Введение к работе
1. Актуальность проблемы.
ВИЧ-инфекция стала самым опасным и широко распространенным инфекционным заболеванием в XXI веке. Ежегодно более 5 млн. человек заражаются вирусом иммунодефицита человека - этиологическим агентом ВИЧ-инфекции и ее терминальной стадии СПИДа. Со времени регистрации первых случаев болезни более 67 млн. человек были инфицированы и более 25 млн. уже умерло. Глобальное распространение, принявшее характер мировой эпидемии -пандемии, высокая смертность, передача вируса через кровь, внутриутробно и половым путем, отсутствие вакцины, микробицидов и широко доступных высокоэффективных и нетоксичных лекарств сделали проблему ВИЧ/СПИД одной из центральных в мировом здравоохранении. Открытый в начале 80-х гг. ВИЧ оказался лентивирусом, относящимся к семейству ретровирусов, для которых характерна интеграция в геном хозяина, длительная латенция и хроническая инфекция, высокая антигенная и генетическая изменчивость.
К настоящему времени во всем мире изолировано более тысячи штаммов ВИЧ, изучены нуклеотидные последовательности нескольких тысяч вирусов. А для 100 вирусов прочитана полная последовательность нуклеотидов и созданы молекулярные клоны. Установлено, что многие изоляты ВИЧ сильно различаются по своим биологическим свойствам; более того в разных регионах мира циркулируют различные субтипы и рекомбинанатные формы ВИЧ. Создание коллекции и исследование свойств изолятов ВИЧ необходимо для решения как фундаментальных, так и прикладных задач, в том числе для разработки вакцины против ВИЧ/СПИД.
Со времени обнаружения CD4 рецептора, считалось, что именно Т-хелперы являются главной мишенью ВИЧ. Последующие исследования показали, что ВИЧ фактически является пантропным вирусом, способным использовать множество дополнительных корецепторов и клеточных механизмов для проникновения и поддержания инфекции. Исследование механизмов проникновения ВИЧ, клеточных механизмов модуляции ВИЧ-инфекции является важным звеном в понимании патогенеза ВИЧ/СПИД. Жизненный цикл ВИЧ весьма сложен и включает несколько стадий. Поиск специфических ингибиторов различных этапов репликации ВИЧ позволяет открывать новые препараты для лечения ВИЧ/СПИД. Именно таким образом были найдены нуклеозидные/нуклеотидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы-ВИЧ и. иНгйЬитав^доу^еазы
" Є БИБЛИОТЕКА 1
| srsjbs&j 3
ВИЧ. Актуальной остается задача поиска новых средств терапии ВИЧ/СПИД, в том числе комбинированной химиотерапии. До сих пор не решена проблема по разработке новых превентивных технологий на основе иммунобиологических препаратов - микробицидов, предотвращающих половую передачу ВИЧ и вакцин. Настоящая работа выполнена в рамках плановых исследований НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Государственной программы "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" по проблеме СПИД и Межведомственной научно-технической программы " Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", РФФИ, РФТР.
2. Цели и задачи исследования.
Целью исследования было изучение иммунобиологических свойств ВИЧ, в том числе штаммов ВИЧ, циркулирующих на территории страны и поиск новых противовирусных средств, блокирующих размножение ВИЧ, а также разработка иммунобиологических препаратов - анти-ВИЧ микробицидов и анти-ВИЧ вакцины.
В соответствии с целями были поставлены задачи:
выделить изоляты ВИЧ и изучить иммунобиологические свойства изолятов ВИЧ от российских ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом;
исследовать иммунобиологические свойства сывороток крови, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц (иммунореактивность нейтрализационные свойства, систему комплемента);
провести сравнительный анализ антигенной и генетической вариабельности ВИЧ на территории России (бывшего СССР);
исследовать механизмы проникновения ВИЧ (стадии адсорбции, рецепции, фузии);
изучить механизмы модуляции ВИЧ-инфекции
определить антивирусный эффект ингибиторов различных стадий жизненного цикла ВИЧ;
разработать кандидатные анти-ВИЧ микробициды и анти-ВИЧ вакцину.
3. Научная новизна работы.
При выполнении работы получены новые данные, имеющие как теоретическое, так и практическое значение.
Проведено массовое выделение отечественных изолятов ВИЧ от российских пациентов и создана коллекция штаммов ВИЧ.
Охарактеризованы субтипы (генотипы/серотипы/иммунотипы) и
биологические свойства (скорость репродукции, синцитеобразующая активность, тропизм, спектр корецепторов, чувствительность к АЗТ) ВИЧ-изолятов. Обнаружена гетерогенность в кинетике репликации и репродуктивной активности изолятов.
Показано, что на ранних стадиях острой ВИЧ-инфекции in vitro происходит увеличение дегидрогеназной активности клеток, причем r/h варианты ВИЧ индуцируют больший сдвиг, чем s/l - вирусы.
Впервые описан дефект системы комплемента у ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом.
Показано, что главной особенностью ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД в России (бывшем СССР) является множественные и независимые проникновения различных субтипов ВИЧ. Концентрированная стадия эпидемии в России характеризуется преобладающей циркуляцией вирусов субтипа А с высокой степенью генетической гомогенности.
Сделан вывод, что для локальных очагов эпидемии ВИЧ/СПИД данные серотипирования коррелируют с результатами генотипирования. Исследовано влияние физико-химических свойств трипептидов, фланкирующих центральный тетрапептид V3 др120 ВИЧ, на характер взаимодействия с ВИЧ позитивными сыворотками. Предложена модель функционирования V3 петли др120 ВИЧ-1.
Впервые показано, что пептиды из др41 специфически подавляют ВИЧ-инфекцию, а степень подавления зависит от аминокислотной последовательности и наличия свободного N-конца молекулы пептида, а также от природы, заряда и пространственной организации носителя.
Показано, что пептидный фрагмент из С-конца V1 домена CD4 обладает ВИЧ ингибирующей активностью, обусловленной специфическим (электростатическим) взаимодействием cV3gp120.
Установлена роль интегриновых рецепторов в проникновении ВИЧ. Обнаружено, что аллостерический ингибитор интегриновых рецепторов - аджоен, способен подавлять образование ВИЧ-индуцированных синцитиев и продукцию вирусных антигенов.
Впервые обнаружено, что тепловой шок приводит к усилению репликации ВИЧ, при этом ВИЧ не индуцирует de novo синтеза БТШ, но сопровождается усилением синтеза некоторых клеточных белков. Впервые показано, что тепловой шок приводит к амплификации провирусной ДНК.
Получены уникальные клоны СЕМ-К перевиваемой Т-клеточной линии СЕМ с гиперэкспрессией CD95 и пониженной экспрессией CD4, устойчивые к заражению ВИЧ. Вирусы трансфектанты не приобретают новый фенотип и остаются тройными к CD4+ клеткам.
Изучено ингибирующее действие отечественных 3'-(5R-
тетразолил)тимидинов и 2',3'- дидезоксинуклеозидов, их 5'чросфитов и 5'-фосфитов 3'-азидо-2',3'- дидезоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ. Выявлено, что применение суммы фосфитов всех четырех 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов приводит к снижению цитотоксического эффекта. Впервые обнаружена анти-ВИЧ активность транс-дигидроксипиперидинов; исследована анти-ВИЧ активность природных и полусинтетических соединений на основе хитозанов и гуминовых кислот.
Предложена оригинальная кандидатная анти-ВИЧ вакцина на основе конъюгата химерного белка ВИЧ-1гес (24-41) с полиоксидонием, индуцирующая у иммунизированных животных сильный иммунопролиферативный ответ и образование нейтрализационных антител.
4. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Выделено и изучено 100 отечественных изолятов ВИЧ-1. Охарактеризованы
субтипы (генотипы/серотипы/иммунотипы) и биологические свойства (скорость
репродукции, синцитеобразующая активность, тропизм, спектр корецепторов,
чувствительность к АЗТ). Обнаружена гетерогенность в кинетике репликации и
репродуктивной активности вирусных изолятов.
Показано, что на ранних стадиях острой ВИЧ-инфекции in vitro происходит увеличение дегидрогеназной активности клеток, причем r/h варианты ВИЧ индуцируют больший сдвиг, чем s/l - вирусы.
Впервые описан дефект системы комплемента у ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом.
Главной особенностью ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД в России (бывшем СССР) является множественные и независимые проникновения различных субтипов ВИЧ. Концентрированная стадия эпидемии в России характеризуется преобладающей циркуляцией вирусов субтипа А с высокой степенью генетической гомогенности.
Для локальных очагов эпидемии ВИЧ/СПИД данные серотипирования коррелируют с результатами генотипирования. Исследовано влияние физико-химических свойств трипептидов, фланкирующих центральный тетрапептид V3
gp120 ВИЧ, на характер взаимодействия с ВИЧ-позитивными сыворотками. Предложена модель функционирования V3 петли др120 ВИЧ-1.
5. Впервые показано, что пептиды из др41 специфически подавляют ВИЧ-
инфекцию, а степень подавления зависит от аминокислотной
последовательности и наличия свободного N-конца молекулы пептида, а также
от природы, заряда и пространственной организации носителя.
Показано, что пептидный фрагмент из С-конца V1 домена CD4 обладает ВИЧ
ингибирующей активностью, обусловленной специфическим
(электростатическим) взаимодействием с V3gp120.
Установлена роль интегриновых рецепторов в проникновении ВИЧ. Обнаружено, что аллостерический ингибитор интегриновых рецепторов -аджоен, способен подавлять образование ВИЧ-индуцированных синцитиев и продукцию вирусных антигенов.
Впервые обнаружено, что тепловой шок приводит к усилению репликации ВИЧ, при этом ВИЧ не индуцирует de novo синтез БТШ, но стимулирует синтез некоторых клеточных белков. Впервые показано, что тепловой шок приводит к амплификации провирусной ДНК.
Получены уникальные клоны СЕМ-К перевиваемой Т-клеточной линии СЕМ с гиперэкспрессией CD95 и пониженной экспрессией CD4, устойчивые к заражению ВИЧ. Вирусы - трансфектанты не приобретают новый фенотип и остаются тропными к CD4+ клеткам.
Изучено ингибирующее действие отечественных 3'-(5Р-тетразолил)тимидинов и 2',3'- дидезоксинуклеозидов, их 5-фосфитов и 5'-фосфитов З'-азидо-г'.З'-дидезоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ. Выявлено, что применение суммы фосфитов всех четырех З'-азидо-г'.З'- дидезоксинуклеозидов приводит к снижению цитотоксического эффекта. Впервые обнаружена анти-ВИЧ активность транс-дигидроксипиперидинов; исследована анти-ВИЧ активность природных и полусинтетических соединений на основе хитозанов и гуминовых кислот.
Предложена оригинальная кандидатная анти-ВИЧ вакцина на основе конъюгата химерного белка ВИЧ-1 гее (24-41) с полиоксидонием, индуцирующая у иммунизированных животных сильный иммунопролиферативный ответ и образование нейтрализационных антител.
5. Практическая ценность. Исследование относится к разряду научно-практических работ. Полученные нами данные о серотипах и субтипах ВИЧ-1,
циркулирующих в России, Беларуси и на Украине, важны для разработки вакцины против ВИЧ. Исследованный нами 5'-фосфит 3'-азидо-2',3'- дидезоксинуклеозид используется в клинической практике. По материалам диссертационной работы получены авторские свидетельства и патенты.
6. Личный вклад соискателя.
Работа выполнена лично автором на базе группы иммунохимии НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ и лаборатории вирусологии Института прикладных исследований Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова Вклад автора состоит в планировании, организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении полученных результатов и формулировании выводов. Отдельные разделы работы выполнены совместно с сотрудниками других научных учреждений, что отражено в списке публикаций.
Соискатель приносит благодарность своим сотрудникам и соавторам.
7. Апробация работы.
Основные экспериментальные материалы и положения диссертации докладывались на следующих конференция:
1-Ю международная конференция СПИД/РАК и родственные проблемы, Ст.-Петербург, 1992-2002 гг.
конференция "Фундаментальные и прикладные вопросы СПИД, вирусных гепатитов и гриппа", Суздаль, 1988 г.
Ill International Conference on AIDS, Washington, 1987;
IV International Conference on AIDS, Stockholm, 1988;
V International Conference on AIDS, Montreal, 1989;
VI International Conference on AIDS, San Francisco, 1990;
VII International Conference on AIDS, Florence, 1991;
VIII International Conference on AIDS, 1992, Amsterdam, The Netherlands, 19-24 July;
X-th International Conference on AIDS, 1994, Yokohama, 7-12 August;
Xl-th International Conference on AIDS, 1996, Vancouver, July 7-12;
XII World AIDS Conference, 1998, June 28 - July 3, Geneva, Switzerland;
XIII International Conference on AIDS, Durban, 2000;
XIV International Conference on AIDS, Barcelona, 2002;
Intxonf. on med. Biotechnology, Immunization and AIDS. , Leningrad, USSR, 1991;
VII meet. "Act. probl. allerg. immun. AIDS.", Kaunas, 1992;
Joint meeting "Progress in clinical virology", 1995, Prague, Czech Republic 10-14 September;
1s1 International Conference of the Мог Kaposi Research Foundation "AIDS and Cancer Research", 1996, Budapest, Hungary;
2nd International Conference of the Мог Kaposi Research Foundation "AIDS and Cancer Research", 1998, Budapest, Hungary;
X-th International Congress of Virology, 1996, Jerusalem, 11-16 August;
ECEAR 1997, Stockholm;
ECEAR 2000, Madrid;
2-я Международная конференция по вирусным гепатитам и ВИЧ-инфекции, Минск, Беларусь, Май 13-14, 1999;
7th Conf. on Retroviruses and Opportunistic Infections, 2000, January 30-February 2, San Francisco;
9th Conf. on Retroviruses and Opportunistic Infections, 24-28 Feb., 2002, Seattle, USA;
Int. Meeting of the Inst, of Human Virology, 2001, Sept. 9-13, Baltimore, Maryland;
AIDS vaccine 2001, Sept. 5-8, 2001, Philadelphia, USA;
Vaccines and Immunization 5th Int. Forum on global vaccinolgy, Minsk, Belarus, 15-16 Oct. 2001;
Vaccines and Immunization 6th Int. Forum on global vaccinolgy, Minsk, Belarus, 2002;
1s' Int. conference "High medical technologies in XXI century", November 2-9, 2002, Spain, Benidorm.
Конференция «Отечественные противоопухопевые препараты», Москва, 17-20 марта 2002г.;
Конференция РААКИ, Москва, 2001;
Конференция РААКИ, Москва, 2002.
