Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Общая характеристика аденовирусов 13
1.2. Структурные белки капсида Ад 16
1.2.1. Гексон 16
1.2.2. Основание пентона 17
1.2.3. Шип 17
1.2.4. Белок pIX 23
1.3. Инфекционный цикл Ад 24
1.3.1. Проникновение Ад в клетки 24
1.3.2. Дезинтеграция вириона 26
1.3.3. Экспрессия генов и репликация ДНК 26
1.3.4. Сборка вирусных частиц и выход их из клетки 28
1.4. Рецепторы, используемые Ад для проникновения в клетки 30
1.4.1. Первичные рецепторы 30
1.4.2. Вторичные рецепторы 34
1.5. Стратегии таргетинга 36
1.6. Трансдукционный таргетинг 37
1.6.1. Нацеливание Ад с помощью комплексов "адаптер-лиганд" 39
1.6.2. Генетическая модификация тропизма Ад 47
1.6.2.1. Таргетинг Ад с помощью замещения шипов или ГД шипов 48
1.6.2.2. Таргетинг Ад с помощью генетического включения лиганда в капсидные белки 51
1.6.2.2.1. Модификация основания пентона 52
1.6.2.2.2. Модификация гексона 54
1.6.2.2.3. Модификация белка pIX 55
1.6.2.2.4. Модификация ГД шипа 56
1.6.2.2.4.1. Встраивание лигандов на С-конец ГД шипа 56
1.6.2.2.4.2. Встраивание лигандов в ш-петлюшипа 58
1.6.2.3. Замена шипа химерным белком 62
1.6.3. Клеточные линии для получения нацеленных векторов 64
1.7. Аденовирусные векторы как терапевтические агенты 66
Глава 2. Материалы и методы 70
2.1. Материалы 70
2.1.1. Бактериальные штаммы 70
2.1.2. Эукариотические клетки 70
2.1.3. Антитела и белки 71
2.1.4. Реактивы 73
2.2. Молекулярно-биологические методы 73
2.2.1. Методы, используемые в молекулярном клонировании 73
2.2.2. Получение рекомбинантных плазмид 74
2.2.3. Экспрессия рекомбинантных белков в бактериальных клетках и их очистка 82
2.2.4. Экспрессия белка FF/CD40L в эукариотических клетках 83
2.2.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Иммуноблоттинг 84
2.2.6. Иммуносорбционный ферментный анализ 84
2.2.7. Проточная цитофлюориметрия 85
2.3. Методы, используемые при работе с аденовирусами 85
2.3.1. Гомологичная рекомбинация ъЕ.соИ 85
2.3.2. Трансфекция 86
2.3.3. Наработка вирусов 86
2.3.4. Определение физического и инфекционного титров Ад 87
2.3.5. Выделение ДНК из вирионов 88
2.3.6. Трансдукция клеток Ад векторами 88
2.3.7. Определение кинетики развития вирусной инфекции 89
2.3.8. Радиомечение белков 358-метионином 89
2.3.9. Мечение вирусов [метил-3Н] тимидином 90
2.3.10. Связывание меченых 3Н-тимидином Ад с клетками 90
2.3.11. Выделение нерастворимых белков из клеток инфицированных Ад...91
Глава 3. Результаты 92
3.1. Получение нацеленных аденовирусов с полипептидными лигандами, встроенными вШ-петлю ГД шипа 92
3.1.1. Получение вирусов с удлинёнными Ш-петлями и подтверждение их структуры 92
3.1.2. Сравнение продуктивности и инфекционности вирусов с модифицированными шипами 93
3.1.3. Изучение механизмов проникновения вирусов Ad5Luc.NNRGD в клетки 96
3.1.4. Получение шаттл-векторов, позволяющих встраивать полипептидные лиганды в удлинённые Ш-петли 98
3.1.5. Характеризация вирусов со встройкой полипептида V1P в модифицированные шипы 100
3.2. Разработка стратегии таргетинга Ад векторов, основанной на замещении ГД шипа 105
3.2.1. Конструирование и характеризация химерного белка FF/6H 105
3.2.2. Получение аденовируса с химерным шипом FF/6H 109
3.2.3. Определение механизма, обеспечивающего связывание Ad5LucFF/6H с клетками 113
3.2.4. Развитие инфекции в клетках, инфицированных Ad5LucFF/6H 118
3.2.5. Выбор CD40L в качестве нацеливающего вирус лиганда 124
3.2.6. Получение химеры шип-фибритин, содержащей CD40L 126
3.2.7. Получение и характеризация аденовируса, несущего химерный шип FF/CD40L 128
3.2.8. Включение дополнительного шипа в вирионы, несущие химерный umnFF/CD40L 133
3.2.9. Нацеливание СВ40Ь-содержащих вирусов к дендритным и раковым клеткам 136
Глава 4. Обсуждение результатов 140
Выводы 153
Список использованной литературы 154
- Структурные белки капсида Ад
- Молекулярно-биологические методы
- Методы, используемые при работе с аденовирусами
- Разработка стратегии таргетинга Ад векторов, основанной на замещении ГД шипа
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Генная терапия сформировалась на рубеже 1980-х и 1990-х годов как альтернативный подход к лечению наследственных и приобретённых заболеваний. Проведённые в течение более чем десятилетнего периода исследования привели к разработке ряда терапевтических протоколов, наиболее эффективные из которых находятся сейчас в стадии клинических испытаний. Заметные успехи были достигнуты при лечении кистозного фиброза, коронарной болезни сердца, а также различных типов рака (Hamid et al., 2003, Kubo et al., 2003, Lamont et al., 2000, Makower et al., 2003, Nemunaitis et al., 2001, Rosengart et al., 1999, Schuler et al., 2001). Однако, наряду с достигнутыми впечатляющими результатами, генно-терапевтические исследования выявили ряд фундаментальных проблем, препятствующих полной реализации этой медико-биологической концепции. Центральной из них является проблема эффективной и селективной экспрессии терапевтического гена в поражённой болезнью ткани. Решение этой проблемы требует разработки как новых методов, так и средств доставки генов к месту назначения безопасным и эффективным способом, предъявляя строгие критерии к системам, обеспечивающим доставку генетического материала - так называемым "векторам". Прежде всего, терапевтический вектор должен быть стабилен in vivo в течение времени, необходимого для эффективной трансдукции поражённой ткани. Во-вторых, вектор не должен быть токсичным, онкогенным и иммунногенным. В идеале, доставка гена должна быть тканеспецифичной, с тем, чтобы с одной стороны, усилить терапевтический эффект в области развития патологии, а с другой -минимизировать потенциально негативное воздействие продукта терапевтического гена на здоровые органы и ткани. Помимо вышесказанного, вследствие разнообразия способов и случаев применения генных векторов, они должны быть способны инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки.
Хотя критический анализ существующих на сегодняшний день вирусных и невирусных векторных систем свидетельствует о том, что ни одна из них не удовлетворяет вышеперечисленным требованиям во всей полноте, общепризнано, что аденовирусы (Ад) человека являются наилучшими кандидатами в векторы для генной терапии. Ад имеют следующие преимущества перед другими векторными
системами: (1) они способны эффективно трансдуцировать широкий спектр разных типов клеток, как делящихся, так и покоящихся; (2) Ад сохраняют высокую инфекционность in vivo; (3) Ад человека не являются онкогенными; (4) разработанная методология позволяет получать репликативно дефектные производные Ад, способные размножаться только в специально сконструированных клеточных линиях, а потому безопасные при терапевтическом использовании; (5) значительный объём генетического материала (до 36 т.п.н.) может быть встроен в Ад вектор, что, при условии замещения всех генов Ад, позволяет клонировать в них полные копии генов млекопитающих; (6) современная технология производства и очистки Ад даёт возможность получения векторных препаратов, пригодных для клинического применения в масштабе свыше 1014 вирионов и с титрами до 1013 частиц на мл, таким образом снижая производственные затраты.
В совокупности эти преимущества привели к широкому использованию Ад векторов в генной терапии для доставки терапевтических и репортёрных генов, а также к разработке так называемых онколитических Ад, способных разрушать злокачественные опухоли за счёт селективной репликации в раковых клетках.
Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в разработке Ад векторов для генной терапии, на сегодняшний день сохраняется необходимость преодоления трёх основных недостатков этой системы генной доставки: (1) вызываемый векторами иммунный ответ, (2) неспособность Ад векторов эффективно инфицировать определённые типы клеток-мишеней и (3) отсутствие тканевой селективности, которая приводит к неконтролируемой трансдукции как клеток-мишеней, так и клеток здоровых тканей и значительно снижает эффективность терапии.
Первая из перечисленных проблем решается разработкой как методов непосредственного снижения иммуногенности и иммунореактивности Ад (конструирования так называемых «выпотрошенных» векторов, из геномов которых удалены все вирусные гены; химической «маскировки» вирусного капсида и т. д.) (Croyle et al., 2001, Fisher et al., 2001, Kochanek et al., 1996, O'Riordan et al., 1999, Pastore et al., 1999), так и попытками использовать временное подавление иммунной системы пациента или очистку крови пациента от анти-Ад антител как средство снижения иммунного пресса на используемый
вирусный вектор (Chen et al., 2000, Fang et al., 1995, Han et ah, 1997, Jooss et al., 1996, Lochmuller et al., 1996).
Главной целью данного исследования являлась разработка подходов к решению двух последних из перечисленных выше проблем, характерных для Ад векторов. Поскольку эти проблемы являются прямым следствием природного тропизма Ад, наша стратегия создания ткане-специфичных, или "нацеленных" Ад векторов, основана на модификации природного механизма взаимодействия вируса с клеткой, с тем, чтобы обеспечить эффективную и специфичную доставку терапевтического гена в клетки-мишени (траисдукционный таргетинг). Два подхода для получения нацеленных Ад, основанные на генетическом включении в состав векторного вириона молекул лигандов, были разработаны в представленной работе.
Цель работы.
Целью настоящей работы являлась разработка новых стратегий получения нацеленных Ад векторов для генной терапии. В качестве методологической основы этих стратегий были использованы (а) модификация глобулярного домена (ГД) шипа Ад5 и (б) замещение шипа химерными молекулами.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Получить серию Ад векторов, содержащих в Ш-петле ГД шипа
увеличивающиеся по размеру встройки фрагментов гипервариабельной петли
основания пентона (ОП) Ад5.
Установить зависимость продуктивности вирусной инфекции, инфекционности вирусов и их рецепторной специфичности от размера встроек в Ш-петле.
Создать серию шаттл-плазмид, позволяющих быстро и эффективно встраивать полипептидные лиганды в удлинённые Ш-петли всех полученных конструкций.
Используя вновь сконструированные шаттл-плазмиды, получить Ад векторы, содержащие в составе удлинённой HI-петли вазоактивный полипептид тонкого кишечника (VIP), и охарактеризовать их продуктивность, инфекционность и взаимодействие с рецепторами.
5. Сконструировать химерную молекулу-прототип шип-фибр итин-лиганд,
предназначенную для нацеливания Ад вектора посредством замещения шипа в
капсиде Ад.
Продемонстрировать способность фибритина бактериофага Т4 выполнять тримеризующую и лиганд-представляющую функции в составе химерной молекулы.
Продемонстрировать способность химеры встраиваться в Ад вирионы и обеспечивать их связывание с искусственным рецептором (ИР).
Изучить влияние делеции большей части последовательности шипа в составе химеры на инфекционность вирусов, несущих химерный шип.
Установить, сохраняет ли TNF-подобный домен CD40L свою функциональную структуру в отсутствие внутренней дисульфидной связи, и совместима ли его структура со структурой химеры шип-фибритин.
10. Сконструировать Ад вектор, капсид которого содержит химеру шип-
фибритин-СО40Ь вместо шипа дикого типа, а также мозаичную версию этого
вектора, включающую помимо химерного шипа, полноразмерный шип Ад5 с мутацией в сайте связывания с природным Ад рецептором, КАР. 11. Определить эффективность связывания этих вирусов с CD40 и трансдукции ими СБ40-положительньіх клеток.
Научная новизна и практическая ценность.
Впервые продемонстрирована возможность встраивания полипептидов размером до 111 а.о. в Ы-петлю ГД шипа. Эти данные позволили коренным образом пересмотреть сложившиеся ранее представления о том, что выбор лигандов для нацеливания Ад векторов ограничен короткими пептидными молекулами. На основании полученных нами результатов был сделан вывод о возможности нацеливания Ад за счёт модификации ГД шипа полипептидными лигандами, что значительно расширяет репертуар как лигандов, так и рецепторов-мишеней пригодных для таргетинга Ад.
Сконструирована серия шаттл-плазмид, позволяющая эффективно и быстро клонировать кодирующие лиганд последовательности в Ш-петли ГД шипа, удлинённые разными по величине фрагментами гибкой петли ОП, для оптимального представления нацеливающих лигандов рекомбинантным шипом.
Продемонстрировано, что VIP-содержащий вектор, полученный с использованием этих шаттл-плазмид, обладает повышенной инфекционностью на КАР-негативных клетках, что делает его потенциально полезным для доставки генов в такие клетки.
Разработана принципиально новая стратегия таргетинга, основанная на замещении шипа Ад химерной молекулой и позволяющая решить две главные задачи, связанные с нацеливанием Ад векторов: разрешение структурной и функциональной несовместимости лиганда и шипа, а также обеспечение специфичного связывания с рецептором-мишенью.
Установлено, что созданная химерная молекула эффективно тримеризуется при генетическом слиянии с нацеливающими белковыми лигандами, обладающими сложной третичной конформацией, и сохраняет способность встраиваться в Ад вирионы.
Выдвинута и подтверждена гипотеза о том, что встраивание в капсид Ад векторов, несущих химерный шип, дополнительного полноразмерного шипа Ад5,
с мутацией в КАР-связывающем сайте, увеличивает их инфекционность, не изменяя при этом специфичность связывания с рецептором-мишенью.
Сконструированы нацеленные к CD40 Ад векторы, эффективно и специфично трансдуцирующие дендритные и опухолевые клетки яичников и мочевого пузыря человека. Эти векторы являются наиболее эффективными из известных в настоящее время средств доставки генов в названные типы клеток-мишеней, а потому могут служить прототипами терапевтических векторов для генетической иммунизации против рака и инфекционных агентов. Альтернативно, сконструированные на их основе условно-репликативные вирусы могут быть использованы для уничтожения метастазирующих злокачественных, CD40-экспрессирующих опухолей посредством их селективной трансдукции.
Положения, выносимые на защиту:
Получение серии из восьми Ад векторов, Ad5LucNNRGD, содержащих встройки размером от 13 до 83 а.о. в Ш-петле ГД шипа Ад5 и подтверждение их структуры.
Определение влияния размера встроек в Ш-петле на продуктивность вирусной инфекции, инфекционность вирусов и их тропизм.
Создание серии шаттл-плазмид pHI.PBNN, позволяющих быстро и эффективно встраивать полипептидные лиганды в удлинённые Ш-петли всех восьми конструкций.
Получение вирусов Ad5LucNNVIP, со встройкой VIP в Ш-петлях, содержащих дополнительные линкеры размером 5, 10, 35 и 40 а.о. Изучение механизмов проникновения модифицированных вирусов в клетки.
Создание химерной молекулы шип-фибритин-бНІБ-таг (FF/6H), предназначенной для замещения шипа в капсиде Ад. Определение способности химеры тримеризоваться, встраиваться в Ад вирионы и обеспечивать их связывание с искусственным рецептором (ИР).
Определение, насколько критичной для правильной упаковки и связывания с рецептором является присутствующая в CD40L дисульфидная связь.
Создание химерной молекулы шип-фибритин, включающей в качестве лиганда TNF-подобный домен CD40L.
Получение вектора, несущего химерный СО40Ь-содержащий шип. Определение его инфекционное и специфичности взаимодействия с CD40.
Создание мозаичного вектора, содержащего помимо химерного шипа, полноразмерный шип Ад5 с мутацией в КАР связывающем сайте. Сравнение его инфекционности с инфекционностью вируса содержащего только химерный шип.
10. Сравнение эффективности транедукции дендритных и опухолевых клеток
человека СО40Ь-содержащими вирусами с таковой немодифицированного
вируса, содержащего шип дикого типа.
Апробация и публикации.
Результаты работы были представлены на Международном Конгрессе по Биотехнологии "Biotechnology 2000" (Берлин, Германия, 2000), на Международном Симпозиуме "Genetic Anticancer Agents" (Валенсия, Испания, 2001), на Международном Вирусологическом Конгрессе (Париж, Франция, 2002), на Международном Конгрессе "New Trends in Cancer Therapy" (Ровиго, Италия, 2002), на Третьей, Четвёртой и Пятой Ежегодной Конференции Атепсап Society of Gene Therapy (Денвер, Колорадо, 2000; Сиэттл, Вашингтон, 2001; Бостон, Массачусетс, 2002), на конференции 'Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery" в Cold Spring Harbor (Cold Spring Harbor, 2001), на Ежегодном-Медицинском Форуме в University of Alabama at Birmingham, UAB (Бирмингем, Алабама, 2001 и 2002). Результаты обсуждались на семинаре в Gene Therapy Center, UAB (Бирмингем, Алабама, июль 2003). По материалам работы опубликованы 4 статьи и тезисы 9 конференций:
Krasnykh V., Dmitriev I., Navarro J.G., Belousova N., Kashentseva E., Xiang J., Douglas J.T., Curiel D.T. Advanced generation adenoviral vectors possess augmented gene transfer efficiency based upon coxsackie adenovirus receptor-independent cellular entry capacity.// Cancer Research. - 2000. - Vol.60. №.24. P.6784-87.
Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Mikheeva G., Curiel D.T. Genetic targeting of adenovirus vector via replacement of the fiber protein with the phage T4 fibritin.// Journal of Virology. - 2001. - Vol.75. №.9. P.4176-83.
Belousova N., Krendelchtchikova V., Curiel D.T. and Krasnykh V. Modulation of Adenovirus Vector Tropism via Incorporation of Polypeptide Ligands into the Fiber Protein.//Journal of Virology. - 2002. - Vol.76. №.17. P.8621-31.
Belousova N., Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Mikheeva G., Aldrich W., Triozzi P., Curiel D.T., and Krasnykh V. Genetically targeted adenovirus vector directed to CD40-expressing cells.// Journal of Virology, (в печати).
Krasnykh V., Mikheeva G., Belousova N., Korokhov N., and Curiel D. T. Genetic replacement of the adenovirus fiber protein as a strategy to develop targeted vectors for cell-specific gene delivery.// Molecular Therapy. - 2000. - Vol.1. №.5. P.176.
Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Mikheeva G., and Curiel D. T. Genetic replacement of the adenovirus fiber protein as a strategy to develop targeted vectors for cell-specific gene delivery.// The World Congress on Biotechnology. Berlin, Germany, September 3-8, 2000. Abstr. Book. P.65-66.
Belousova N., Mikheeva G., Korokhov N.. Curiel D.T., Krasnykh V. Derivation of targeted adenovirus vectors for cell-specific gene delivery via genetic replacement of the fiber protein.// Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery. Cold Spring Harbor, New York, March 15-18, 2001. Abstr. Book. P.14.
Belousova N., Curiel D.T., Krasnykh V. Generation of recombinant adenoviral vectors containing fiber proteins with extended Ш-loops.// Molecular Therapy. - 2001.-Vol. 3(5), P. 168.
Belousova N., Krendelshchikova V., Curiel D.T. and Krasnykh V. Generation of targeting adenoviral vectors containing fibers with extended HI-loops.// 2001 Annual Research Retreat. The Medical Forum, Birmingham, Alabama, October 22, 2001. Abstr. Book. P.77.
Krasnykh, V., Korokhov, N., Belousova, N., Simonenko, V., Krendelchtchikova, V., Mikheeva, G., and Curiel, DT. Derivation of truly targeted adenovirus vectors by the fiber replacement technology.// Xllth International Congress of Virology. Paris, France, July 27-August 1, 2002. Abstr. Book.
Belousova N., Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Curiel D.T., and Krasnykh V. Novel genetically targeted adenovirus vector directed to CD40-expressing cells.// Molecular Therapy. - 2002. - Vol. 5(5). P. 201.
Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Krendelchtchikova v., Simonenko V., Curiel D.T. Targeted Adenovims Vectors For Gene Therapy of Cancer.// The 3rd International Cancer Congress "New Trends in Cancer Therapy". Rovigo, Italy, December 5, 2002. Abstr. Book.
Belousova N., Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Aldrich W., Triozzi P., Curiel D.T. and Krasnykh V. Novel Genetically Targeted Adenovirus Vector Directed to Dendritic Cells.// 2002 Annual Research Retreat. The Medical Forum, Birmingham, Alabama, October 28, 2002. Abstr. Book. P.92.
Благодарности
Автор выражает глубокую благодарность В.Н. Красных за помощь и руководство работой, Н.П. Корохову за обсуждение результатов по ходу выполнения работы, В.Г. Крендельщиковой за участие и помощь в работе, А.В. Перебоеву, В.В. Терновому и С.А Шестопал за критические замечания при прочтении рукописи.
Структурные белки капсида Ад
Основными белками капсида являются гексон, основание пентона (ОП) и шип. Гексон, наиболее представленный белок капсида (720 копий), выполняет структурную функцию, формируя грани икосаэдра. Каждая из 12 вершин икосаэдрического капсида занята капсомером, именуемым пентоном, в состав которого входят ОП и шип. Пять идентичных субъединиц ОП ассоциированы в единый комплекс, создавая таким образом место прикрепления к капсиду гомотримерного шипа (Ginsberg et al., 1966). Компоненты пентона выполняют ключевую роль на ранних стадиях взаимодействия вируса с инфицируемой клеткой.
Детальное рассмотрение механизмов этого взаимодействия представлено в Разделе 1.4.2. 1.2.1. Гексон. Гексон является тримером полипептида II (967 а.о.) с молекулярным весом субъединицы 109 кДа. Для сборки тримера необходимо участие белка с массой 100 кДа, кодируемого Ад (Cepko and Sharp, 1982). Тримеры гексона организованы в группы из 9 гексонов - наномеры, формированию которых способствуют белки XI, XIII и IX (Everitt et al., 1973). Современная модель тримерной молекулы гексона Ад5 предложена на основе данных рентгеноструктурного анализа (Rux and Burnett, 2000). Согласно этой модели, основание каждого мономера гексона состоит из двух Р-цилиндров, сформированных восемью Р-слоями. Мономеры в составе комплекса удерживаются многочисленными взаимодействиями между длинными петлями (LI, L2 и L3) гексоновых субъединиц, которые переплетаются в тримере и формируют вершину треугольной формы. Шесть Р-цилиндров входящих в состав каждого тримера гексона, формируют кольцо с псевдогексогональной симметрией, которое обеспечивает плотную упаковку с шестью соседними капсомерами в икосаэдрический капсид. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности гексонов Ад разных серотипов показал, что в то время как большинство последовательностей в основании гексона являются консервативными, в петлях L1 и L2 присутствуют 7 гипервариабельных районов (ГВР) (Crawford-Miksza and Schnurr, 1996), во многом определяющих антигенный профиль разных серотипов Ад. У Ад2 и Ад5 в петле L1 расположен кластер кислых аминокислот (около 30 а.о.) (Rux and Burnett, 2000), который отсутствует в гексонах Ад 12 и Ад37, и замещён более длинным кластером основных аминокислот в гексоне Ад8 (Crawford-Miksza and Schnurr, 1996). 1.2.2. Основание пентона. ОП является гомопентамером полипептида V (571 а.о.) с молекулярным весом субъединицы 63 кДа. В отличие от гексона, ОП принимает функциональную конформацию без участия вспомогательных белков. Сравнение аминокислотных последовательностей ОП Ад, относящихся к разным подгруппам, выявило высокую степень гомологии на протяжении всей молекулы, за исключением центрального гипервариабельного района, длина которого варьирует у Ад разных серотипов (Nemerow and Stewart, 1999).
Последовательность ГВР формирует две а-спирали, между которыми расположен центральный консервативный трипептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) (Neumann et al., 1988), способный взаимодействовать с несколькими типами интегринов (Mathias et al., 1994, Nemerow and Stewart, 1999). Согласно данным крио-электронной микроскопии, над поверхностью пентамерного ОП выступает пять гибких петель (Stewart et al., 1997), что приводит к предположению о том, что упомянутые выше ГВР структурно соответствуют выступающим петлям и RGD rpHnenrafl расположен в их вершинах. RGD-мотив обнаружен в ОП всех известных серотипов Ад человека, за исключением относящихся к подгруппе F Ад40 и Ад41 (Davison et al., 1993). 1.2.3. Шип. Подобно шипам всех других серотипов Ад, шип Ад5 является гомотримером. Каждый из мономеров шипа Ад5 представлен полипептидом IV (582 а.о.) с молекулярным весом 62 кДа. За исключением Ад40 и Ад41, вирионы которых содержат шипы двух различающихся по длине типов, в капсидах всех остальных Ад присутствует шип только одного типа. Несмотря на наличие двух вариантов шипа у Ад40 и Ад41, каждая из вершин их капсидов содержит только один шип. Таким образом, все Ад имеют 12 шипов, по одному на каждый пентон (Yen et al., 1994). Шипы Ад2 и Ад5 гликозилированы (Caillet-Boudin et al., 1989, Mullis et al., 1990), но до сих пор не известно, играет ли гликозилирование какую-либо роль в формировании вторичной структуры шипа, его сборке, стабильности или функциональности. В шипах всех серотипов
Ад выделяют три основные домена — N-концевой хвостовой домен (ХД), центральный домен (ЦД) и С-концевой глобулярный домен (ГД) (Рис. 1.2.3.1А) (Green et al., 1983). Структурно-функциональная организация шипов такова, что каждый из трех доменов выполняет определённые биологические функции, продиктованные особенностями его конфигурации и положением внутри тримерной молекулы. Например, короткий ХД (46 а.о. в шипах Ад2 и Ад5) обеспечивает встраивание шипов в вирион и перенос синтезируемых шипов из цитоплазмы в ядро. Первая из этих функций обеспечивается нековалентным взаимодействием определённой последовательности ХД (FNPVYD у Ад2) (Hong and Boulanger, 1995) с ОП. Высокая консервативность последовательности ХД среди шипов Ад большинства серотипов (Arnberg et al., 1997, Chroboczek et al., 1995) делает возможным встраивание шипа одного из них в ОП другого. К примеру, было показано, что шип Ад5 способен встраиваться в капсид АдЗ (Von Seggern et al., 1998), шип Ад2 образует комплексы с ОП АдЗ (Fender et al., 1997), а шип Ад7 ассоциирует с капсидом Ад5 (Gall et al., 1996). До сих пор не известно, встроен ли N-конец шипа в центральное углубление в ОП или прикрепляется к его внешней поверхности. Направленные на выяснение этого вопроса исследования показали, что хотя крио-электронная микроскопия не обнаруживает пустот в ОП в отсутствие шипа, при формировании полного пентона RGD-содержащая петля ОП сдвигается наружу (Schoehn et al., 1996, Von Seggern et al., 1999). Косвенно поддерживают гипотезу о погружении ХД шипа в ОП данные электронной микроскопии, показывающие что индивидуальный шип на 40А длинее, чем шип в комплексе с ОП (Ruigrok et al., 1990). Вторая функция ХД - транспорт вновь синтезированных шипов в ядро клетки - обеспечивается сигналом ядерной локализации KRA.R (А, соответствует аминокислотам G, А, Т, S, V и L), расположенном в положении 2-5 полипептида. В своей работе Hong и Engler показали, что мутантные шипы Ад2 с делецией последовательности KRAR не способны переноситься в ядро и после синтеза накапливаются в цитоплазме. В то же время, добавление на N-конец таких шипов последовательности TKRVRL, присутствующей в ХД шипа Ад7, восстанавливало правильный транспорт (Hong and Engler, 1991). Функции карбокси-концевого ГД шипа (180-225 а.о.) во многом определены его трёхмерной структурой, модель которой была предложена на основании данных рентгено-структурного анализа рекомбинантной формы ГД шипа Ад5 (Xia et al., 1994). Опубликованные позднее модели ГД для серотипов 2 (van Raaij et al., 1999), 3 (Durmort et al., 2001) и 12 (Bewley et al., 1999) показали высокую структурную гомологию шипов всех четырёх серотипов. Согласно принятой в настоящее время модели, ГД Ад5 имеет структуру трёхлопастного пропеллера, каждая из лопастей которого представлена сэндвичем, сформированным двумя антипараллельными Р-слоями (V и R) (Рис. 1.2.3.1 Б, В). V и R слои расположены по отношению друг к другу под углом —30. Каждый слой состоит из Р-цепей (от А до J), в сумме составляющих 35% структуры
ГД, которые соединены петлями и поворотами (Рис. 1.2.3.2.). р-цепи G, Н, I и D формируют R-слой направленный от поверхности вириона. R-слой и Ш-петля формируют "аллеи" на поверхности ГД. р-слой V, структура которого высоко консервативна у разных серотипов Ад, состоит из Р-цепей J, С, В и А, поддерживающих структуру тримера. ГД выполняет две важные для вируса функции: он инициирует тримеризацию мономеров шипа (Hong and Engler, 1996, Novel li and Boulanger, 1991) и отвечает за связывание Ад с его первичным клеточным рецептором (Defer et al., 1990, Henry et al., 1994, Louis et al., 1994, Xia et al., 1994). В этой связи необходимо отметить, что тримерная конформация шипа является необходимым условием для его ассоциации с ОП и образования зрелых вирионов, так как мономерные шипы не способны формировать капсомер (Novelli and Boulanger, 1991). Тот факт, что рекомбинантные белки, представляющие ГД, способны образовывать тримеры позволяет предположить, что сборка шипа начинается с упаковки и тримеризации ГД. Это предположение косвенно подтверждается данными группы Chroboczek, которая показала, что процесс расплетения тримерного шипа Ад2, приводящий к образованию мономеров, начинается на N
Молекулярно-биологические методы
Работу с бактериальными культурами вели согласно протоколам, описанным в сборнике основных протоколов молекулярной биологии (Sambrook et al., 1989). Плазмидные ДНК, а также фрагменты ДНК, наработанные ПЦР или полученные в результате эндонуклеазной рестрикции, выделяли и очищали с использованием наборов QIAGEN Plasmid Mini Kit, QIAGEN Plasmid Midi Kit, QIAGEN Plasmid Maxi Kit, QIAGEN PCR Kit, QIAGEN Gel Purification Kit (Qiagen) согласно инструкциям фирмы-производителя. Трансформацию бактерий плазмидной ДНК проводили электропорацией с использованием прибора Eppendorf Electroporator 2510 (Eppendorf Scientific Inc., Madison, WI, USA) в кюветах с расстоянием между электродами 2 мм при электроимпульсе 1,8 кВ согласно инструкции к прибору. Реакции эндонуклеазной рестрикции проводили согласно рекомендациям производителей ферментов (New England Biolabs, Beverly, MA, USA; Promega, Madison, WI, USA). Продукты реакций анализировали электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле (ПААГ). Реакцию дефосфорилирования ДНК проводили с использованием щелочной фосфатазы из кишечника телёнка (Amersham), реакцию дотирования - с использованием ДНК лигазы фага Т4 (Promega) согласно рекомендациям фирм-производителей. ПЦР проводили с Taq ДНК-полимеразой (Qiagen) или с Pfu ДНК-полимеразой (Stratagene) в соответствии с инструкциями компаний-поставщиков. Программу амплификации адаптировали для каждой пары праймеров. Секвенирование ДНК осуществляли с использованием набора SeqDTCS-Quick Start Kit производимым Beckman Coulter Inc. (Fullerton, CA, USA) no прилагающемуся к нему протоколу с последующим капиллярным электрофорезом в автоматическом секвенаторе SEQ2000 (Beckman Coulter Inc.). Данные анализировали с использованием программы Gene Works 2.2 (Intelligenetics Inc., Campbell, CA USA).
Праймеры для секвенирования и ПЦР, выбранные с помощью программы Oligo 4 (National Bioscience, Plymouth, MN, USA), а также структурные олигонуклеотиды были синтезированы компанией Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA). Последовательности олигонуклеотидов, используемые в работе, приведены в Таблице 2.2.1. 2.2.2. Конструирование рекомбинантных плазмид. Для получения генов, кодирующих рекомбинантные шипы со встройками RGD-содержащих последовательностей из ОП Ад5, продукты ПЦР или олигонуклеотидные дуплексы, соответствующие фрагментам гена ОП, клонировали в шаттл-вектор рХКДШ, гидролизованный эндонуклеазой EcoRV. Этот вектор был сконструирован на основе описанной ранее плазмиды pNEB.PK3.6 (Krasnykh et al., 1998) для клонирования гетерологичных ДНК в последовательность Ш-петли ГД гена шипа. Чтобы получить рХКАШ, вначале из pNEB.PK3.6, несущей ген шипа Ад5 дикого типа, удалили фрагмент ХЬаІ-ХЬаІ, содержащий неизвестную последовательность ДНК вируса Ad5Luc3 (Mittal et al., 1993). Затем в полученной таким образом плазмиде рХКЗ.1 заменили BsOQ-Mfel фрагмент на аналогичный фрагмент из плазмиды pQE.KnobAHI (Krasnykh et al., 1998). Полученная в результате плазмида рХКАШ содержала ген шипа со встройкой сайта узнавания для эндонуклеазы EcoRV и делецией 8 нуклеотидов в Ш-петле (кодоны Thr545, Thr546 и Pro547). Чтобы восстановить эту делецию, последовательность, кодирующая удалённые кодоны, была включена в состав всех используемых для последующего клонирования олигонуклеотидов. Фрагменты ДНК, соответствующие RGD-содержащим пептидам минимального размера, 13 а.о. (13RGD) и 23 а.о. (23RGD), были получены отжигом олигонуклеотидов "RGD-Іоор.ІЗТ" и "RGD-loop.l3B"; "RGD-loop.23T" и "RGD-1оор.23В" попарно. Последовательности, соответствующие более длинным пептидам - 33, 43, 53, 63, 73 и 83 а.о. (33RGD - 83RGD) - были амплифицированы из геномной ДНК Ад5 с использованием следующих пар праймеров: "RGD-loop.33F" и "RGD-loop.33R"; "RGD-loop.43F" и "RGD-loop.43R"; "RGD-loop.53F" и "RGD-loop.53R"; "RGD-loop.63F" и "RGD-loop.63R"; "RGD-loop.73F" и "RGD-loop.73R"; "RGD-loop.83F" и "RGD-loop.83R". Плазмиды, содержащие RGD-кодирующие последовательности назвали PXK.FHI13RGD - pXK.Fra83RGD (или pXK.FmNNRGD, где NN соответствует числу встроенных в Ш-петлю а.о.).
Геномы рекомбинантных Ад, содержащие гены модифицированных шипов, были получены после гомологичной рекомбинации между фрагментами EcoRI-Dral, выделенными из шаттл-векторов pXICFmNNRGD, и плазмидой pVK700, линеаризованной эндонуклеазой Swal (Подробнее см. Раздел 2.3.1.). Полученные после такой рекомбинации плазмиды назвали pVK.713 - pVK718 (встройки последовательностей 13RGD-63RGD), pVK727 и pVK728 (встройки последовательностей 73RGD и 83RGD). Для того чтобы заместить RGD-кодирующую последовательность в плазмидах PXK.FHINNRGD линкером, содержащим сайт узнавания эндонуклеазы Bael, фрагменты BsOQ-Mfel в этих плазмидах заменили гомологичными последовательностями, собранными из трёх фрагментов. Участки ДНК, прилежащие к последовательности, кодирующей RGD, были амплифицированны с помощью метода "sticky end" ПЦР (Zeng, 1998). В качестве матриц для ПЦР использовали геномы вирусов Ad5Luc.NNRGD. Последовательность ДНК, расположенная перед RGD-кодирующим районом в Ad5Luc.l3RGD, была амплифицирована с использованием праймеров "BstXI.F.short" и "RGD.R.long", "BstXI.F.long" и "RGD.R.short". Последовательность, расположенная вслед за этим сайтом, была амплифицирована с праймерами "RGD.F.short" и "Mfel.Rshort", "RGD.F.long" и "MfeI.R.long". Последовательности, фланкирующие RGD трипептид в геномах остальных вирусов Ad5Luc.NNRGD, были амплифицированы с использованием праймеров "BstXI.F.short" и "RGD20.R.long", "BstXI.F.long" и "RGD20.Rshort", "RGD20.F.short" и "Mfel.Rshort", "RGD20.F.long" и "MfeI.R.long". Продукты ПЦР, соответствующие одинаковым фланкирующим последовательностям, но полученные с помощью разных пар праймеров, смешивали в эквимолярных количествах, денатурировали и отжигали, что приводило к образованию у части из них липких концов, комплементарных концам вектора. Продукты "sticky end" ПЦР, содержащие BstXI- и Л ёУ-совместимые липкие концы, смешивали затем с дуплексом, являющимся сайтом узнавания для эндонуклеазы Bael, полученным после отжига олигонуклеотидов "Bael-stufFer.T" и "Bael-stuffer.B" и лигировали с вектором рХК.3.1, гидролизованным эндонуклеазами BstXI и Mfel. Конечные шаттл-плазмиды, содержащие линкер Bael, получили название pHI.PBNN (рШ.РВЮ - рМ.РВ80). Схема клонирования представлена на Рисунке 2.2.2. Для того чтобы получить рекомбинантные гены, кодирующие шипы со встройками вазоактивного полипептида тонкого кишечника (VIP) в удлинённые Ш-петли, плазмиды серии pHI.PBNN гидролизовали Bael и клонировали в них дуплексы, полученные после отжига олигонуклеотидов "VIP.T" и "VIP.B". Новые плазмиды назвали pHI.PBNNVIP. Ген рекомбинантного шипа, кодирующий белок со встройкой мутантного VIP, VIP18 23, сконструировали встраиванием дуплекса, состоящего из олигонуклеотидов «Yip18-23.!"" и "VIP1823.B" в Bael-сшт рНІ.РВІО.
Полученная плазмида была названа рЩ.РВ 10VIP18"23. Сегмент гена фибритина, соответствующий карбокси-концевому тримеризующему домену (фолдону) и прилежащему к нему участку с а-спиральной структурой, амплифицировали с помощью праймеров "f/f.BB.F" и "f7fA468.R", используя в качестве матрицы для ПЦР ДНК бактериофага Т4 (Sigma). В 3 конец обратного праймера была введена "молчащая" мутация, приводящая к образованию уникального Nael-сайта.. Полученный фрагмент ДНК был затем гидролизован эндонуклеазами Nael и Ncol и клонирован в вектор pNEB.PK3.6 (Krasnykh et al., 1998), обработанный теми же рестриктазами. Полученная плазмида, несущая ген химерного белка шип-фибритин (FF), получила название PNEB.PK.FFBB- Чтобы ввести уникальный Swal-сайт в 3 конец кодирующей химеру последовательности, вначале олигодуплекс, сформированный олигонуклеотидами "F5.ASwa.T" и "A3.Swa.B", был клонирован в вектор pNEB.PK3.6, гидролизованный по BstXI-MfeI-оатгм, с образованием плазмиды pNEB.PKA3. Затем фрагмент Ncol-Acc65.I из этой плазмиды был клонирован в вектор PNEB.PK.FFBB, гидролизованный этими же эндонуклеазами, с образованием плазмиды PNEB.PK.FFBBA3. Чтобы встроить в 3 конец гена химерного шипа линкер, из плазмиды PNEB.PK.FFBBA3 вначале удалили фрагмент Xbal-Xbal, содержащий неизвестную последовательность ДНК вируса Ad5Luc3 (Mittal et al., 1993), получив плазмиду PXK.FFBBA3, а затем в эту плазмиду, гидролизованную эндонуклеазами Nael и Swal, проклонировали
Методы, используемые при работе с аденовирусами
Для получения геномов Ад использовали метод гомологичной рекомбинации в E.coli, описанный Chartier (Chartier et al., 1996). Клетки штамма BJ5183, ко-трансформировали фрагментом соответствующего шаттл-вектора, содержащим ген рекомбинантного шипа, и плазмидой pVK700, линеаризованной эндонуклеазой Swal. pVK700 является производной плазмиды pTG3602 (Chartier et al., 1996), содержащей полноразмерный геном Ад5, в котором район Е1 замещён геном, кодирующим люциферазу под контролем раннего промотора цитомегаловируса (CMV), а ген шипа - линкером, содержащим уникальный сайт Swal. Полученную в результате рекомбинации плазмидную ДНК, содержащую полноразмерный вирусный геном со встройкой гена модифицированного шипа, трансформировали в клетки STBL2 и нарабатывали в препаративных количествах. Вирусный геном отделяли от векторной части плазмиды гидролизом Расі, обрабатывали буфером для удаления эндотоксинов (Qiagen) и использовали для трансфекции. 2.3.2. Трансфекция. Клетки 293, 211 или 293F28, растущие на 6 см2 чашках, трансфицировали вирусными геномами с использованием реагента DOTAP (Roche) согласно протоколу производителя. Через 24 часа после трансфекции на клеточный монослой наслаивали 3 мл агаризованной среды DMEM-F12 (Gibco BRL), содержащей 10% сыворотки. Через 48 часов после трансфекции в чашки сверху агарозы добавляли 3 мл DMEM-F12 среды, содержащей 10% сыворотки.
Среду меняли через каждые 3-е суток. После появления первых бляшек, среду и агарозу убирали, клетки снимали в 3 мл среды DMEM-F12 с 2% сывороткой и замораживали при -80С. Вирусы Ad5Luc.l0RGD - Ad5Luc.60RGD и Ad5Luc.70RGD - Ad5Luc.80RGD получали после трансфекциии клеток 293 плазмидами pVK713 - pVK718 и pVK727 - pVK728, соответственно. Ad5Luc.FF/6H был спасён после трансфекциии клеток 211 плазмидой pVK724, Ad5Luc.FF/CD40L - после трансфекции клеток 293F28 плазмидой pVK719. Полученные на этой стадии вирионы Ad5Luc.FF/6H и Ad5Luc.FF/CD40L были мозаичными и включали как химерные фибритин-содержащие шипы, так и шипы дикого типа. 2.3.3. Наработка вирусов. Замороженные клетки оттаивали при 37С, цикл замораживания-оттаивания повторяли четыре раза. После последнего оттаивания клеточный лизат осветляли центрифугированием при 5000 об/мин 25 мин при 4С. Супернатант отбирали и использовали для заражения монослойных культур, выращенных в 75 см2 матрасах. На один 75 см матрас добавляли от 150 мкл до 1 мл осветлённого клеточного лизата, смешанного с 7 мл DMEM-F12 среды, содержащей 2% сыворотки. После развития полного цитопатического эффекта (ЦПЭ) клетки собирали, осаждали центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин при 4С, супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 4 мл DMEM-F12 среды, содержащей 2% сыворотки. Осветлённый клеточный лизат готовили по протоколу приведённому выше, после чего вирусы из лизата очищали центрифугированием в градиенте CsCl. Градиент готовили из двух стерильных растворов CsCl с плотностью 1,33 г/см2 и 1,45 г/см2, приготовленных на 5 мМ HEPES, рН 7,8. В 13 мл полиалломерную пробирку для ультрацентрифугирования (Beckman, Palo Alto, СА, USA) добавляли 4 мл раствора CsCl с плотностью 1,33, под него осторожно подслаивали 4 мл раствора CsCl с плотностью 1,45 и сверху наслаивали 4 мл осветлённого клеточного лизата. Вирус центрифугировали в SW41 роторе в ультрацентрифуге Optima L-70K (Beckman) при 25000 об/мин при 4С.
Через два часа фракцию сформировавшихся вирусных частиц собирали с помощью шприца. Вирус разводили буфером 5 мМ HEPES, рН 7,8 в 1,5-2 раза, наносили на новый градиент CsCl и центрифугировали повторно в течение ночи при 4С. Нижнюю вирусную полоску, содержащую полноразмерные вирусные частицы с плотностью 1,34 г/мл, собирали с помощью шприца и диализовали против буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 2 мМ MgCI2, 0.5 М NaCl, 10% глицерин). Очищенный вирус использовали для препаративного заражения. Клетки, растущие на 75 см2 или 500 см2 матрасах, инфицировали вирусами с множественнностью инфекции (МИ) 100 вч/клетку (для наработки вирусов с модифицированной Ш-петлёй) или 200-2000 вч/клетку (для наработки вирусов с химерным шипом, содержащим фибритин). Приготовление клеточных лизатов после развития полного ЦПЭ и очистку вирусов осуществляли по протоколу приведённому выше. Вирусы Ad5LucFF/6H и Ad5LucFF/CD40L амплифицировали вначале в клетках, продуцирующих шип дикого типа - 211 и 293F28, соответственно, а затем в клетках 293. Все остальные вирусы амплифицировали только в клетках 293. 2.3.4. Определение физического и инфекционного титров Ад. Физический титр вирусов определяли спектрофотометрически по методу описанному Maizel (Maizel et al., 1968). К аликвоте вируса добавляли ДСН и EDTA до конечных концентраций 0.5% и 1 мМ, соответственно, раствор инкубировали при 56С в течение 10 мин, после чего измеряли его оптическую плотность на длине волны 260 нм. Для рассчёта концентрации аденовирусных препаратов использовали соотношение 1 оптическая единица = 1,1 1012 вирусных частиц. Концентрацию инфекционных единиц (ИЕ) в стоковом растворе Ад определяли используя метод подсчёта окрашенных инфицированных клеток -спот-анализ (Bewig and Schmidt, 2000). 80-90% монослой клеток 293, растущих на 12-луночном планшете, инфицировали 0,5 мл вируса, разведенного в 10s - 1011 раз. Через 1 час среду с вирусом заменяли на свежую среду с 10% сывороткой. Через 44 часа среду отбирали, клетки сушили и фиксировали 100% метанолом в течение 15 мин при -20С. Затем клетки промывали фосфатным буфером с 1% альбумином из сыворотки быка (БСА) и инкубировали в течение часа с антителами против Ад2 вирионов (АТСС), разведёнными в 4000 раз в том же буфере.
После этого клетки промывали 3 раза и инкубировали 30 мин с разведёнными в 200 раз антителами, узнающими кроличьи IgG, коньюгированные с пероксидазой из корня хрена (DAKO). После серии промывок инфицированные клетки окрашивали с помощью набора ImmunoPure Metalenchanced DAB KitSubstrate (Pierce), согласно протоколу фирмы-производителя. После развития окраски раствор субстрата заменяли на фосфатный буфер, и считали окрашенные клетки под микроскопом. Инфекционный титр вирусов определяли по следующей формуле: ИЕ/мл = число окрашенных клеток на лунке 2 х фактор разведения. 2.3.5. Выделение ДНК из вирионов. К препарату Ад вирионов добавляли ДСН, EDTA и протеиназу К до конечных концентраций 1%, 10 мМ и 100 мкг/мл, соответственно. Раствор инкубировали 1 час при 37С, затем ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформ (1:1), хлороформом и очищали на гель-фильтрационной колонке NAP-5 (Amersham). 2.3.6. Трансдукция клеток Ад векторами. Клетки, выращенные в 24-луночном планшете до 90-100% слияния, промывали средой без сыворотки и инкубировали в этой же среде или среде с блокирующим белком или пептидом в объёме 200 мкл 10 мин при комнатной
Разработка стратегии таргетинга Ад векторов, основанной на замещении ГД шипа
Структурная несовместимость большинства типов лигандов с ГД шипа (см. Раздел 1.6.2.2.4. Обзора литературы) ограничивает возможности модификации этого домена с целью получения нацеленных Ад векторов. Для решения этой проблемы мы предложили подход, основанный на замещении Ад шипа белковыми химерами, обеспечивающими связывание вируса с рецептором-мишенью. Основу этого подхода составляет идея о разобщении двух основных функций ГД шипа - тримеризации и связывания с рецептором - и их распределении между двумя структурно независимыми доменами, искусственно введёнными в состав химеры. В соответствии с нашей гипотезой, такая стратегия позволила бы исключить структурный конфликт между ГД и лигандом и существенно расширила бы спектр белковых молекул, пригодных для нацеливания Ад. Эта идея была реализована конструированием химерной молекулы, способной функционально заместить шип в Ад вирионе. Такая химера, названная FF/6H, Рис. 3.1.5.3. Связывание вирусов Ad5Luc.lOVIP и Ad5Luc.lOVIP18 23 с клетками CHO/VPAC1. Меченые Н -тимидином вирусы инкубировали в течение 1 часа при 4С с клетками CHO/VPAC1 (3500 частиц на клетку). Клетки промывали, чтобы удалить несвязавшиеся вирионы, число связавшихся с клетками Ад частиц вычисляли, исходя из определённой для них специфичной радиоактивности и общей радиоактивности образца.
Каждое значение на графике соответствует среднему трёх измерений. VIP и VIP18"23 обозначают вектора AdSLuc.lOVIP и Ad5Luc.l0VIP " , соответственно, дт - контрольный вектор (Ad5Lucl) меченый Н -тимидином. включала в себя следующие структурные компоненты (рис. 3.2.1.1 А): N-концевой фрагмент шипа Ад5 (F), чтобы обеспечивать встраивание химерного шипа в Ад капсид; фрагмент фибритина - белка бактериофага Т4 (F), чтобы обеспечивать тримеризацию химерного шипа; 6His rar (6Н), чтобы обеспечить связывание с искусственным рецептором (ИР). Фибритин был выбран в качестве молекулы, обеспечивающей тримеризующую функцию шипа, на основании ряда его структурных особенностей, представленных ниже. Так же как и шип Ад, фибритин является гомотримером. Он представлен полипептидом длиной 487 а.о., кодируемым геном wac бактериофага Т4. В составе бактериофага фибритин образует гибкие "усики", которые прикрепляются к шейке фага и способствуют сборке фаговых частиц. В структуре фибритина выделяют три основных домена. Наиболее протяжённый центральный стержне-подобный домен длиной 408 а.о., состоит из 12-ти о суперспиральных сегментов, соединённых между собой короткими петлями. На N- и С-концах фибритина находятся два небольших глобулярных домена длиной 47 а.о. и 30 а.о., соответственно. Тримеризация фибритина инициируется С-концевым доменом - фолдоном - и затем распространяется на центральный домен, стабилизируя суперспирали (Тао et al., 1997). Тримерная структура фибритина является очень стабильной: ни протяжённые аминоконцевые делеции (до 92% молекулы) (Letarov et al., 1999), ни встройки на С-конец молекулы гетерологичных полипептидов (Месянжинов, персональное сообщение) не приводят к её нарушению. Для цели данного исследования также важно отметить, что для фибритина не было отмечено рецептор-связывающих функций. Аминокислотная последовательность и доменная организация химерного шипа FF/6H представлена на Рисунке 3.2.1.1 Б. На N-конце химеры находится ХД и два полных повтора ЦД шипа Ад. Третий повтор ЦД присоединён к петле, предшествующей пятому суперспиральному сегменту центрального домена фибритина (усечённый фибритин). Последовательность SQNV, присутствующая как в структуре шипа так и в структуре фибритина, была использована в качестве точки сочленения, чтобы уменьшить возможные структурные конфликты между Р-спиральной конформацией ЦЦ шипа и тройной а-спиралью ЦД фибритина. На С-конец фибритина был добавлен короткий пептидный линкер, за которым следовал 6His rar.
Последний был выбран в качестве лиганда, чтобы обеспечить связывание Ад, несущего такой шип, с ИР на поверхности клеток 293/6Н (Douglas et al., 1999). Внеклеточный домен этого ИР представляет из себя scFv, узнающий аминокислотную последовательность из 5 ги гистидинов (Lindner et al., 1997), которое генетически слито с трансмембранным доменом рецептора фактора роста тромбоцитов. Нас интересовало, будет ли в действительности каждый из этих компонентов выполнять предназначенную ему функцию: будет ли фибритин поддерживать тримеризацию химерного шипа и сможет ли шип, при условии, если он будет тримерным, включаться в Ад вирионы и обеспечивать специфичное связывание с рецептором. Для первичного анализа химерный шип FF/6H был экспрессирован в бактериальных клетках и очищен хроматографией на Ni-NTA-сефарозе. Электрофорез очищенного белка в ДСН-ПААГ продемонстрировал, что он, также как и шип Ад5 дикого типа, формирует стабильные тримеры, которые при кипячении распадаются на мономеры с ожидаемым молекулярным весом - 37 кДа (рис. 3.2.1.2).
Следовательно, усечённый фибритин, включённый в состав химеры был способен обеспечивать её тримеризацию. Тот факт, что шип эффективно очищался из лизатов клеток с использованием Ni-NTA-сефарозы, свидетельствовал о том, что гистидиновый таг был доступен для связывания в контексте тримерной молекулы. Это позволяло ожидать, что 6His rar в составе вириона также будет доступен для связывания с ИР. Таким образом, фибритин в составе FF/6H шипа не только поддерживал тримерную конформацию химеры, но и выступал в качестве основы для эффективного представления лиганда, то есть удовлетворял двум основным критериям, предъявляемым к замещающей шип молекуле. 3.2.2. Получение аденовируса с химерным шипом FF/6H. Рекомбинантный вирусный геном, содержащий ген химерного шипа и ген люциферазы, был получен с помощью метода гомологичной рекомбинации в клетках E.coli, как описано в главе Материалы и Методы. Вирус Ad5LucFF/6H,
