Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда Дорошенко, Наталья Петровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. В настоящее время в биологической науке и в сельскохозяйственной практике, в т.ч. ив виноградарстве, на первый край выходит проблема адаптации, так как с ней связаны возможности реализации генотипа в онтогенезе, ареалы культур и, что особенно важно, получение максимального хозяйственного эффекта.

Усилению адаптации виноградарства в условиях интенсификации отрасли должно способствовать применение Ьовременных методов биотехнологии, Методы культуры органов, тканей и клеток in vitro должны занять прочное место в арсенале средств, определяющих значительный прогресс в селекции винограда и в деле производства посадочного материала этой древнейшей и щироко распространенной сельскохозяйственной культуры.

Методы in vitro могут вносить ценный вклад на каждом этапе селекционного процесса. Использование клонального микроразмножения позволяет сократить сроки размножения новых сортов по сравнению с традиционными методами в 4-5 раз. Преимущества микроразмножения in vitro заключаются а необходимости малого количества исходного материала, минимальной лабораторной плошади для культур, в высоком коэффициенте размножения.

Клональное микроразмножение также является составной часть» интегрированной защиты виноградных насаждения, так как, благодаря высокому коэффициенту размножения, является наиболее вероятным способом массозого размножения перспективных устойчивых сортов винограда. Кроме- этого, небольшой размер экспланта. применяемого для клонального микреразмноженкя, поверхностная стерилизация его. асептический перенос на питательную среду и субкультивирование в условиях, исключающих инфицирование, приводит к оздоровлению полученных растений от Филлоксеры, нематод, грибных патогенов.

В борьбе против вирусных болезней винограда не эффективно использование агротехнических или химических методов. Единственным способом борьбы является получение безвирусного посадочного материала. Наиболее надежным методом оздоровления посадочного материала винограда является использование культуры меристемы и последующее клональное микроразмножение оздоровленных растений.

Оздоровленный посадочный материал является базисным для создания маточных насаждений и перевода вииогряпярптвя чя длитнут

^; ЦНБ МСХА

Фонд научной литературы

- 4 -основу, что обеспечит продление эксплуатации виноградников и повышение их продуктивности на 30-40.

Особо актуальным является пополнение сортимента винограда новыми бессемянными сортами, так как бессемянность является ценным хозяйственным признаком для сортов винограда всех направлений использования - потребления в свежем виде, приготовления сушеной продукции. Кроме того, это прекрасное сырье для винодельческой промышленности. Во всем мире возрастает внимание к бессемянному винограду. Однако, группа бессемянных сортов пока еще малочисленна. Практически отсутствуют бессемянные сорта в существующем сортименте винограда России.

Перспективным направлением создания бессемянных сортов является использование культуры изолированных семяпочек (зародышей в семяпочке) m vitro. Метод основан на получении жизнеспособного потомства от скрещивания бессемянных сортов между собой с последующим культивированием зародышей семени в условиях in vitro. Это открывает принципиально новые перспективы - позволит сократить продолжительность селекции и увеличить бессемянность.

Важным вкладом в практику сельского хозяйства для вегетативно размножаемых культур является технология сохранения в культуре In vitro генофонда, используемого в селекции, в виде растущих коллекция - периодически су(5клонируемых пробирочных растений, оздоровленных методом культуры меристем. Цель коллекций - обеспечить селекционера в любое время генотипом, несущим искомые признаки, нужные для его работы, насущной необходимостью также является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения. В виноградарстве также существует потребность в надежных методах хранения генофонда in vitro.

В последние десятилетия опубликовано большое количество научных сообщений по культуре органов, тканей и клеток винограда. Однако многие вопросы применения биотехнологии в' виноградарстве остаются нерешенными. К ким следует отнести оздоровление растений от вирусов методом апикальных меристем размером менее 0,2 мм и регенерацию кз них растений. В селекции бессемянных сортов недостаточно изучена и требует своего решения культура семяпочек винограда на искусственной питательной среде. Наименее изученным является вспрос создания коллекций винограда In vitro.

Цель и задачи исследований. Цель наших исследований:

- разработать технологический процесс клональяого микроразм-

нокання и оздоровления посадочного материала ценных аборигенных, интродуцнрованных и новых высокопродуктивных, устойчивых к болезням, вредителям и.неблагоприятным внешним условиям сортов винограда, обеспечивающий ускоренное размножение их с сохранением генетических особенностей, биологических и агрономических свойств;

разработать метод селекции винограда на бессемянность скрещизанием бессемянных сортов между собой.и с последующим культивированием изолированных семяпочек;

разработать методы сохранения in " vitro коллекции сортов винограда для консервации генетических ресурсов, регионального и международного обмена коллекционным материалом.

Достижение поставленной цели осуществлялось на основе решения следующих задач:

1. Усовершенствовать стерилизацию исходных эксплантов и мероприятия, исключающие ингибирование ростовых процессов.

2. Разработать меры борьбы с хронической инфекций, проявляющейся при продолжительном культивировании пробирочных растений.

3. Подобрать питательную среду с тем. чтобы обеспечить оптимальные условия ввода в культуру тканей эксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0,075-0.1 мм), обеспечивающих оздоровление растений, а также оптимальные условия на этапе кикрочеренкования.

і. Разработать способе оптимизации клонального микроразмно-

ЖЭНИЯ.

5. Усовершенствовать адаптацию пробирочных растений к нестерильным условиям":

6. Разработать способы создания сортоЕЫХ маточников интенсивного типа из саженцев, оздоровленных и размноженных in vitro.

7. Осуществить подбор родительских сортов и комбинаций скрещивания при селекции на бессемянность.

8. Определить сроки изолирования семяпочек и пересадки их на питательные среды.

9. Подобрать питательные среда., способствующие образованию жизнеспособных эмбрионов.

ю. Изучить морфологические и агробиологические особенности гибридных сеянцев, полученных из семяпочек в культуре тканей.

її. выявить влияние понішенпОн положительно*! температуры па "шкималйзащда" роста пробирочных растений и разработать способ продолжительного хранения.

12. Изучить возможность депонирования винограда при добавлении в питательную среду ингибитора роста хлорходинхлорида (ССС) и осмотических ингибиторов маннита и сорбита, уточнить их концентрации и способы применения,

13. Исследовать влияние естественных ингибиторов из размолотых семян на ингибирование роста растений и разработать способ продолжительного хранения винограда in vitro с их применением.

14. изучить возможность депонирования винограда in vitro при сочетании двух факторов культивирования - пониженной температуры и естественных ингибиторов, добавляемых в питательную среду.

Научная новизна. I. Разработаны и научно обоснованы некие биотехнологические приемы технологического процесса клонального микроразмножения и оздоровления растений:

1. Впервые разработан способ борьбы с хронической инфекцией, вызываемой медленно растущими патогенами.

2. Предложена схема регенерации растений из эксплактов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0.075-0.1 мм) с разделением этапа ввода на два подэтапа,

3. Разработан способ укоренения побегов, полученных из меристем, патент N 1601117.

4. Доказана возможность применения среды Ли и де Фоссарда на этапе микрочеренкования побегов винограда.

5. Впервые разработаны способы оптимизации питательной среды на этапе микрочеренкования, основанные на вводе в ее состав 6-БАП или стимуляторов роста естественного происхождения из семян винограда, патент N 2041609.

S. Выявлена возможность повышения регенерационной способности меристем (патент N 2120739) и оптимизации клонального микроразмножения на этапе микрочеренкования побегов (патент К 2077192) воздействием электромагнитного излучения низкой интенсивности.

7. Разработан способ адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям, патент N 1792269,

8. Предложены способы закладки интенсивных маточников из оздоровленного и размноженного In vitro посадочного материала.

9. Усовершенствован способ травянистых индикаторов для тестирования растения винограда на наличие вирусов.

П. Впервые в России разработан метод селекции винограда на бессемянность скрещиванием бессемянных сортов с последующей культурой изолированных семяпочек in vitro.

- 7 -III. Разработаны способы увеличения продолжительности хранения для создания коллекций генофонда винограда in vitro:

1. Предложены новые условия хранения коллекционного генофонда винограда in vitro на среде для хранения при температуре 4С.

2. Доказана возможность увеличения продолжительности хранения при добавлении в питательную среду хлорхолинхлорида. сорбита, 6-БАП при увеличении содержания сахарозы.

.3. Достигнуто, увеличение продолжительности хранения пробирочных растений винограда за счет естественных ингибиторов из семян винограда, добавляемых в питательную среду, патент N 2И0172, Положения, выносимые на защиту.

1. Теоретическое обоснование новых биотехнологических прие
мов технологического процесса клонального микроразмножения и оз
доровления растений:

способ регенерации растений из эксплантов малых {0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров, повышение регенеращюнной способности меристем:

состав питательных сред на всех этапах развития от Формирования меристематических зон, регенерации из них растений, укоренения регенераптоо до высадки с грунт;

способы оптимизации клонального микроразмножения;

способ адаптации растений к нестерильным условиям.

2. Научно-методические разработки:

по селекши бессемянных сортов винограда;

использование бессемянных родителей с последующей культурой изолированных семяпочек In vitro;

приемы повышения эмбриогенеза при самоопылении и скрскиза-нии бессемянных сортов.

3. Метод создания коллекции генофонда in vitro путем минима-лизацди роста растений..

4. Практические рекомендации:

по использованию технологии клонального микроразмножения и оздоровления посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа;

по использованию в селекции стеноспермокарішчєских бессемянных сортов винограда, обеспечивающих при самоопылении и скре-іііибзнии высокий уровень змСриоГ&ііеза и шлчучыше гибридных сеянцев;

по созданию коллекций генофонда винограда in vitro с не-

- 8 -пользованием разработанных способов ингибирования роста-пробкроч-ных растений.

Практическая значимость и реализация результатов исследований работы. В результате проведенных исследований разработаны рекомендации "Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания сортовых маточников интенсивного типа" (Москва, .1991 г.).

В виноградарских хозяйствах Дона переданы оздоровленные саженцы винограда сортов Агат донской. Алан I, Восторг, Бианка. Дружба, Гечеи заматошь и др. Производственные испытания подтвердили высокую приживаемость саженцев, хорошее развитие растений и перспективность такого пути создания сортовых маточников интенсивного типа.

Разработан метод селекции с использованием обоих бессемянных родителей и последующей культуры изолированных семяпочек In vitro. Выявлены сорта и комбинации скрещивания с высоким уровнем эмбриогенеза и образования гибридных сеянцев, доказана возможность получения высокого эмбриогенеза у сортов и форм с функционально женским типом цветка. Установлена потенциальная возможность получения гибридных сеянцев в отдельных комбинациях скрещивания даже при образовании единичных эмбрионов и растений.

Для создания коллекций генофонда in vitro разработаны способы ингибирования роста растений, обеспечивающие увеличение продолжительности между пересадками на свежую питательную среду до 4-7-8 ми и даже 12 месяцев и, тем самым способствующие продолжительному хранению винограда.

Апробация работы и публикации. Основные положения и результаты исследований были доложены и представлены на международных, республиканских и региональных научных конференциях, научно-методических совещаниях и чтениях, посвященных важнейшим проблемам биотехнологии, .селекции и производства посадочного материала винограда: международные - институт физиологии растений (Москва, 1997), Институт биохимической физики (Москва. 1995, 1998), тимирязевская сельскохозяйственная академия (Москва. 1997), Национальная академия наук Украины (Симферополь, 1993). Государственный аграрный университет республики Молдова (Кишинев. 1998) и региональные - КТО (Ленинград. 1SS8), РГУ (Ростов-на-Дону. 1991, 1992), ВНВДГиСПР (Мичуринск. 1991, 1995. 1997. 1999). РАСХН (Нем-чиновка. 1994), ДонГАУ (Персиановка, 1994). ВЮШиВ СНовочер-

- 9 -касск. 1993, 1996, 1998), Дагестанский НИИВиВ (Мамедкала, 1990).

Кроме того, во ВШИВиВ им. Я.Й. Потапенко на базе наших исследований проведено заседание секции виноградарства ВАСХНИЛ с повесткой дня "Применение биотехнологии в виноградарстве" (1991).

Материалы демонстрировались на ВДНХ (1992) и ВВЦ (1994), где били отмечены двумя золотыми и серебряной медалями.

Основные результаты исследований опубликованы в 41 научной работе и,помещены в методических рекомендациях, сборниках и центральных журналах. Получено 6 патентов на изобретения.

На опубликованные работы получен запрос из Израиля (U. Leva-novy, 1989) из Великобритании. Twyford plant Laboratories (1989). из Испании (Pedro R. Ganego Veigas. Vmversidade de Vigo, 1999),

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 287 страницах машинописного текста, включает введение, б глав, выводы и рекомендации научным учреждениям и производству: список использованных литературных источников включает 230 наименование, в т.ч. 96 на иностранных языках. Экспериментальные данные приведены в 75 таблицах и 23 рисунках.

в работе участвовали: сотрудники отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН А,С. Попов, О.Н. Высоцкая, (разработка депонирования винограда In vitro при пониженной.положительной температуре}; сотрудники ВНИИ связи (г. Таганрог) Г.В- Лузгин, А.Ф. Карлов (исследование действия электромагнитного излучения в культуре тканей винограда); сотрудники лаборатории биотехнологии ВНИ-ИВиВ'Им. Я.И. Потапенко Т.В. Жукова, Н.В. Берникова. Г.В. Соколова, В.Г, Ячменева. Л. Н. Семенова, за что автор выражает им искреннюю благодарность.