Молекулярно-генетические основы болезни Паркинсона Шадрина, Мария Игоревна

Содержание к диссертации

Список сокращений "

ВВЕДЕНИЕ Ю

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ^1б

1.1. Общая характеристика болезни Паркинсона ^1б

1. Эпидемиология болезни Паркинсона * "

2. Клиническая характеристика болезни Паркинсона 1⁸

3. Классификация болезни Паркинсона 21

4. Заключение 23

1.2. ЭТИОПАТОГЕНЕЗ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА 24

5. Нейропатология и течение болезни Паркинсона 24

6. Гены и биологические процессы, вовлеченные в патогенез спорадической формы болезни Паркинсона 28

1.2.2.1. Дисфункция убиквитин-зависимой протеасомной
деградации белков 32

1.2.2.2. Митохондриальная дисфункция и оксидантный

стресс 45

1.2.2.3. Гены, вовлеченные в функционирование синапсов.... 63

4. Гены, вовлеченные функционирование лизосом 64

5. Гены, вовлеченные в дифференцировку, выживание

и функционирование дофаминергических нейронов 67

6. Гены системы обмена дофамина 68

7. Роль воспалительных процессов в патогенезе

болезни Паркинсона 70

8. Роль микроРНК в патогенезе болезни Паркинсона 71

9. Другие гены, вовлеченные в патогенез болезни Паркинсона 74

1.2.3. Роль факторов окружающей среды в развитии болезни

Паркинсона 77

1.2.4. Заключение '"'

1.3. Молекулярно-генетические подходы к изучению болезни
Паркинсона

1. Поиск и анализ мутаций и полиморфизмов в геноме человека

2. Анализ изменения транскриптома

3. Анализ экспрессии в тканях головного мозга - -' *'

4. Анализ изменения экспрессии генов в периферичне^ крови

1.3.3. Экспериментальное моделирование болезни ПаркинсоН^-''

1.3.3.1. Общие принципы моделирования и используемые

объекты

2. Генетические модели болезни Паркинсона

3. Нейротоксические модели

4. Другие способы моделирования

1.3.4. Заключение

1.4. Современные подходы к диагностике ранних стадий болез Л^*
Паркинсона - ~

1. Методы нейровизуализации - -

2. Идентификация нарушения обоняния - - "

1 АЗ.Пародоксальный сон без мышечной атонии

4. Обстипация как маркер ранних стадий болезни Паркинсоїї^"'

5. Биохимические маркеры в гуморальных средах -

6. Молекулярно-генетические методы диагностики -

7. Заключение -

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Характеристика анализируемых выборок -

2. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической: крови и тотальной РНК из цельной крови человека

2.3. Анализ делеций и дупликаций гена PARK2 и
мультипликаций гена SNCA 133

4. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов в генах LRRK2, PARK2, SNCA, WNT3 и мутации G2019S в гене LRRK2 136

5. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций с использованием технологии APEX 139

6. Анализ экспрессии генов SLC6A3, GSK3B, МАРТ, PARK2, SNCA ST13 142

7. Моделирование экспериментального паркинсонизма с использованием 6-гидроксидофамина 144

2.8. Статистическая обработка результатов 146

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 147

3.1. Анализ вклада мутаций с изменением копийности в генах
PARK2 и SNCA в патогенез болезни Паркинсона у больных из
России 147

1. Подбор праймеров-и-оптимизация метода анализа дозы отдельных экзонов генов PARK2 и SNCA 147

2. Анализ делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 в

выборке спорадических больных болезнью Паркинсона 154

3.1.3. Анализ дупликаций и трипликаций гена SNCA в выборке
аутосомно-доминантных больных болезнью Паркинсона 169

3.2. Анализ спектра точковых мутаций и однонуклеотидных
полиморфизмов в генах, вовлеченных в патогенез болезни
Паркинсона, у больных из России 171

3. Анализ мутации G2019S в гене LRRK2 171

4. Анализ точковых мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в генах, вовлеченных в патогенез болезни Паркинсона, с помощью технологии ДНК-микрочипов 173

5. Анализ дополнительных однонуклеотидных

полиморфизмов в генах SNCA иМАРТ. ¹⁸³

3. Поиск новых генов-кандидатов болезни Паркинсона с помощью технологии ДНК-микрочипов 186

4. Поиск новых генов-кандидатов болезни Паркинсона с использованием крыс с 6-гидроксидофаминовой моделью заболевания 194

5. Выявление вклада изменения экспрессии генов SLC6A3, GSK3B, МАРТ, PARK2, SNCA, ST13 в патогенез болезни Паркинсон/

в российской популяции 207

3.5.1. Оптимизация метода определения уровней мРНК генов
SLC6A3, GSK3B, МАРТ, PARK2, SNCA, ST13 в периферической

крови 208

3.5.2. Анализ изменения экспрессии генов SLC6A3, МАРТ и

PARK2 210

3.5.3. Анализ изменения экспрессии генов GSK3B, SNCA и ST13. 213

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 221

ВЫВОДЫ 224

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 226

БЛАГОДАРНОСТИ 288

aCGH (Array Co ^{СПИСК СОК}Р^ац<^е«ий-

-ємная _гибрид~^{Є ОЄПОтІС} "*"***> - «- сра_ВНИТельная

АТР13А2-АТФаза13А2

BD№ (brain-derived neurotrophic factori -

BH4 - г^_{тробтптерт} **"» " ^офинеский _{фактор мозга}

^{CGH (Com}P^tive Genomic Hybridization!

гибридизация ynd.zation) - сравнительная геномная

CNV (Copy Number Variations

^Vanat"ons) - вариации числа копий

^Ґ2Ш - ВДтохром Р450 2D6

^Е1 ~ Дитохром Р450 2Е1

DAT (dopamine active transporter! ,.

ОВН(_йо_ратіпе_Р._пу^еГ ~^{РТЄРДОфМИНа}
Drd3 - ренеп У ^} ~ ^ДфаМИН-'³-ДРоксила₃а

Рецептор дофамина D3

^D"W- рецептор дофамина D4

РВХ07-Р-боксабелок7

FGF20 - фактор роста фибробластов 20

GBA-глюкоцереброзвдаза

_{оп№;гозинірифосфатциклог^ол-1}

-^сіїй

фактор " ' ^,ine"^deriVed —^ ***> - —„_ЬІЙ нейротрофи^: GPR27 - G-белок рецептора 37

^>-^—^-трансферазам,

¹ ~ ^Глутаон-8-трансфераза Р1
GSTT1 -глутат_Ион-8-трансфераза ТІ
GWAS (Genome-Wide Association Study) „
анализ ^ау; ~ ^плногеномный ассоциативна*^¹¹¹

^Н№Р (^be^it_ary neuropathy with liabilifv ,

_оавІ**^ельная

HR-CGH (High-resolution Comparative Genomic Hybridization) — ^c*

геномная гибридизация с высоким разрешением

IL-lb-интерлейкин-І бета

iNOS - индуцибельная NO-синтаза ₀раНйЫ^

LINE (long interspersed nuclear element) - семейство длинных дисії^

повторов генома человека

Lmxlb (LIM homeodomain transcription factor) - ^op^alviIi

LRRK2 (Leucine-Rich Repeat Kinase 2) - киназа 2 с лейцин богатыми

МАО-А - моноаминооксидаза А

МАО-В - моноаминооксидаза В ^схї>~&

МАРТ (microtubule-associated protein tau) - ассоцииро^^

микротрубочками белок тау я&аЯ⁰³

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) -"""'

полиморфизма лигированных фрагментов ^хе^сКТ

MMSE (Mini-mental State Examination) - краткая шкала оценки псі

статуса

MTND2 - митохондриальная НАДН дегидрогеназа 2

NAT2 - N-ацетилтрансфераза 2

NEFL - легкая цепь нейрофиламентов

NEFH- тяжелая цепь нейрофиламентов lis)

NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В

транскрипционный ядерный фактор «каппа-би»

nNOS - нейрональная NO-синтаза

OR - отношение шансов

PDXK - пиридоксалькиназа

PINK1 (PTEN-Induced Kinase 1)-PTEN -индуцируемая киназа 1

Pitx3 (gene paired-like homeodomain transcription factor 3) -

PMP22 - белок периферического миелина 22

POLG (polymerase (DNA directed) gamma) - субъединица ДНК-полимеразы

гамма-1

SD (standard deviation) — стандартное отклонение

SDS (sodium dodecyl sulfate) - додецилсулфат натрия

SPR — сепиаптерин редуктаза

SRGAP3 - SLIT-ROBO Rho активирующий ГТФазу белок З

TGF-a (transforming growth factor alpha) - трансформирующий фактор роста

альфа

TNF-a (tumor necrosis factor alpha) - фактор некроза опухоли альфа

ТРН - триптофан гидролаза

TRPPC4 - трансмембранный белок, вовлеченный в транспорт триптофана

UCHL1 (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase LI) - С-концевая убиквитин

гидролаза 1

UPDRS (Unified Parkinson's Disease Rating Scale) - унифицированная оценочная

шкала болезни Паркинсона

UPS24 - убиквитин карбоксил концевая гидролаза 24

6-ГДА - 6-гидроксидофамин

АД - аутосомно-доминантный

АР — аутосомно-рецессивный

АТФ - аденозинтрифосфат

АТФаза — аденозинтрифосфатаза

БП - болезнь Паркинсона

ГМ - мутации в гетерозиготном состоянии

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ГТФаза - гуанозинтрифосфатаза

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ДИ - доверительный интервал

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат

ДОФА (dopa) - дигидроксифенилаланин

кб - килобаза

Мб - мегабаза

мРНК - матричная РІЖ

МФТП - 1-метил-4-фенил-1,2,3>6-тетрапирин

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДН - восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм

п.н. — пар нуклеотидов

ПНР - полимеразная цепная реакция

РНК — рибонуклеиновая кислота

ТМ - точковые мутации

тРНК — транспортная РНК

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Изучение структурно-функциональной организации генома человека — одна из центральных, проблем в современной биологии. В рамках этой проблемы решаются важнейшие задачи, связанные с анализом процессов? реализации генетической информации на. всех уровнях биологической организации?- от отдельной:клеткш до целостного организма. При этом будет выясненагфункция, отдельных: генов,, генных- сообщества ж генома; в- целом; в жизнедеятельности организма? на' всех этапах онтогенеза; Дгш получения максимально* полной» информации; требуется; выяснение ролш. отдельных; элементов генома как в- норме,; таки при развитии; патологическихпроцессов?— как моногенных, так и сложных многофакторных заболеваний: Анализ. патологических процессов позволит связать воедино.; генетические и^г эпигенетические; факторы, влияющие на функционирование организма в различных условиях. дними из наиболее актуальных заболеваний; являются? болезни центральной нервной системы';,, так как они затрагивают функционирование основных регуляторных систем организма; Єреди- этих болезней отдельную большую; группу составляют нейродегенеративные: заболевания, которые характеризуются избирательной дегенерацией отдельных типов нейронов и структур мозга. Одним из таких заболеваний является; болезнь Паркинсона — многофакторное заболевание с выраженным генетическим компонентом, для которого характерно существование как семейных, так и спорадических; форм. Болезнь Паркинсона; относится-к; числу самых частых нейродегенеративных заболеваний;; человека;,. По последним данным, болезнью; Паркинсона' по всему миру болеет около; 6 млн. человек. Считается, что болезнь Паркинсона наблюдается у не менее 1-2% населения.в возрасте старше 65 лет и не менее 4-5% в возрасте старше 85 лет. В последнее время наблюдается рост числа больных идиопатическим паркинсонизмом и снижение возраста начала заболевания.

Высказывается предположение, что с увеличением среднего возраста населения в ближайшие годы распространенность болезни Паркинсона в мире будет увеличиваться.

Изучение этого заболевания активно ведется' уже на протяжении ста лет. Многолетние исследования позволили достаточно полно описать болезнь Паркинсона склинической точки зрения. Выявлено большое количество форм и стадий болезни Паркинсона, которые указывают на то, что при, заболевании задействованы разные отделы нервной системы и в его патогенез вовлечено большое число различных процессов, обеспечивающих нормальное функционирование нервных клеток. Достаточноз полно охарактеризована болезнь Паркинсона с точки зрения нейропатологии. Показано, что нейродегенеративные изменения- при болезни* Паркинсона связаны с избирательной гибелью различных типов нейронов. В первую очередь наблюдается уменьшение числа дофаминергических нейронов в компактной части черной- субстанции, базальных ядрах, покрышке среднего мозга. Установлено, что характерные для болезни Паркинсона клинические признаки проявляются при гибели приблизительно 60% дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции и 80%-ном снижении" уровня-дофамина в полосатом теле. В то же время, несмотря' на интенсивные молекулярно-биологические исследования, причины развития заболевания остаются до конца не выясненными. На сегодняшний день выявлено семь генов, (SNCA, PARK2, LRRK2, PINK1, DJ1, UCHL1, АТР13А2), вовлеченных в патогенез семейной; формы болезни Паркинсона. Однако их вклад в развитие спорадической формы заболевания остается' не известным. Кроме того, выявлен ряд потенциальных генов-кандидатов, связанных с развитием спорадической формьг болезни Паркинсона.

Анализ кодируемых этими генами белков позволил предложить несколько механизмов, объясняющих причины селективной и прогрессирующей гибели дофаминергических нейронов. К ним в первую очередь относятся процессы, связанные с митохондриальной дисфункцией, убиквитин-зависимой протеасомной деградацией белков, дифференцировкой дофаминергических нейронов, функционированием синапсов и лизосом, обменом дофамина.

В целом же до сих пор нет единой картины этиопатогенеза данного заболевания. В связи с этим дальнейшее изучение болезни Паркинсона на различных уровнях крайне актуально. Необходимо проводить анализ заболевания с генетических позиций, выявляя новые гены, различные мутации и полиморфные варианты, приводящие к семейной и влияющие на^ риск развития спорадической форм заболеваниям Важным направлением является изучение изменения транскриптома при болезни Паркинсона, в» первую очередь, на ранних стадиях патологического процесса. Это позволит выявить механизмы, запускающие нейродегенеративные процессы. Моделирование болезни* Паркинсона на животных также поможет лучше понять причины развития болезни Паркинсона. Проведение такого рода работ позволит в будущем выстроить целостную картину всех молекулярно-генетических процессов, задействованных в патогенезе заболевания, и, следовательно, лучше понять механизмы функционирования, как отдельных нейронов, так и всей нервной системы человека в целом.

Выявление механизмов и генов, вовлеченных в патогенез болезни Паркинсона на разных стадиях заболевания, поможет также разработать методы его доклинической диагностики. Это даст возможность начать разработку принципов и подходов к профилактическому лечению на ранних стадиях заболевания, когда процессы дегенерации дофаминергических нейронов затронули лишь ограниченное число клеток.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было изучение роли генетических факторов в патогенезе спорадической формы болезни Паркинсона и выявление новых геномных и транскриптомных маркеров данного заболевания.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Разработка быстрого и эффективного метода анализа дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени.

Анализ мутаций с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA у пациентов с болезнью Паркинсона.

Изучение роли точковых мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в генах, вовлеченных в патогенез болезни Паркинсона, в развитии спорадической формы заболевания.

Поиск новых ДНК маркеров спорадической формы болезни Паркинсона.

Изучение изменения, транскриптома в процессе развития токсической модели болезни Паркинсона*, вызванной введением 6-гидроксидофамина.

Изучение изменения транскриптома в клетках периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона, находящихся на ранних стадиях заболевания.

Научная новизна и практическая значимость исследования.

Разработан быстрый и эффективный метод выявления делеций и дупликаций экзонов 1-12 в гене PARK2 и мультипликаций гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени и технологии TaqMan. Данный метод пригоден для массового скрининга больных на мутации с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA.

При проведении анализа мутаций с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA впервые было показано, что делеции и дупликации экзонов гена PARK2 вносят существенный вклад в развитие спорадической формы болезни Паркинсона в российской популяции. Обнаружено, что у людей, имеющих делеции и дупликации, риск развития заболевания повышен в 8,53 раза (95%ДИ=1,14-63,52; р=0,0095) Вероятность развития спорадической формы болезни Паркинсона в раннем возрасте у людей, имеющих мутации с изменением копийности экзонов гена PARK2, повышена в 13,95 раза (95%ДИ=1,85-105,96; р=0,0004). Получено подтверждение гипотезы г о том, что данный тиш мутаций в гене PARK2 в гетерозиготном состоянии ^влияет на риск развития. заболевания.

Впервые установлено, ген PARK2 отвечает за часть фенотипической' вариабельности; болезни Паркинсона в, российской популяции. Показано, что наличие: делеций: и/или дупликаций^ экзонов в> гене PARK2 способствует ;' существенному; снижению; возраста,клинического дебюта болезни Паркинсона \ (на\9 лет), развитию дистонии и симметричному протеканию: заболевания.

Впервые: обнаружено, что- ген РОМЄ вовлечен' в: патогенез; болезни: ^;_;Паркинсона* Показано, что наличие аллеля Т по; полиморфизмам'rs28930368?H/ . rs2071345 гена РОМЄ повышает риск развития заболевания, ві 5,01: разаУ; ^;. (95%ДИ=Г,05-23,83; р:=0-03)>и приводит, к развитию клинического.фенотипа;с преобладанием: мышечной ригидности* .' Л

Впервые показано; что ген WES1 вовлечен в патогенез болезни Паркинсона- Обнаружено^ что наличие¹ аллеля Т по полиморфизму rs 180121 '.гена WFSL повышает . ,_: риск -развития заболевания в^ 2,341 : раза ,: (95%ДИ=1',29-4;24;р=0,005). , ' ;:':;

Впервые: выявлена ассоциация' полиморфизма^ rs2736990 (

Выявленные нами мутации и однонуклеотидные полиморфизмы в генах PARK2, SNGA, РОМЄ wWFSl в= дальнейшем могут быть включены в панель, ; маркеров; для определения индивидуального риска^! развития^ болезни-Паркинсона.

Впервые проведено изучение относительных уровней экспрессии генов, GSK3B, SNCA, ST13 в периферической крови больных на ранних стадиях развития болезни Паркинсона и показано, что изменение уровня мРНК каждого гена в отдельности не является специфичным для этого заболевания. В то же время совместный анализ относительных уровней экспрессии генов GSK3B, SNCA, ST13 выявил разные паттерны уровней их мРНК в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона, больных церебральным атеросклерозом и у группы пациентов с различными неврологическими заболеваниями. Это говорит о специфическом системном ответе организма на ранних стадиях патологического процесса при болезни Паркинсона. Кроме того, полученные данные указывают на то, что изменения экспрессии генов GSK3B, SNCA, ST13 по отдельности не могут служить биомаркерами для ранних стадий болезни Паркинсона. Однако эти данные позволяют предположить, что совместный анализ количества транскриптов генов GSK3B, SNCA, ST13, а также других генов, вовлечённых в патогенез БП, в дальнейшем могут стать основой для создания панели маркеров для диагностики этого заболевания на досимптоматической стадии.

Похожие диссертации на Молекулярно-генетические основы болезни Паркинсона

Создание и внедрение в промышленное птицеводство системы комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней на основе иммуноферментного анализаМудрак, Наталья Станиславовна

Дифференциация вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе анализа геномовАронова, Елена Владимировна

Идентификация вируса болезни Акабане на основе методов анализа геномаХан, Евгения Олеговна

Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней на основе анализа геномаЖигалева Ольга Николаевна