic Amines 2011. Biochemical, Physiological and Clinical Perspectives” (Trento, Italy, September 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 статей.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ___ стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экс-периментальной части и выводов. Материал иллюстрирован ___ таблицами, ___ рисунками и ___ схемами. Список цитированной литературы включает ___ наименований.
