Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Характеристика полиовируса и организация его генома 8
1.1.1. 5'-нетранслируемая область 11
1.1.2. Кодирующая часть генома. Протеолиз и репликация вируса 15
1.1.3. З'-нетранслируемая область 20
1.2. Молекулярная эволюция РНК-вирусов 21
і .2.1. Основные понятия и механизмы молекулярной эволюции вирусов 21 1.2.2. Методы эволюционного анализа нуклеотидных последовательностей.27
1.2.2.1. Методы, основанные на матрице расстояний 28
1.2.2.2. Методы, основанные на первичных данных 29
1.2.2.3. Методы оценки статистической достоверности топологий получаемых дендрограмм 30
1.3. Молекулярная эпидемиология полиомиелита 31
1.3.1. Методы молекулярной эпидемиологии 32
1.3.2. Географическое распределение полиовирусов и особенности их
циркуляции 35
1.3.2.1. Генотипы полиовирусов. Одновременная циркуляция разных генотипов 35
1.3.2.2. Занос (импорт) генотипов в другие географические регионы.37
1.4. Вакцинно-ассоциированный полиомиелит 38
1.5. Общая вариабельная иммунная недостаточность (ОВИН) 42
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Описание диких штаммов полиовируса 44
2.2. Описание штаммов, выделенных от больного иммунодефицитом 46
2.3. Нуклеотидные последовательности. GeneBank коды 47
2.4. Выделение и типирование вирусов 48
2.5. Выделение тотальной РНК 49
2.6. Праймеры 49
2.7. Обратная транскрипция 50
2.8. Амплификация фрагментов вирусного генома методом ПЦР и подготовка ДНК-матрицы к секвенированию 51
2.9. Электрофорез 51
2.10. Секвенирование ДНК 52
2.10.1. Получение радиоактивно-меченных олигодезоксинуклеотидов 52
2.10.2. Получение флюоресцентно-меченных олигодезоксинуклеотидов 53
2.10.3. Разделение олигодезоксинуклеотидов 53
2.11. Компьютерный анализ полученных нуклеотидных последовательностей 54
2.11.1. Построение дендрограмм последовательностей 54
2.11.2. Регрессионный анализ 55
2.11.3. Анализ вторичной структуры РНК 56
2.11.4. Анализ мутаций в синонимических и несинонимических сайтах 56
2.11.5. Статистический анализ редких кодонов 57
Глава 3. Результаты 59
3.1. Общая характеристика двух полиовирусных популяций 59
3.2. Характер фиксации мутаций 62
3.3. Ход эволюции в двух полиовирусных популяциях 65
3.4. Неравномерность скоростей фиксации мутаций в эволюции разных участков вирусного генома 66
3.5. Неравномерность использования синонимичных кодонов 69
3.6. РНК-структура и неравномерность темпов эволюции на разных участках вирусного генома 74
3.7. Неравномерность хода молекулярных часов 75
Глава 4. Обсуждение результатов 78
4.1. Основные механизмы эволюции полиовирусной популяции 78
4.2. Неравномерные скорости эволюции разных участков генома и разных вирусных геномов 80
4.3. Нарушения хода молекулярных часов 85
4.4. Гипотетический сценарий вирусной эволюции в иммунодефицитном хозяине...88
4.5. Модель эволюции полиовируса и эпидемиология 89
Выводы 90
Список литературы
- Кодирующая часть генома. Протеолиз и репликация вируса
- Описание штаммов, выделенных от больного иммунодефицитом
- Неравномерность скоростей фиксации мутаций в эволюции разных участков вирусного генома
- Неравномерные скорости эволюции разных участков генома и разных вирусных геномов
Введение к работе
К настоящему времени установлено, что темпы эволюции вирусной
РНК достаточно высоки (Gojobori et al., 1990; Ito et al., 1991). Изучение
внутренней структуры популяций вирусов выявило тот факт, что любая
популяция представляет собой сложное распределение различных
геномных вариантов (Domingo et al., 1985, 1998). Нуклеотидные
последовательности генома не являются строго консервативными, а
варьируют в пределах популяции, составляя некую консенсусную
последовательность. Однако механизмы, вызывающие такую
гетерогенность, до сих пор точно не охарактеризованы. При сравнительном
анализе нуклеотидных последовательностей отмечаются участки с
большим числом замен, чередующиеся с относительно консервативными
районами. Так, отмечена большая вариабельность участка нуклеотидной
последовательности, соответствующего антигенным сайтам
полиовирусного белка VP1 (Kinnunen et al., 1990). В то же время, в нуклеотидном выравнивании этого участка вирусов одного серотипа, отмечаются регионы, практически не затрагиваемые мутациями. Анализ динамики накопления мутаций необходим для понимания механизмов, отвечающих за изменчивость полиовируса in vivo.
Эволюционные исследования ДНК-организмов, а позднее, и РНК-вирусов показали, что большинство фиксирующихся мутаций не проявляются фенотипически, и, следовательно, являются нейтральными (Gojobori et al., 1990). Предполагается, что накопление таких нейтральных мутаций происходит линейно со временем и что среди мутаций должны преобладать т.н. синонимичные - т.е. мутации, не меняющие кодируемую аминокислоту. Еще в 1965 г. Zukerkandl и Pauling (1965) предложили т.н. теорию «молекулярных часов». Она предполагает существование
«вселенских часов», ход которых выражается в постоянном числе зафиксированных мутаций на единицу времени. В последние годы получена масса данных, свидетельствующих о нейтральном характере накопления замен, в том числе и в геномах пикорнавирусов (Gojobory et al., 1990; Takeda et al., 1994; Zhang et al., 1999). Однако, ряд исследований выявил факты, не укладывающиеся в рамки теории нейтральной эволюции. В частности, при анализе изменчивости одного из белков вируса ящура было выявлено преобладание несинонимичных замен над синонимичными (Martin et al., 1998). Кроме того, было также отмечено нарушение принципа линейности в накоплении нуклеотидньгх замен.
Следует отметить, что, несмотря на большое количество полиовирусных нуклеотидньгх последовательностей, депонированных в генетические банки, эволюционные исследования полиовирусов, как правило, сводились лишь к частным задачам практической эпидемиологии - выявлению связей между вспышками, идентификации источника при заносе вируса и т.д. Кроме того, имеющиеся в банках последовательности, как правило, не позволяли сформировать репрезентативную выборку вирусов, генетически связанных между собой по типу «предок-потомок».
Помимо изучения закономерностей эволюции полиовирусов, формирование такого рода выборок протяженных последовательностей важно для повышения достоверности молекулярно-эпидемиологических исследований, т.к. анализ коротких последовательностей не всегда оказывается информативным. Анализ вариабельности полиовирусов на разных (протяженных) участках вирусного генома необходим для уточнения критерия родственности, принятого в молекулярной эпидемиологии полиовирусов (см. ниже).
Изучение вирусных вариантов, выделенных от больного иммунодефицитом, помимо возможности получить достоверную
эволюционную ветвь, ценно и в практическом смысле в рамках глобальной программы Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по искоренению полиомиелита. Известно, что в кишечнике иммунокомпетентных лиц вакцинный полиовирус размножается в течение 1-2 месяцев, после чего его выделение заканчивается. В то же время, по имеющимся в литературе данным, в кишечнике лиц с дефектами иммунной системы репродукция вакцинного полиовируса может продолжаться в течение нескольких лет (Kew et al., 1998). Хотя доля таких людей в человеческой популяции невелика, нельзя исключить, что на базе иммуно дефицитных лиц может сформироваться стойкий резервуар дериватов вакцинного полиовируса. После прекращения прививок и накопления прослойки неиммунных лиц возможно распространение этих вирусов в популяции человека. Выявление особенностей изменчивости полиовируса в организме со сниженным или отсутствующим иммунным ответом может позволить скорректировать стратегию ВОЗ по искоренению полиомиелитной инфекции.
В настоящей работе охарактеризованы закономерности фиксации мутаций в двух полиовирусных популяциях, представленных дикими полиовирусами, изолированными в ходе вспышек полиомиелита, и вакцинно-родственными вирусами, выделенными от больного иммунодефицитом.
Кодирующая часть генома. Протеолиз и репликация вируса
Попав в клетку, геномная РНК полиовируса транслируется с образованием полипротеина-предшественника, из которого путем протеолиза при участии вирусных протеиназ образуются зрелые вирусные белки (белки капсида, РНК-полимераза и т.д.) (Рис. 1). Первичное расщепление предшественника приводит к образованию трех фрагментов: Р1, Р2 и РЗ. Дальнейшее расщепление фрагмента Р1 приводит к появлению четырех белков капсида, а из фрагментов Р2 и РЗ образуются все неструктурные белки, необходимые для процессинга полипротеина и вирусной репликации. Роль конечных продуктов протеолиза предшественника Р1 была описана выше. Однако, в последнее время появились сообщения о том, что, помимо кодирования капсидных белков, соответствующая этому фрагменту РНК содержит цис-действующие репликативные элементы. Первый такой факт был зарегистрирован McKnight и Lemon (1996) у HRV-14. Последовательность длиной 83-96 нт, находящаяся на 3 -конце фрагмента, кодирующего Р1, необходима для успешной репликации вируса. Интересно отметить, что подобный элемент был позже обнаружен у представителей рода Cardiovirus - вирусов Менго и Тейлера, однако он расположен на участке, кодирующем капсидный белок VP2 (Lobert et al., 1999). Последовательность длиной в 9 нт чрезвычайно консервативна у всех кардиовирусов и располагается в одноцепочечном участке предсказанной вторичной структуры РНК. Подобных элементов на участке Р1 у полиовируса обнаружено не было, тем не менее, недавно идентифицирован цис-элемент репликации (сге) длиной в 61 нт, расположенный в шпилечной структуре на участке генома, кодирующем белок 2С этого вируса (Goodfellow et al., 2000). Следует отметить, что предшественники конечных продуктов протеолиза выполняют функции, отличные от функций продуктов их расщепления. Например, предшественник ЗАВ играет важную роль в репликации, выполняя функцию носителя белка ЗВ (VPg), и обеспечивает благоприятные пространственные взаимоотношения в инициационных комплексах. Продукт расщепления ЗАВ, белок ЗА играет роль в блокировании транспорта клеточных белков из эндоплазматического ретикуллума (ЭР) в аппарат Гольджи (Doedens and Kirkegaard, 1995), а уже упомянутый белок ЗВ (VPg), после его уридилирования играет роль праймера для вирусной полимеразы.
После появления вирусных белков в клетке начинается репликация вирусной РНК. При расщеплении РЗ образуется вирусная РНК-полимераза (3Dpo1). Как уже отмечалось, геномная РНК полиовируса служит матрицей для синтеза (-) цепей РНК. Они, в свою очередь, являются матрицами для (+) цепей РНК вирусного потомства. Эти (+) цепи могут либо транслироваться с образованием вирусных белков, либо упаковываться в созревающие вирионы. Поскольку процесс репликации полиовирусов не является темой данной работы, мы не будем останавливаться на описании репликационньгх комплексов, а лишь кратко охарактеризуем свойства неструктурных белков.
Полипротеин-предшественник подвергается протеолизу двумя продуктами вирусных генов - белками 2АрГ0 и ЗСрго. Эти белки структурно схожи с трипсиноподобными сериновыми протеиназами с заменой 109 аминоксилоты на цистеин, как нуклеофильное основание (Gorbalenya and Snijder, 1996). Белок 2Арго расщепляет тирозин-глициновые (Y-G) связи, в то время, как ЗСрго проводит расщепление по глютамин-глициновым сайтам (Q-G). Первичный процессинг вирусного полипротеина катализируется белком 2Арго, который вносит разрыв между фрагментами Р1 и Р2. Большинство других протеолитических реакций проходит при участии ЗСрго или его предшественника 3CD. В дополнение к аутокаталитической протеолитической активности 2Арг0 вызывает расщепление белков eIF-4GI (ранее р220 - компонента кэп-связывающего белкового комплекса eIF-4F) и его функционального гомолога eIF-4GII (Svitkin et al., 1999). Потеря активности этих белков приводит к ингибированию синтеза клеточных белков, что дает преимущество для образования вирусных белков.
Компьютерные выравнивания аминокислотных последовательностей 2Арго и ЗСрго пикорнавирусов выявили общую консенсусную структуру для всех энтеро- и риновирусов с чрезвычайно консервативным цистеиновьгм остатком в районе активного центра (Argos et al., 1984). При помощи мутационного анализа удалось установить, что каталитическую триаду белка 2Арго составляют консервативные аминокислотные остатки His20, Asp38 и Cys 109 (Yu and Lloyd, 1991). Другие три аминокислоты отвечают за связывание с субстратом: Туг88, Туг89 и Thrl24.
Предшественник 2ВС и продукты его расщепления (2В и 2С) играют важную роль в тех морфологических изменениях, которые протекают в зараженной клетке. 2ВС участвует в образовании мембранных везикул, в которых происходит синтез (+) цепей вирусной РНК (Cho et al., 1994). Одним из изменений, происходящих в клетке в момент полиовирусной инфекции, является изменение проницаемости плазматической мембраны. Экспрессия рекомбинантных 2ВС и 2В показала, что белок 2В и его предшественник способны вызывать подобные изменения. Предполагается, что такая модификация приводит к нарушению градиента моно- и двухвалентных катионов, и вещества, и структуры, в норме не проникающие через мембрану, вытекают из клетки или проникают в цитоплазму.
Описание штаммов, выделенных от больного иммунодефицитом
В настоящей работе были определены следующие нуклеотидные последовательности полиовирусного генома 29 штаммов (Табл. 3 и 4): полные нуішеотидньїе последовательности, кодирующие вирусные белки VP1 (906 нт; координаты 2500-3408), 2А (447 нт; 3409-3855) и 2В (291 нт; 3856-4146), а также фрагмент последовательности гена 2С (51 нт; 4147-4197, этот участок будем в дальнейшем называть 2С). Фрагмент гена 3D (792 нт; 6601-7392, далее 3D ) был проанализирован в следующих штаммах: PV1/169AZB59, /7TAJ91, /5794UZB94, /6484СНЕ95, /6486СНЕ95, /6490CHE95, /6405ING95, /422RUS91, и /919GEO90. Здесь и далее координаты участков даны в соответствии с нуклеотидным выравниванием Toyoda et al. (1984).
Нуклеотидные последовательности следующих штаммов были опубликованы ранее: участок генома, кодирующий 30 С-концевых аминокислот капсидного белка VP1 и 20 N-концевых аминокислот неструктурного бежа 2А (150 нт; 3319-3368) штаммов PV1/827GE085, /832GE085, /919GEO90, /434MOL91, /422RUS91, /4TAJ91 и /7TAJ91 (Lipskaya et al., 1995), а также полная нуклеотидная последовательность гена VP1 штаммов, выделенных от больного иммунодефицитом (Kew et al., 1998).
Все нуклеотидные последовательности, определенные в этой работе, были депонированы в банк последовательностей GeneBank со следующими кодами: AF233098-AF233222. Последовательности участка VP1 изолятов от иммунодефицитного пациента были депонированы ранее (AF083933-AF083937) (Kew et al., 1998).
Дикие штаммы полиовируса были получены из коллекции Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова. Выделение вируса из проб фекалий проводили по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1997). Штаммы полиовируса типа 1 однократно пассировали на культурах клеток RD (рабдомиосаркома человека), НЕр 2 (эпидермоидная карцинома человека) или L20B (клетки мыши, экспрессирующие человеческий полиовирусный рецептор) и типировали методом микронейтрализации с типоспецифическими сыворотками в лаборатории вирусов окружающей среды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова. Работу со штаммами, вьщеленными от больного общей вариабельной имунной недостаточностью, мы проводили в Centers for Disease Control and Prevention (CDC, Atlanta, USA).
Тотальную РНК выделяли из 250 мкл культуральной жидкости гуанидиновым методом с фенольной депротеинизаций с использованием коммерческого реактива ULTRASPEC 3 по протоколу производителя (Biotexc, USA). К культуральной жидкости добавляли 750 мкл ULTRASPEC 3 и 200 мкл хлороформа. Смесь центрифугировали 10 мин при 4С (15000 об/мин). По окончании центрифугирования к супернатанту добавляли 600 мкл изопропилового спирта и вели преципитацию во льду в течение 10 мин с последующим центрифугированием при 4С (30 мин). Осадок двукратно промывали последовательно 70%- и 95%-ным этанолом. После подсушивания осадок тотальной РНК растворяли в 25 мкл воды.
Синтетические олигодезоксинуклеотиды были сконструированы с помощью компьютерной программы «Oligo» (National Bioscience Inc., USA) и синтезированы стандартным фосфорамитидным методом на олигонуклеотидном автоматическом синтезаторе (Модель 380А; Applied Biosystems, USA). Характеристика праймеров отображена в таблице 5.
Неравномерность скоростей фиксации мутаций в эволюции разных участков вирусного генома
Как уже отмечалось, основной вклад в разницу скоростей фиксации мутаций на исследованных участках полиовирусного генома, вносили синонимичные замены. Наличие разницы в скоростях фиксации синонимичных замен на различных участках полиовирусного генома предполагает существование разных селективных ограничений, которые контролируют мутабельностъ каждого из участков. Одно из предположений могло заключаться в том, что на участок с меньшей скоростью фиксации синонимичных замен действует какой-то из механизмов негативной селекции, предотвращающий фиксацию мутаций. Это предположение потребовало специального изучения, т.к. мало известно о механизмах селекционного давления на синонимичные сайты.
Частота использования синонимичных кодонов может варьировать как в разных организмах, так и в тканях, и даже в генах одного и того же организма (Zhou et al., 1999). Достаточно подробно изучена роль т.н. редко-встречающихся кодонов в регуляции экспрессии генов (Sharp and Matassi, 1994, Zhou et al., 1999). Редкие ко доны могут обеспечивать локальное замедление кинетики трансляции с целью получения биологически-активной конформации вновь синтезированного пептида (Adzhubei et al., 1996). Как следствие, нуклеотидные замены в таких ко донах будут происходить реже. Различия в степени консервации редких кодонов с подобной функциональной нагрузкой могли бы объяснить разницу в скоростях фиксации синонимичных замен на разных участках генома.
Полноценный статистический анализ степени консервации редких синонимичных кодонов был проведен только для участков генома VP1 и 2АВС, т.к. число последовательностей участка 3D было недостаточным. Частота использования кодонов на изученных участках VP1 и 2АВС у штамма Сэбин 1 варьирует незначительно (Табл. 7). Следовательно, редкий ко дон для участка VP1 будет также редким и для участка 2АВС. Тем не менее, только на участке VP1 была выявлена статистически значимая (р 0,05; см. Материалы и методы) консервация редких кодонов в определенных позициях (Рис. 11; соответствующие им аминокислоты показаны на Рис. 12). В ряде случаев на участке VP1 была отмечена кластеризация консервативных редких кодонов, когда несколько последовательных или близко расположенных редких кодонов избегали мутаций (Рис. 12). Участки такой консервации длиной в один или несколько редких кодонов, как правило, располагались в районах, Обнаружение консервативных редких кодонов и их локализация указывают на то, что последовательное ко-трансляционное сворачивание может иметь значение при формировании капсидных белков полиовируса. В свете гипотезы ко-трансляционного сворачивания, интересны замены одного редкого кодона на другой, такой же редкий (Рис. 11). Этот пример может иллюстрировать значение определенных кодоновых позиций в обеспечении трансляционных пауз. Обнаруженные нами консервативные редкие кодоны являлись консервативными и у остальных штаммов, изученных в этой работе (данные не приводятся).
Интересно, что на участке 2АВ редкие кодоны встречались существенно реже, и консервации редких кодоновых позиций нами обнаружено не было.
Однако идентифицированные нами аномально консервативные редкие кодоны на участке VP1 не могут количественно объяснить столь существенную разницу в мутабельности участков VP1 и 2АВ. Поскольку длины этих участков приблизительно равны (906 и 739 нт, соответственно), общее число синонимичных сайтов, (как правило, это третье положение кодона), также схоже. Даже при минимальной двукратной разнице скоростей фиксации синонимичных замен на этих участках (Рис. 9 В), числа консервативных сайтов, обнаруженных на участке VP1 (15; Рис. 11), явно недостаточно для того, чтобы обеспечить такую разницу.
Обнаруженная неравномерность скоростей фиксации мутаций на проанализированных участках вирусного генома может быть также следствием необходимости поддержания вторичной структуры РНК. Поэтому нами был предпринят анализ, направленный на выявление участков РНК со стабильной структурой. Нуклеотидные основания участков РНК со стабильными структурными элементами, как правило, имеют низкие значения параметра, отражающего число возможных пар для каждого данного основания при всех теоретически возможных вариантах укладки - т.н. p-num (Jaeger et al., 1989, Palmenberg and Sgro, 1997). Значения этого параметра, вычисленные для всего генома штамма Mahoney (сайт A. Palmenberg, Univ. of Wisconsin - http://www.bocklabs.wisc.edu/acpl были использованы нами для сравнительного анализа. Было замечено, что оба исследуемых участка - VP1 и 2АВ - имеют сходную долю оснований с низким значением p-num ( 100): 91 из 906 нт (10%) и 62 из 738 нт (8,4%), соответственно. Низкий процент малых значений р-пшп скорее всего свидетельствует об отсутствии протяженной консервативной вторичной структуры на обоих участках.
Из обнаруженных ранее cre-элементов в геномах пикорнавирусов на участках VP1 (HRV-14) и 2С (PV1) (см. Обзор литературы), только участок, соответствующий сге-элементу HRV-14, мог быть нами проанализирован, т.к. определенная нами нуклеотидная последовательность фрагмента участка 2С не захватывала сге-элемент. Все значения p-num для участка генома полиовируса, соответствующего сге-элементу в гене VP1 HR.V-14, были больше 100. Это наблюдение говорит о низкой вероятности существования устойчивых нуклеотидньгх пар на этом участке.
Неравномерные скорости эволюции разных участков генома и разных вирусных геномов
Выявленное нами преобладание синонимичных замен над несинонимичными и преимущественно линейный характер их накопления свидетельствуют о нейтральном характере эволюции полиовируса в кишечнике индивидуума. Необходимы более детальные исследования патогенеза полиомиелита, чтобы представить механизм, при котором из гетерогенной популяции полиовируса в кишечнике человека может осуществляться случайный отбор генетических вариантов. Основываясь на относительно низком титре инфекционного вируса в фекалиях (3,0 - 6,5 logio TCDso/г; Melnick and Rennick, 1980), можно предположить, что, либо только очень малая доля восприимчивых к инфекции клеток доступна для вируса в определенный момент, либо число вирусных частиц, способньк инфицировать такие клетки, очень мало. При таком сценарии возможно стохастическое возникновение геномных вариантов как с пониженной, так и с повышенной жизнеспособностью.
Анализ штаммов, выделенных из образцов фекалий от больного ОВИН показал, что ранние образцы содержали два вирусных варианта. Скорее всего, мажорный вариант (М), исследованный в этой работе, имел адаптивное преимущество перед минорным вариантом (м), т.к. м-вариант впоследствии элиминировался (Kew et al., 1998). Предшественник М варианта мог возникнуть из главенствующей в то время м-популяции незадолго до развития параличей и существовал как коэволюционирующий минорный компонент. В ходе эволюции М-варианта могло произойти стохастическое увеличение его жизнеспособности (Domingo et al., 1997; Duarte et al., 1994; Escarmis et al., 1999; Novella et al., 1995a) и, вероятно, нейровирулентности. Такой скачок в ландшафте жизнеспособности мог возникнуть либо из-за мутации, либо путем рекомбинации (Lipskaya et al., 1991; Furione et al., 1993; Fernandez-Cuartero et al., 1994; Georgescu et al., 1994). Паралитическое заболевание, которое развилось у пациента, скорее всего, было связано с этим повышением патогенности.
В эволюцию диких и вакцинно-родственных вирусов основной вклад, как показали наши исследования, вносят преимущественно нейтральные механизмы. Случайный отбор геномных вариантов достигался, по-видимому, не только вследствие процессов, описанных в предьщущем разделе, но и в результате передачи малых доз вируса от человека человеку. Низкая множественность инфекции, наряду со случайным отбором могут обеспечить фиксацию как нейтральных, так и потенциально нежелательных мутаций. В результате, общая жизнеспособность вируса будет более или менее постоянной, а может и снижаться (Chao, 1990). Этим может объясняться как низкий уровень заболеваемости полиомиелитом ( 1%; Melnick, 1996) при циркуляции диких штаммов полиовируса среди неиммунного населения, так и обычно длительный латентный период между прививкой и возникновением заболевания у иммунодефицитных лиц. Наши данные об эпизодах позитивной селекции как в популяции диких вирусов (нелинейное увеличение числа несинонимичных замен на участке VP1 штамма 5341UKR92), так и у вакцинно-родственных штаммов (вероятное повышение мутабельности участка 2АВ) свидетельствуют о колебаниях уровня жизнеспособности вируса в ходе его эволюции. Возникающие нежелательные мутации могут быть устранены негативной селекцией или внутри/межтиповой рекомбинацией (Cammack et al., 1988; Furione et al., 1993; Georgescu et al., 1994; Lipskaya et al., 1991; Minor, 1986). Следует отметить, что рекомбинанты были обнаружены нами в обеих популяциях. Появление более жизнеспособных и, вероятно, более нейровирулентных вариантов, может являться причиной заболевания вакцинно-ассоциированным полиомиелитом или приводить к возникновению вспышек полиомиелита при циркуляции диких вирусов.
