Введение к работе
Актуальность проблемы. Злокачественные опухоли желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) являются одной из наиболее распространенных причин смерти в нашей стране. В России ежегодно регистрируется 126,5 тысяч новых случаев рака ЖКТ, что составляет около 30% от всех онкологических заболеваний. При этом среди всех злокачественных новообразований ЖКТ наиболее часто регистрируются рак желудка, колоректальный рак, а также рак пищевода и поджелудочной железы. Безусловно, проблемы лечения этой категории больных постоянно находятся в центре внимания онкологов. Несмотря на то, что достижения современной биомедицины позволили увеличить продолжительность жизни пациентов, химиотерапевтическое лечение опухолей ЖКТ остается по сегодняшний день недостаточно эффективным.
Опухолевый супрессор р53 играет существенную роль в ответе клеток на химиотерапевтическое воздействие. Активируясь в ответ на клеточный стресс, в частности, стресс, обусловленный действием химиотерапевтических препаратов, белок р53 регулирует транскрипцию генов, запускающих процессы апоптоза и/или ареста клеточного цикла. Существенно, что инактивация белка р53 в результате мутаций его гена обнаруживается примерно в половине всех случаев опухолей ЖКТ человека. Неудивительно поэтому, что опубликовано множество работ, в которых исследовали связь мутационного статуса р53 в разных типах опухолей с их чувствительностью к противоопухолевым препаратам. Однако данные этих исследований крайне противоречивы. Проведенный недавно статистический мета-анализ этих данных не выявил прогностической значимости мутационного статуса р53 для определения чувствительности опухолей к химиотерапии. Вероятно, это объясняется тем, что активность р53 - далеко не единственный фактор клеточного ответа на химиотерапию. В научной литературе накапливаются данные, свидетельствующие, что не только белок р53, но и другие члены семейства -белки рбЗ и р73 - могут играть роль в регуляции вызванного химиотерапией апоптоза и ареста клеточного цикла. В отличие от р53, функции белков рбЗ и р73 недостаточно полно изучены. В силу этого очевидна актуальность данного исследования, направленного на выяснение молекулярных механизмов функционирования белков рбЗ и р73.
Гены ТР63 и ТР73 направляют синтез множества белковых продуктов (изоформ) вследствие процессов альтернативного сплайсинга, наличия двух промоторов и альтернативной точки начала трансляции. В соответствии с наличием или отсутствием трансактивационного домена (ТАД) на N-конце изоформ рбЗ и р73 их подразделяют на Транскрипционно-Активные (ТА) изоформы и изоформы, у которых ТАД на N-конце отсутствует (ДТА или AN). В соответствии со строением С-конца белковой молекулы выделяют девять изоформ р73 (р73ос, р, у, 5, є, 0, <р, ц и ці ) и три изоформы рбЗ (рбЗос, Риу ). Изоформы рбЗ и р73 различаются по транскрипционной активности, а иногда даже противоположны по свойствам. Изоформы, содержащие ТАД (ТАрбЗ и ТАр73), сходны с р53 по активности и, вероятно, участвуют в опухолевой
супрессии. Изоформы без трансактивационного домена (ANp63 и ANp73) могут подавлять активность ТА изоформ и р53, т.е. имеют доминантно-негативное действие. По крайней мере для одной из них (ANp73a) описаны онкогенные свойства.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было изучение роли всех генов семейства р53 в опухолевой прогрессии и в химиотерапевтическои чувствительности злокачественных новообразований ЖКТ. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Охарактеризовать экспрессию белков семейства р53 и ее ассоциацию с клинико-патологическими параметрами в первичных опухолях ЖКТ;
-
Выявить механизм регуляции синтеза про-опухолевых ANp73 изоформ в клетках ЖКТ;
-
Проанализировать влияние белков семейства р53 на доставку лекарственных препаратов в опухолевые клетки. В частности, оценить их роль в регуляции экспрессии гена mdrl - важного эффектора множественной лекарственной устойчивости;
-
Исследовать влияние белков семейства р53 и взаимодействий между ними на химиотерапевтический ответ опухолевых клеток;
-
Сравнить перспективность оценки мутационного статуса р53 и общей транскрипционной активности семейства р53 для прогнозирования химиотерапевтического эффекта.
Научная новизна. Данная работа является первым многоплановым исследованием роли генов семейства р53 в опухолях ЖКТ. Проведен подробный анализ более 350 образцов злокачественных и нормальных тканей ЖКТ человека, который показал, что характер экспрессии генов семейства р53 в опухолевом и в нормальном неопухолевом эпителии неодинаков. Наряду с мутациями гена ТР53, в опухолях ЖКТ часто наблюдается увеличение содержания ТА и AN изоформ р73, а также различных С-концевых вариантов сплайсинга мРНК р73. Впервые обнаружено, что высокое содержание белка ANp73 в клетках опухоли является неблагоприятным прогностическим фактором для пациентов с аденокарциномой желудка.
Также в нашей работе получены новые данные, указывающие на взаимосвязь белка ANp73a и важного эффектора множественной лекарственной устойчивости - гена MDR1. Было показано, что белок ANp73а связывается с промотором гена mdrl и активирует его экспрессию. При этом активирующий эффект ANp73a связан с его способностью блокировать р53-зависимую репрессию промотора MDR1. Таким образом, наши данные являются первым опубликованным примером того, что белок ANp73a подавляет активность р53 как транскрипционного репрессора.
Эти данные свидетельствуют о том, что увеличение синтеза белка ANp73 может значительно усложнить течение онкологического заболевания. Однако о механизмах, приводящих к увеличению синтеза белка ANp73 в опухолевых клетках, практически ничего не известно. В нашей работе впервые показано, что снижение экспрессии гена опухолевой супрессии Hid (Hypermethylated in
cancer 1, гиперметилированный в раке 1), характерное для злокачественных новообразований человека, может приводить к увеличению содержания мРНК ANp73.
Было установлено, что функции различных белков семейства р53 в регуляции клеточного ответа на химиотерапию взаимосвязаны. Под действием широко применяемого в химиотерапии опухолей ЖКТ препарата 5-фторурацил (5-ФУ) эндогенные белки р53 и р73 или рбЗ и р73 попарно связываются с промоторами генов-мишеней, белковые продукты которых активируют процессы апоптоза и ареста клеточного цикла. Эти данные являются первым свидетельством того, что под действием химиотерапевтических агентов белки семейства р53 взаимодействуют друг с другом на промоторах генов-мишеней. Также обнаружено, что чувствительность опухолевых клеток к воздействию химиотерапевтического агента 5-ФУ зависит от суммарной транскрипционной активности всех присутствующих в клетке белков семейства р53. Научно-практическая ценность работы. Опухолевый супрессор р53 - один из наиболее интенсивно изучаемых белков. В последние несколько лет в научной литературе стали появляться свидетельства того, что белки семейства р53 интенсивно взаимодействуют друг с другом. В соответствии с этим было выдвинуто предположение, что семейство р53 функционирует как единая интерактивная белковая сеть («р53 family network»). Наши экспериментальные данные подтверждают эту гипотезу, показывая, что все образующиеся в клетке белки этого семейства вовлечены в формирование ответа клеток на действие химиотерапевтических средств.
Ряд полученных в рамках представленной работы данных существенны для клинической онкологии. В частности, показано что суммарная транскрипционная активность всех белков семейства р53 гораздо лучше прогнозирует эффект химиотерапии, чем часто применяемый в клинике анализ мутационного статуса гена ТР53. Точное прогнозирование эффекта химиотерапии позволит подобрать наиболее действенную стратегию лечения и улучшить качество жизни онкологических больных.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научном коллоквиуме Лаборатории биологии клетки ИМБ РАН им. В.А.Энгельгардта в 2010 году, на конференции аспирантов ИМБ РАН в 2007 году; на 98-ой ежегодной конференции AACR (American Association of Cancer Research, Американская Ассоциация Исследований Рака), Лос-Анджелес, Калифорния, США, 2007; на еженедельном научном семинаре GPA (Growth, Proliferation and Apoptosis; Рост, Пролиферация и Апоптоз) Университета Вандербилт в 2008 году; на ежегодной конференции DDW (Digestive Disease Week, Неделя заболеваний пищеварительной системы) 2009 года, Чикаго, Иллинойс, США; на ежегодной конференции DDW 2010 года, Новый Орлеан, Луизиана, США.
По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей в рецензируемых отечественных и международных журналах, а также тезисы 3 докладов на международных конференциях и съездах.
Структура и объем работы.
