Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Культура изолированных тканей и органов растений in vitro (обзор литературы) 17
1.1. История развития метода in vitro и области его применения 17
1.2. Основные методы клонального микроразмножения растений (in vitro)
1.2.1. Индукция пролиферации пазушных меристем 25
1.2.2. Развитие адвентивных побегов из ткани экспланта 27
1.2.3. Регенерация растений из каллуса 29
1.3. Основные этапы клонального микроразмножения растений in vitro 31
1.3.1. Регенерация растений из апикальной меристемы 39
1.3.2. Укоренение микропобегов
1.4. Освобождение растений от вирусных заболеваний 46
1.5. Факторы, влияющие на процесс регенерации и клональное микроразмножение in vitro 49
1.6. Адаптация растений при пересадке в нестерильные условия 54
1.7. Хранение пробирочных растений 60
Глава 2. Цель, задачи, объект, методика и условия проведения исследований 64
2.1. Цель и задачи исследований 64
2.2. Объект исследований .66
13. Организация и методика проведения работы..:
2.3.1. Подготовка и стерилизация исходного материала 72
2.3.2. Приготовление питательных сред 73
2.3.3. Работа в стерильном боксе 75
2.3.4. Условия культивирования 76
2.4. Элементы учетов и методы обработки полученных данных 76
Глава 3. Введение эксплантов винограда в культуру in vitro и их развитие на этапе микроразмножения 78
3.1. Введение в культуру in vitro 78
3.2. Регенерация растенийиз апикальной меристемы 81
3.3. Влияние минерального состава питательной среды на развитие эксплантов винограда 86
3.4. Влияние регуляторов роста на развитие эксплантов винограда в условиях in vitro
3.4.1. Фаза удлинения побегов 93
3.4.2. Этапы укоренения побегов винограда in vitro 95
Резюме 96
Глава 4. Адаптация растений винограда in vitro при пересадке в нестерильные условия in vivo 98
4.1. Адаптация растений винограда в условиях in vitro 99
4.2. Адаптация растений винограда в условиях in vivo 101
4.2.1. Перевод пробирочных растений в нестерильные условия 102
4.2.2. Влияние температуры, света и влажности воздуха при адаптации растений полученных in vitro 105
4.2.3. Изучение возможности значительного повышения коэффициента размножение винограда 107
4.2.4. Применение регуляторов роста в период адаптации растений винограда в условиях in vitro (сосуд-пакетах) 109
4.3. Доведение растений винограда, размноженных методом in vitro, до стандартных саженцев в условиях теплицы И3
Резюме 115
Глава 5. Иммуноферментный анализ на содержание вирусов в растениях винограда, размноженных методом in vitro, и определение вирусоносителей на участках, планируемых под микроматочники новых сортов винограда 117
5..1. Тестирование посадочного материала винограда полученного методом in vitro на наличие вирусных заболеваний 117
5.2. Определение вирусоносителей на участках, планируемых под микроматочники новых сортов винограда 121
5.2.1. Методика отбора средней пробы почвы для выявления почвенных нематод 123
5.2.2. Методика приготовления препаратов 125
Резюме 128
Глава 6. Воздействие цеолитовых субстратов на укоренение, рост и развитие растений винограда при микроклональном размножении 129
6.1. Применение природных цеолитов в сельском хозяйстве 129
6.2. Цель и задачи, материал и методика проведения исследований 143
6.3. Определение оптимального гранулометрического состава фракций цеолитового субстрата 145
6.4. Влияние цеолита на укоренение, рост и развитие растений в условияхіп vitro 148
6.5. Влияние цеолита на укоренение, рост и развитие растений винограда в условиях выращивания сосуд-пакетах ., 150
6.6. Применение цеолита при доращивании растений in vitro в условиях защищенного грунта 152
6.7. Изучение водного режима, физических свойств субстратов и водообеспечение растений винограда 155
Резюме 159
Глава 7. Переход на промышленную основу производства посадочного материала винограда методом in vitro 161
7.1. Производство посадочного материала винограда в лаборатории in vitro 161
7.2. Адаптация посадочного материала винограда в условиях in vivo 168
7.3. Закладка микроматочников новыми перспективными, оздоровленными сортами винограда 179
Глава 8. Обсуждение результатов исследований 181
Выводы 195
Рекомендации производству
- Основные этапы клонального микроразмножения растений in vitro
- Подготовка и стерилизация исходного материала
- Влияние минерального состава питательной среды на развитие эксплантов винограда
- Влияние температуры, света и влажности воздуха при адаптации растений полученных in vitro
Введение к работе
Актувльностъ темы исследования. Виноград — одна га самых распространенных сельскохозяйственных культур, играющая существенную роль в мировой экономике.
Как свидетельствует мировой опыт, главная стратегия научно-технического прогресса заключается в решении проблем и вопросов, кмеюшнх базисное основополагающее значение, приводящее в конечном итоге и к большому экономического эффекту, В этом аспекте пути и методы БИОТЕХНОЛОГИИ — науки, возникающей на стыке нескольких биологических дисциплин: генетики, вирусологии, микробиологии и растениеводства занимают исключительно важное значение.
Стало очевидным, что выход нз кризиса, обеспечение эффективности производства, повышение финансовой устойчивости и конкурентоспособности продукции невозможны без перехода к новым технологиям и быстрого высокоэффективного технико-экономического освоения новых мощностей, создаваемых на основе базисных нововведений. В этом смысле особого внимания заслуживают проблемы организационно-экономического развития и освоения биотехнологии.
Ускоренное расширение площадей под новыми перспективными ценными сортами возможно только за счет разработок и совершенствования технологий, обеспечивающих ускоренное размножение перспективных сортов нового поколения,'сочетающих в себе повышение их урожайности и качество продукции с повышенной устойчивостью к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам.
С учетом этого, во многих странах мира большое значение в настоящее время придается внедрению в производство интенсивных методов производства высококачественного посадочного материала винограда и разработке новых высокоэффективных способов закладки виноградников. Одновременно с этим актуальной проблемой настоящего времени является
.у. ' ЦИБМСХА
фонд научной литературы
резкое сокращение илм полное исключение использования химических веществ, загрязняющих экологию зон возделывания винограда в борьбе с болезнями, вредителями и сорной растительмостыо, внедрение сортов, устойчивых к болезням и вредителям, не требующих химических средств борьбы. Поэтому особый интерес представляют сорта технического и столового направления, отличающиеся повышенной устойчивостью к болезням (мильдью, оидиум, серая гинль, антрокиоз и др.) и морозам. И это понятно. Ведь возделывание винограда комплексно-устойчивых сортов выгодно как экономически (меньше затрат труда и средств), так и экологически (продукция без остаточного количества ядохимикатов).
За последние десятилетия благодаря активной работе селекционеров виноградарей Российской федерации и ряда зарубежных стран подучено и передается ' производству большой набор новых сортов, отвечающих современным требованиям.
Однако одним из существующих препятствий на пути внедрения нового сорта а практику является низкий коэффициент их размножения обычными методами, не позволяющий получать в течение одного сезона большое количество посадочного материала. Это препятствие может быть устранено за счет использования достижений биотехнологии, которая предлагает селекционерам эффективный и быстрый метод мнкроразмножения растений. Очень важно и то, что посадочный материал, получаемый этим путем, генетически идентичен давшему ему начало материнскому растению.
Кроме того, «локальное микроразмиоженне винограда имеет ряд преимуществ и особенностей, а именно:
проводится в' лабораторных условиях, что исключает влияние различных негативных факторов окружающей среды;
обеспечивает высокий коэффициент размножения; позволяет производить посадочный материал оздоровленный от вирусови бакіериаяьногорака;
- проводить размножение растений круглогодично и на потоке. Таким образом, появляется возможность размножать сорта, которые плохо укореняются обычным способом и получать с единицы площади максимальное количество растений. При использовании этой технологии размножения исключается возможность перезаражения растений во время интродукции, а также устраняется вероятность завоза и распространения карантинных объектов, что имеет также немаловажное значение для обеспечения длительного хранения растений, находящихся в пробирках с целью сохранения генофонда. При использовании этой технологии значительно ускоряется процесс передачи Новых сортов и клонов в ГСУ и создаются за более короткий период мнкроматочники интенсивного типа в производственных условиях.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлось изучение особенностей регенерации растений и разработка рациональных ггроприемов при клональном микроразмножения посадочного материала винограда, использование этих приемов в системе оздоровлення и размножения посадочного материала, а также усовершенствование способов адаптации растений винограда, размноженных методом in vitro, для увеличения приживаемости в условиях in vivo и обеспечивающих повышение выхода и качества посадочного материала винограда, а также установление принципиальной . возможности использования гиббереллнна на семенных сортах винограда н разработка рациональных способов обработки виноградных насаждений механизированным способом путем сплошного опрыскивания.
В *тоИ еллзи нами применимо к культуре винограда решались следующие задачи: '
1. изучить и оптимизировать факторы, влияющие на регенерацию
эксплантами вегетативных органов;
2. оптимизировать состав питательных сред на всех этапах
культивирования эксплантов;
-
выявить оптимальные концентрации регуляторов роста и других веществ при длительном культивировании и хранении пробирочных растений;
-
исследовать возможность освобожден и» от вирусов получаемых растении методом культуры изолированных апексов (получение беэаирусных клонов с целью производства здорового посадочного материала винограда);
-
изучить и разработать эффективные способы переноса пробирочных растений in vitro в нестерильные условия in vivo;
-
определить оптимальные условия выращивания при адаптации растении, полученных in vitro н на основе их использования разработать технологические приемы;
-
определить экспериментальным путем оптимальный субстрат для выращивания растений, полученных в условиях in vitro;
-
изучить возможность повышения коэффициента размножения;
-
изучить эффективность действия стимуляторов роста при адаптации м выгонке, растений, полученных in vitro и рекомендовать наиболее перспективные из них для практического использования; ,f-
10. выявить видовой состав нематод на участках, предназначенных под
закладку микроматочников оздоровленным посадочным материалом винограда;
П. изучить влияние гмббереллмна на рост н развитие вегетативных н генеративных органов виноградного растения;
-
изучить влияние гибберелли на на качество и продуктивность насаждении семенных сортов винограда; - г: '' л ; "«',
-
изучить влияние гиббередлина на физиологические и биохимические показатели сортов винограда различных эколого-гсографичечжкх ipynn;'r '
14. разработать регламенты .'механизированной! обработки
гибберелянном насаждений семенных сортов винограда (сроки обработки,
концентрации раствора и др.),-: '"./"j-''^-''--'.^-- !-v.^-''"-'.'"';''''-;'
В раГюте изучен, обобщён и использован опыт работы ведущих стран ыипа по производству и переработке винограда, таких как Франция, Италия,'
-.**-' --, '. vr;^V;ч-:^' ;"Ч-'--О-'-у-
Испания, США, Австралия - и др.(ьсего 1о стран) в период прохождения стажировки по лннми МОВВ (I993...I996 гг.}. Во Франции основные исследования по in vitro винограда проводятся в лабораториях тканевой культуры Национального научно-исследовательского института в Монпелье под руководством профессора Boubals D. и на Национальной (Государственной) опытной станции по оздоровлению, расположенной на tore Франции на - прибрежных песках Средиземного моря, под руководством профессора Grenan S. Основные направления научных работ: оздоровление н размножение методом in vitro посадочного материала винограда: координация всех научно-исследовательских работ в стране по санитарной и клеточной селекции; прививка винограда в условиях in vitro и изучение совместимости различных, привоев с подвоем; создание базовых маточников, размножение и распространение оздоровленного посадочного материала винограда по всей стране. В Испании в Научно-исследовательском институте Агробиологии исследователями Martinez M.C.R. м Mantilla J.L.O. проводятся исследования по вопросам сохранения гагогишіческсД стабильности у растений, размноженных в культуре изолированной ткани и устранения характера ювеинльностн. В Португалии, Аргентине н Венгрии занимаются изучением общих вопросов оздоровления. посадочиого - материала . винограда и созданием базовых маточнике*.: В США под руииюдстьом профессоров Wofcer R. и Meridit К. а условиях at vitro исследуют проблемы, связанные с генетической инженерией и клеточной селекцией винограда.
Научная новизна. Впервые в условиях Чеченской Республики проведено оздоровление и размножение посадочного материала винограда методом in vitro. Предложены более совершенные методы ынхроклонального размножения вииограда; при введении зкеляантов винограда в культуру in vitro и их развитие на этапе '! мніфОразмножения установлены оптимальные концентрации растворов регуляторов роста, кх влияние иа развитие эксплантоа в условиях in vitro, а также їй укоренение, рост и развитие растений, в период их адаптации и
выгонки в условиях in vivo; впервые для адаптации и выгонки пробирочных растений изучены и рекомендованы субстраты нэ цеолитов Тедзаминского месторождения, определен их оптимальный гранулометрический состав фракций и его влияние на укоренение, рост « развитие растений винограда в условиях in vitro и in vivo; изучено влияние водного режима и физических свойств цеолитовых субстратов на рост растений винограда; впервые изучен и рекомендован метод адаптации в широких пробирках, который позволяет в весенний период высаживать растения in vitro непосредственно в теплицу, минуя промежуточный этап адатацни в сосуд-пакетах; на этапе дополнительного повышения коэффициента размножения в условиях in vivo (в сосуд-пакетах) изучено и рекомендовано использовать, перлит двухразового обжига; впервые проведены широкомасштабные исследования наличия ьирусоносителей на участках планируемых под закладку маточников оздоровленным посадочным материалом винограда и установлено, что из трех выбранных для закладки в них маточников в госхозе «Грсбенскойж имеются вирусоноси*едн Xiphinema index и Longidorus elongatus. Проведенный, нами анализ на наличие вирусов в растениях, полученных методом in vitro по методу Eli&a teste показал, что а растениях, оздоровленных в условиях in vitro, вирус отсутствует. На основе всестороннего анализа и обобщения, а также многолетней экспериментальной проверки вначале в лабораторных, а затем и в производственных условиях усовершенствована технологи* микроклоналытого размножения винограда. Впервые проведено агробиологическое, цитоэмбрнологнческое и хозяйственно-технологическое изучение влияния гнббереллина на семенных сортах винограда при сплошном их опрыскивании и ' установлена биологическая возможность и экономическая целесообразность применения приема механизированной обработки сортов винограда, имеющих функционально-женский тил цветка, который обеспечивает увеличение рентабельное используемого приема на 27,4%, В результате многолетних не питаний установлено, что характер и эффективность действия препарата на
виноградное растение в значительной степени зависят от принадлежности сортов к различным экологочеографическнм группам, их биологических особенностей, концентрации раствора препарата и срока обработки; впервые проведено испытание действия препарата дрол на семенные сорта винограда.
Практическая значимость и рсалкмииа результатов исследований.
Практическая значимость состоит в том, что предлагаемая технология клонального микроразмножения винограда позволяет производить оздоровленный от вирусов н патогенных микроорганизмов посадочный материал винограда круглогодично к на потоке, имея при этом высокий коэффициент размножения.
На основании проведенных исследований и опытов по элементам более совершенной технологии in vitro из оздоровленного посадочного материала винограда созданы ынкроматочники в виноградарских хозяйствах Чеченской Республики (госхозы «Восточный», «Авангард», «Советская Россия», ОПХ «Гикалоасхое»), Республике Дагестан (госхоз «АксаЙ») и Ростовской области (госхоз «Краснодонский») на площади более 10 га.
. Предложенная технология по механизированному опрыскиванию семенных сортов винограда, имеющих функционально-женский тип цветка позволяет повысить урожайность.и качество семенных сортов винограда, имеющих функционально-женскнй тип цветка Нимранг и Каттакурган при незначительных затратах труда.
Положенно, выносимые иа защиту. Совершенствование сортимента винограда с учетом современных требований была, есть, будет и в перспективе одной из ведушнх актуальных проблем. Эффективность ее решения тесно связана с гюйсами и разработкой прогрессивных технологий ускоренного размножения и внедрения новых сортов винограда, обеспечивающих повышение' коэффициент* их размножения и получение оздоровленного сертнфяшіроааиного посадочного материала.
Одним из путей и методов её решения является технология мнкроклоналСного размножения винограда, которая представляет собой систему приемов и методов, органически связанных между собой. Каждое та звеньев этой технологии находится, в свою очередь, в процессе бесконечного совершенствования и модификации. Изложенная в диссертации технология представляет собой усовершенствованную модель, основанную на обобщении экспериментально разработанных нами звеньев и широком использовании' передового зарубежного опыта. Многолетняя проверка жизненности н эффективности использования этой технологии в производственных условиях показала ее состоятельность и эффективность, доказательством чему является получение высококачественного оздоровленного посадочного материала винограда, которым заложено более 10 га маточников новых сортов в б виноградарских хозяйствах.
На защиту выносятся усовершенствованные звенья згой технологии к числу которых, главным образом относятся: эффективность использования 2%-го гипохлорита Na при экспозиции 10 мин; модифицированная питательная среда Мурасиге и Скуга по сравнению со средами Готре, Уайта н Хеллера; лучшая регенерация изолированных меристем винограда при использовании 6-БАП в концентрации 0,5-1,0 мг/л, а при массовом размножении одноглазковымн эксплантами а концентрации 2 мг/л, также при этом выявлена эффективность действия 2-ІР (нэопентнлаленин); преимущества ПС в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л; повышение активности и общей результативности укоренения микропобегов на питательной среде, содержащей ИМК в концентрации 2 мг/л; использование различных субстратов . (песок, перлит, иеолит) в сосуд-пакетах ні полиэтиленовой пленки при переносе растений, находящихся в пробирках в нестерильные условия; преимущества использования субстрата перлита 2-разового обжига, обеспечивающего приживаемость растений и собственно размножения в сосуд-пакетах; оптимизация срока пересадки растений
винограда после адаптации » условия защищенного грунта (месяцы: март, апрель); оптимизация по механическому составу твердой, жидкой и газообразной фаз цеолитового субстрата с пористостью 50% н НВ-50%; сокращение периода укоренения растений винограда в условиях in vivo на цеолнтовом субстрате; а также ряд других звеньев обшей технологии микроклокальиого размножения и оздоровления посадочного материала винограда.
Все вышеизложенные закономерности получены на основе методически выдержанных многолетних экспериментов, анализа н обобщения опыта зарубежных стран.
В число традиционных методов, способствующих повышению урожайное виноградников (удобрення,' орошение,, фототехника и др.) в последние десятилетня вошел эффективный прием обработки виноградных насаждений регуляторами роста, среди которых наиболее широкое распространение получил гиббереллив. На основании результатов многолетних экспериментальных - исследований, проведенных на многих сортах, относящихся к различный эюлого-географнческим группам, выявлены определенные закономерности » реакции сортов на обработку их гнббереллнном. Это позволяет научно-обоснованно подбирать сортимент, прогнозировать уровень; эффективности' более целенаправленно решать задачи по использованию этого приема.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международных, республиканских конференциях, а также на различных совещаниях, посвященных производству посадочного материала винограда: Всероссийский ННИВиВ имЛ.Н.Потаиенко (Новочеркасск, 1993, 1996, 1998); ТСХА (Москва, 1985, 198*. 1997, 1998); ВНИИВиВ «Магарач» (Ялта.1988); Дагестанский НИИВиВ (Мамедаала, 1988, 1990); ИФР (Москва, 1997); ЧТУ (Гроэ»ый,1998);. ;:»'";;.
По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе две монографии, общим объемом 25,8 печатных листов и оформлено одно изобретение. Основные научные разработки н нх усовершенствования вошли в программу теоретических курсов и лабораторно-прахтических занятий дисциплин «Сельскохозяйственная биотехнология» и « Виноградарство» для студентов Аграрного факультета ЧТУ н других сельскохозяйственных высших учебных заведений.
МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования н обобщение материала проводили в 1983... 1993 гг. на кафедре виноградарства ТСХА к в отделе виноградарства ЧНИИСХ.
Одним из основных условий успешного культивирования изолированных органов растений являете* соблюдение строгой стерильности. Необходимость соблюдения тщательной стерилизации обусловлена тем, что на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования изолированных органов растений, одновременно хорошо развиваются - и патогенные микроорганизмы, «вторые создают двойную опасность для культивируемых тканей.
Падготонка и стеанлязапма исхвлного материала. 8 качестве исходного матерная* культуре ю лгнто иепохмовалм интенсивно растущие зеленые побеги винограда заготовленные с вегегирующих кустов винограда мас.июне и из выведенной из состояния покоя шфевшен лозы в осенне-зимний период. В последнем. случае, «ызревшую лозу нарезали на ' явух...трехглаткоаые черенки длиной 8 .13 см и ставням м проращивание при температуре воздуха 25.. JO t
Через 25.. JO суток, в зависимости от сорта и степени покоя дозы, на черенках появлялись зеленые побеги.
Из доставленных в лабораторию зеленых побегов растений, произрастающих в поле или заготовленных нэ выведенной из состояния покоя вызревшей лозы, отчленяли верхушки побегов размером 2...3 см. Верхушки побегов, помещенные в марлевые мешочки стерилизовали в 70 %-м этиловом спирте 30...40 сек. Затем мешочки помещали в гнпохлорит натрия. Время стерилизации в гнпохлориге натрия 8...10 мин. После мешочки перемешали в стерильную воду для промывки от дезинфицирующих веществ.
Работы по высадке исходных эксплантатов, а также расчленение и посадку проводили в ламинарном боксе. После посадки пробирку с одноглазковым эксплантом переносили в культуральную комнату с температурой 23...28 "С и освещением 3...5 тыс люкс.
Приготовление питательных сред. Питательные среды готовили на бнднетнлнрованной воде. Навеску агара переносили в колбу, заливали половинным количеством (от объема среды) воды и выдерживали на водяной бане до полного растворения агара. Параллельно готовили раствор минеральных солей, сахарозу и регуляторы роста. После некоторого охлаждения агара его сливали с раствором составных компонентов питательной среды. Соли железа, сахарозу и другие добавки готовили в день их использования. Растворы минеральных солей и витаминов готовили заранее в укупоренных стеклянная я хранили при температуре 3...5 "С.
ТН питательной среды определяли рН - метром (ионометром) перед автоклавированием. Для установленій нужного значения рН использовали однонормалыше растворы NaOH и НС1. Питательную среду разливали в предварительно простерилиэованные сухим жаром пробирки и устанавливали в бюксы м стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 атмосфер в течение 20 мян- .'>"" У-':';'-:. "/.
Работа я- стерильном боксе. Все процессы изоляции, посадки, пересалю* эксплантоь проводили в пылезащитных камерах. Такие лаыинар-бокси обеспечивают высокую степень стерильности. Они были установлены »
специальной комнате, предварительно лростерилизованной
ультрафиолетовыми лампами в течение . I часа. Для обеспечения дополнительной стерильности в рабочей зоне пылезащитны* камер дополнительно устанавливали бактериальную лампу типа БУВ - 15. Под ее действием проходило облучение инструментов и других материалов перед началом работы и, кроме того, снижался риск эаноса микроорганизмов при манипуляциях, связанных с необходимостью вносить предметы н материал при отключенном двигателе пылезащитной камеры.
Перед началом работы поверхность рабочей зоны пылезащитной камеры обрабатывали ватным тампоном, смоченным 96 %-ым этиловым спиртом. В самой камере постоянно находились бинокулярная лупа, спиртовая горелка н инструменты для изоляции регенератов и пересадок, чашки Петри для хранения ватных тампонов. Инструменты в процессе работы держали а стакане, а перед операцией вы членения верхушек, обновления среза, черенкования побегов обжигали над пламенем спиртовки до испарения спирта.
Все процессы вычленения, черенкования побегов н другие манипуляции проводили на стерильных, увлажненных - фильтрах, помешенных в чашки Петри. Такие комплексы стерилизовали завернутыми в специальную бумагу в автоклаве в течение t часа при давлении 2 атм, Увлажненные фильтры предохраняли экелланты от высыхания, которое могло возникнуть в условиях пылезащитных камер при постоянном движении воздуха.
Условия культмвмрвелмт. Экснланту культивировались вЧкиналыюи
састокомиагс ігри верхнем освещении и освещении между рядами пробирок.
Источник освещения ЛДЦ 80.. Постоянная температура сохранялась при
помощи бытовых кондиционеров БК 2S00. Культивирование вели при 16-
часовом световом диві освещенностью 3,0...5,-0 тыс люкс ш температуре 24.,.26
х. . '_
Элементы учетов и методы *браб*тки пелученимх данньїі. При
проведении опытов по клональному микроразмножению регистрировали
следующие показатели: инфинированность эксплантов, %; количество погибших культур, %; увеличение размера экепланта, мм; среднее количество междоузлий с листом на побег, шт; формирование побега, см; образование корней, их количество, шт., длина, мм, сырой вес. г; выход растений, пригодных к пересадке в нестерильные условия, %; приживаемость растений в нестерильных условиях, %.
Повторності, опытов была 10,,.20 - кратная (в зависимости от типа опыта), неизолированная, в делянке одни эксплант.
Математическую обработку проводили методом дисперсионного анализа по Доспехову В. А. (1985).
Изучение реакции семенных сортов* винограда различных эколвгв-гееірафнчссхих групп на применение гиббереллниа.' С учетом стоящей задачи установления различий реакции семенных сортов, относящихся к различным эколого-гесграфнчесхим группам, подбор изучаемых сортов проводился под ч. этим утлом зрения, В их число вошли следующие сортообраэаы: а) обоеполый тип цветка - Джанджал кара, Хусайне, Тайфн розовый, Сурхак китабскни, Халили черный. Баян ширей, Юмалак и б) функцнонллыто-женскив тип цветка - Каттакургал, Нимранг, относящиеся к восточной эколого-географнческоЙ группе (Convar orienfatis Negml). Также в опыт были включены обоеполые сорта западно-европейской группы (Convar occidental»* Negml) Рислинг в Мускат венгерский. Из сортов группы бассейна черного мора (Convar ролп'са Negnd) сорт Ркацители.
Обработка -: препаратами гнббереллня к дроп проводилась методом сплотяого опрыскивания кустов винограда с помощью ручного ранцевого опрыскивателя в конце цветения. Расход рабочей' жидкости один литр на один куст. Каждый вариант опыта включал в себя однорядную делянку по 40 кустов, 10 из которых являлись учетными (куст - повторность). Таксация н отбор
-О-
однородных учетных кустов проводились на основании результатов предварительного проведеній агробиологических учетов.
Агробиологические учеты и наблюдения проводились по общепринятым
методикам (Ампелография СССР, т.), 1946) и включали в себя изучение роста
побегов* показателей плодоносности, величины и структуры урожая. Динамика
роста ягод изучалась с применением специально разработанной методики,
позволяющей формировать изменения объемов ягод без их отрыва от гроздей.
Динамика роста и развития листовой поверхности определялась методом
Мельника и ЩегловскоЙ (Агротехнические исследования по созданию
интенсивных виноградных насаждений на промышленной основе, 1978).
Определение содержания хлорофилла в листьях . проводилось путем
исследования спиртовой вытяжки пигментов на ФЗКе (Практикум по
физиологии растений, 1972). Определение продуктивности фотосинтеза
проводилось по методике Амирджанова (Сборник методик по фиэиолого-
бнохимическнм исследованиям в виноградарстве, 1967). Определение
накопления'Сахаров проводилось в период достижения технической зрелости
ягод с помощью лабораторного рефрактометра. Микроскопический анализ
степени развития эмбрионального побега и его плодоносность проводили С
помощью микроскопа М6С-9. Экономическая эффективность применения
гмббереллина на семейных сортах винограда механизированным способом
подсчитывалась по Никифорову (1976). Матсмазмческая обработка полученных
данных проводилась методом дисперсионного анализа по Доспехову Б.А.
(1976).
-/*-
Основные этапы клонального микроразмножения растений in vitro
Возникший более пятидесяти лет назад метод культуры тканей, клеток и изолированных протопластов растений развивался очень быстрыми темпами.
В конце прошлого — начале нынешнего века немецкие ученые Vchting (1892), Rechinger (1893) и Haberlandt (1902) пытались выращивать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток на растворах сахарозы. Жизнеспособных растений из тканей в условиях in vitro они не получили. Не достигнув экспериментальных успехов, эти исследователи высказали ряд ценных идей и гипотез, направленных на разработку и совершенствование данного метода.
Начало успешному развитию метода культуры тканей и клеток высших растений положили работы французского Gautheret (1932) и американского White (1934) исследователей. Gautheret (1934) ввел в культуру каллусные ткани древесных растений камбиального происхождения и каллусные ткани запасающей паренхимы. White (1939) показал способность тканей растительных опухолей к неограниченному росту при субкультивировании.
Основоположником клонального микроразмножения растений является франзузцский ученый Morel (1959,1963), который установил, что апикальные меристемы картофеля и георгинов способны формировать каллус при обогащении питательной среды витаминами, глутамином, цистеином и кинетйном. При добавлении гибберелловой кислоты развивался миниатюрный побег. В 1960 г., культивируя на питательной среде верхушку цимбидиума — растения из семейства орхидных, Morel обнаружил образование в культуре ткани сферических тел и установил, что их можно неоднократно делить, проращивать и таким образом получать из них полноценные жизнеспособные растения. Эти наблюдения легли з основу метода микроразмножения орхидей. Французские фирмы, занимающиеся разведением этих оригинальных декоративных растений, использовали метод Morel для массового производства орхидей. С этого времени проблема клонального микроразмножения растений стала одной из актуальнейших проблем современной физиологии растений и сельского хозяйства.
В нашей стране работы по клональному микроразмножению растений были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева под руководством Бутенко Р.Г.(1960, 1964). Здесь были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, малины, гвоздики и других растений.
В настоящее время в Российской Федерации исследования в области клонального микроразмножения винограда проводятся в лабораториях тканевой культуры отдела виноградарства Чеченского научно-исследовательского института сельского хозяйства и во Всероссийском НИИВиВ имени Я.И. Потапенко, а также в НИИВиВ стран СНГ (Молдова, Украина).
Одним из главных направлений использования культуры тканей и органов растений является ускоренное размножение новых сортов или свободных от вирусов растений существующих сортов экономически важных культур, которые в противном случае потребовали бы много лет для размножения обычными способами. В настоящее время применение технологии культуры тканей для ускоренного микроразмножения ограничивается главным образом высокоценными плодовыми, ягодными и декоративными растениями. Например, масличная и кокосовая пальмы являются важнейшими тропическими культурами, вегетативное размножение которых обычными способами невозможно, а потомство из семян очень вариабельно в генетическом отношении. Стало возможным выделить высокоурожайный клон масличной пальмы посредством каллусной культуры, используя которую, можно размножать масличную пальму вегетативно, сохраняя наиболее ценные качества в потомстве (Hussey С, 1983). Получая растения из каллусной культуры, многие исследователи отмечают значительное расхождение качественных и количественных признаков среди регенерированных растений: некоторые растения могут обладать ценными признаками, такими как устойчивость к болезням, более высокая урожайность (Ятайкина И. П., 1970; Лейко Г. и др., 1980).
В начале 70-х годов были регенерированы из каллуса несколько полезных разновидностей сахарного тростника, включающих растения с устойчивостью к различным грибным и вирусным заболеваниям. Некоторые из клонов этих растений отличаются повышенным содержанием сахара (Hussey С, 1983).
Результаты клеточной селекции свидетельствуют о том, что возможно получение генетически измененных растений-регенерантов без использования специальных мутагенных факторов, а применение последних, как правило, увеличивает число мутаций.
Гибридизация соматических клеток путем слияния протопластов привлекательна для практиков, в первую очередь, как способ преодоления несовместимости партнеров при отдаленной гибридизации (Бутенко Р. Г., 1983; Mhare М. et al., 1984; Chin—Yi Lu et al., 1984).
Селекционерам необходимо иметь возможность использования многочисленных линий определенных культурных растений, включая дикие виды, которые могут содержать ценный генетический материал.
Выращивание и содержание этого материала общепринятыми методами требует много времени и площадей. Растения в культуре in vitro не только защищены от болезней, но я могут храниться долгое время при температурах немного выше нуля. При низких температурах культуры растут так медленно, что пересадки становятся необходимыми через интервал от 6 месяцев до нескольких лет.
Более эффективные методы основаны на развивающемся криогенном хранении, при котором культивируемый растительный материал замораживают в жидком азоте, где он может храниться неопределенно долго. Верхушки побегов некоторых видов были заморожены в жидком азоте и после определенных процедур оттаивания успешно использованы для получения целых растений (Kenr А., 1976;HusseyС,1983).
Подготовка и стерилизация исходного материала
Голодрига П.Я. и др. (1982) установили, что адаптация успешнее протекает при пересадке в нестерилизованный субстрат. Однако, учитывая необходимость борьбы с почвенными патогенами, большинство исследователей рекомендуют для этих целей использовать обеззараженный субстрат. В качестве субстрата часто применяют перлит (Совздарг Э. Э. и др., 1983; Donath Р. et al., 1988), смесь почвы, торфа и песка в соотношении 1:1:2 (Клоконос Н.П., 1987), Велчев В. и др. (1983) достигли хороших результатов по приживаемости ежевики при высадке растений на минеральный субстрат Балканин 1., Свитайлов А. Н. и др. (1988) сообщали о положительном опыте использования минеральной ваты.
Дорошенко Н.Щ1994) разработала способ адаптации пробирочных растений винограда на СУВРах в торфоперегнойных горшочках, помещаемых в индивидуальную камеру из полиэтилена, где предлагается субстрат-торф : песок: почва(1:1:1).
Попов Ю. Г. (1976) отмечал , что пересадка регенерантов может быть одно- и двуступенчатой. В первом случае их высаживают непосредственно в горшки с почвой, а во втором — сначала в нейтральный субстрат и лишь затем — в почву. Несмотря на громоздкость двухступенчатой пересадки, именно она дает наиболее надежные результаты. Бленда В. Ф и Кириленко Е. Д. (1982) сначала высаживали регенераты в жидкую среду. Готре с добавкой 1%-й сахарозы и затем — в почвенный субстрат. Достаточно высокая приживаемость достигалась при использовании полиэтиленовых контейнеров (Высоцкий В. А., Герасимова Н. В., 1987; Архангельская Г. П., Смертин Е. Е., 1988).
Исследования в направлении совершенствования процесса пересадки провели Насимов А. 3. и Зленко В. А. (1987), закрывая пробирки целлофаном, проницаемым дня воздуха, что позволяло проводить адаптацию к более низкой влажности воздуха на стадии укоренения. Бургутин А. Б. (1988) рекомендовал для адаптации винограда снять покрытия с тех пробирок, в которых побег достиг пробки, и через 1,5 -2 недели пересадить растения вместе с агаровой средой в почвенный субстрат с сильным заглублением побега. При данном способе пересадки отпадает необходимость в туманообразующей установке. Корнацким С. А. и др. (1984) разработан способ адаптации растений непосредственно в пробирках, при котором с пробирок снимают покрытия, а защиту питательной среды от инфекции осуществляют путем нанесения раствора фунгицида.
При использовании метода адаптации пробирочных растений (Голодрига П. Я., Зленко В. А., Чекмарев Л.А., Бутенко Р. Г., Левенко Б. А., 1986) приживаемость составляет более 50%. В пленочной теплице, оборудованной туманообразующей установкой, высаживают пробирочные растения в бороздки глубиной 4-6 см и шириной 6-8 см, через 20-30 см. Для полива растений используют раствор, Чеснокова В. А. (1960). Эти бороздки засыпают известковым торфом (рН 5-7) или смесью торфа с перлитом в соотношении 2 :1 по объему.
Для устранения перегрева растений прямыми солнечными лучами используют притенение из полос мешковины шириной до 80 см, натянутых вдоль теплицы, закрепленных на высоте не менее 2 м. Между полосами оставляют просвет менее 1/ 5 ширины полос. Первые 7-14 дней температура в теплице не должна превышать 30 С, а относительная влажность в зоне растений должна быть 100%. Как отмечают Morini S., Barbieri С. (1986), способность саженцев к акклиматизации может зависеть от ряда факторов, наиболее важными из которых являются изменения, возникающие в тканях вследствие особых условий питания и среды (повышенный и постоянный уровень относительной влажности воздуха и одинаковые температуры) внутри горшочка для культуры. Важную роль, естественно, выполняет сам корневой аппарат, который представляет собой первую критическую стадию (процесс укоренения), следующую после пересадки. Многие факторы, относящиеся к субстрату культуры, оказывают влияние на жизнедеятельность корней. Из всех наземных частей растения лист является органом, имеющим наиболее заметные изменения.
Criccotti А. М. (1982) констатировал, что первоначальное нахождение растеньиц в течение не менее двух недель под стеклянным колпаком в климатизированной камере оказалось эффективным и гарантирует адаптацию в горшочках до пересадки во влажную теплицу.
В своих исследованиях Renther G. (1983) отмечал, что оформившиеся растеньица, полученные в условиях in vitro, сорта Рислинг можно пересаживать в горшочки на содовый субстрат и нужно следить за поддержанием высокой относительной влажности воздуха, чтобы избежать повреждений от высыхания.
Пересадка пробирочных растеньиц на горшочный субстрат, их адаптация, доращивание, накопление и хранение для высадки в открытый грунт составляет третий этап указанного процесса. Метод размножения технологичен, хорошо показал себя не только на малых, но и на больших объемах (Литвак А. И., Кузьменко А. П., Гузун Н. И., Минакова Р.И., 1985).
Влияние минерального состава питательной среды на развитие эксплантов винограда
Одним из важнейших и неотъемлемых компонентов питательной среды являются регуляторы роста. Их тщательный подбор и выявление оптимальных концентраций позволяют повысить эффективность метода клонального микроразмножения винограда in vitro.
Проведенные эксперименты показали, что регенерация побегов из изолированных апексов происходила при всех концентрациях 6-БАП, кроме как при добавке препарата в количестве 5,0 мг/л, когда верхушки сразу начинали чернеть и гибли. Верхушки, выращиваемые на среде с концентрацией 0,01...0,1 мг/л 6-БАП развивались очень медленно. Вероятно, это связано с тем, что такие низкие концентрации препарата слабо стимулируют процессы органогенеза растений.
Самые лучшие результаты были достигнуты на среде с концентрацией 1,0...2,0 мг/л. Реакция меристематических верхушек на такие концентрации проявилась в образовании четко выраженного бурого пробковидного каллуса у основания верхушек. В дальнейшем наблюдались развитие листьев, конус нарастания у верхушек вытягивался.
Таким образом, оптимальная концентрация 6-БАП для развития верхушечных меристем винограда равна 1,0...2,0 мг/л. Однако последующие исследования по изучению влияния 6-БАП на развитие одноглазковых эксплантов винограда, на этапе собственно размножения оптимальные дозы концентрации сдвигаются в меньшую сторону (табл. 5).
Наиболее эффективное влияние 6-БАП оказал в диапазоне концентрации 0,5...1,0 мг/л. Тем не менее следует отметить наибольший прирост микропобегов, который был зафиксирован в варианте с концентрацией 1,0 мг/л. Минимальная длина микропобега наблюдалась в вариантах с концентрациями 0,1, а при концентрации 5,0 мг/л вообше подавляется развитие побега, это говорит о том, что в первом случае данная концентрация недостаточна для максимального удовлетворения возможностей эндогенного цитокинина для роста и развития микропобега, а во втором случае наоборот - высокая концентрация препарата ингибирует развитие микропобегов (табл.5).
Другим веществом, обладающим цитокининовой активностью, явился пропарат цитокининого характера действия ДРОП. Действие препарата, оказываемое им на развитие экспланта - микропобегов различных сортов винограда, оценивали по развитию длины побега и количеству междоузлий, так как чем больше междоузлий с листом, тем больше и коэффициент размножения. Таблица 6 Развитие микропобегов винограда на среде, содержащей ДРОП (1990-1992 г.г.).
Число междоузлий с листом, развивающихся на микропобегах in vitro. помещенных на среды с разными концентрациями ДРОП, не имело существенных различий, кроме варианта, где уровень концентрации ДРОП был равен 0,1 мг/л. В этом случае отмечено максимальное число междоузлий с листом. В варианте опыта с высокой концентрацией ДРОП 2,0 и 5,0 мг/л было отмечено аномальное развитие микропобегов.
Также было установлено, что максимум стимулирующей активности у ДРОПа на этапе регенерации верхушечных меристем приходился на значительно более низкие концентрации (0,1...0,5 мг/л). При таких концентрациях отмечен более интенсивный рост побегов.
Дальнейшее повышение концентрации до 2,0...5,0 мг/л вызывало не только подавление регенерационных процессов, но и гибель культивируемых верхушек меристем, особенно в варианте при концентрации 5,0 мг/л, в котором верхушки после помещения на такую среду гибли через 6...8 дней
Длительное выращивание эксплантов винограда на средах с повыщенной концентрацией цитокининов вызывало торможение роста побегов. Побеги (кластер-побеги), пересаженные на среду укоренения, очень часто не образовывали корней и гибли. Поэтому перед этапом укоренения целесообразно ввести фазу удлинения побегов.
Как показали эксперименты, для доведения побегов до длины, пригодной для укоренения (более 10 мм), достаточно было осуществить пересадку на среду с содержанием 6-БАП 0,5...0,1 мг/л. Применение такой концентрации 6-бензиламинопурина позволило уменьшить ингибирующее действие цитокининов, что привело к росту побегов. На такой среде побеги активно росли и через 14... 15 дней достигали длины до 20 мм (рисЛ).
Для ускорения процесса удлинения побегов параллельно проводили изучение действия гибберелловой кислоты в различных концентрациях в сочетании 6-БАП. Как показал опыт, при сочетании 0,5 мг/л 6-БАП +1,0 мг/л ПС был достигнут наилучший результат. Такое сочетание препаратов ускоряло вытягивание стеблей у растений, и через две недели размер побегов достигал 25...26 мм. В других сочетаниях побеги намного уступали побегам, выращенным на среде с 6-БАП в концентрации 0,1 мг/л.
Таким образом, проведенные нами эксперименты показали эффективное действие ПС и пониженной концентрации 6-БАП для удлинения побегов перед этапом укоренения. Динамика развития побегов винограда на средах, содержащих 6-БАП и его сочетаний с ГК сорт Подарок Магарача Именно в этот период необходимо обеспечить развитие нормальной корневой системы, после чего растения можно высаживать в почву (сосуд - пакеты), либо помещать на длительное хранение при пониженных температурах.
Как известно, для стимуляции корнеобразования применяют ауксины. Учитывая это, нами был изучен характер действия различных регуляторов роста ауксиновой природы с целью установления оптимальной концентрации используемых препаратов.
Вначале были испытаны на укоренение побегов in vitro различные концентрации ИМК. Через 15 дней после применения наибольшее число корней образовалось в варианте опыта при концентрации ИМК 2,0 мг/л. В дальнейшем корнеобразование продолжалось, и через 30 дней количество корней увеличилось, процент укоренения составил 96 %. Параллельно начался интенсивный рост растений, удлинялись черешки листьев, разрасталась листовая пластинка, вытягивался стебель.
При других трех испытанных концентрациях ИМК процент укоренения был меньшим (табл. 8). Повышение концентрации ИМК в среде до 10,0 мг/л приводило к развитию многочисленных ненормально утолщенных корней и замедлению роста побегов. Спустя месяц число укоренившихся побегов ни при одной концентрации ИМК не увеличилось, продолжался только рост центральных и частично боковых корней. Следует отметить, что к 30-му дню у многих растений наблюдалось почернение корней, особенно при высоких концентрациях ИМК 5,0 и 10,0 мг/л.
Влияние температуры, света и влажности воздуха при адаптации растений полученных in vitro
После того как растения винограда проходили адаптацию в сосуд-пакетах, они поступали в тепличный накопитель. Здесь проводилась работа, характерная для ухода за растениями в условиях теплицы.
Посадку пакетных растений винограда производили после подрезания дна пакета вместе с песчаным субстратом в грунт теплицы, верхний слой которого перемещали с песком на глубину 20 см. Летом, при сильной солнечной инсоляции, молодые растения необходимо притенять. Пакеты с растениями размещали сплошными рядками с расстоянием 20 см, при расстоянии между растениями в ряду 10 см.
На начальном этапе наших исследований посадку растений в теплицу производили постоянно и на потоке, по мере завершения адаптивного процесса растений из сосуд-пакетов в культуральной комнате. Однако при этом мы столкнулись с определенными трудностями. Во-первых, у растений, высаженных в тепличный накопитель в зимний период, приживаемости, роста и развитие задерживались и проходили слабо из-за проблем, возникающих с отоплением больших теплиц и недостаточным освещением.
В связи с этим мы пошли по менее дорогостоящему направлению, о чём свидетельствуют экспериментальные данные, полученные в течение нескольких последующих лет.
Проводя массовое черенкование в осенне-зимний период как пробирочных растений, так и растений в сосуд-пакетах, переводили растения, прошедшие адаптацию, в специальную комнату с температурой 10... 12 С. В таком состоянии растения, как правило, замедляют свой рост и развитие. Таким образом, мы создали накопитель с десятками тысяч растений.
В конце марта - начале апреля эту большую партию растений высаживали из сосуд-пакетов в теплицу (можно и в пленочную), и к концу вегетации (осенью) эти растения доходили до стандартной величины. Растения, которые поступили в теплицу в мае-июне, хорошо приживаются, растут, но не успевают достигнуть до стандартных саженцев, в связи с чем их приходится оставлять на второй год.
Растения винограда из сосуд-пакетов поступали в тепличный накопитель как с песчаным, так и с перлитовым субстратом. Ранее мы отмечали, что укоренение, рост и развитие растений in vitro с перлитовым субстратом в сосуд-пакетах выше по сравнению с песчаным субстратом. Однако при высадке в грунт растения с песчаным субстратом проходили адаптацию к условиям быстрее, чем с перлитовым, также и процент приживаемости был выше.
В результате мы пришли к следующему выводу: что лучше использовать цеолитовый субстрат в сосуд-пакетах на этапе увеличения коэффициента размножения (методом черенкования), а для растений, которые, по нашим расчетам, после адаптивного процесса будут высажены в теплицу, необходимо использовать песчаный субстрат, при котором мы отмечали более высокую приживаемость и лучшее прохождение адаптивного процесса.
В наших исследованиях была поставлена задача найти более совершенный метод адаптации, позволяющий устранить существующие трудности, возникающие в традиционных технологиях.
Адаптацию к условиям in vivo растения безболезненно проходят в пробирках. Для этого достаточно снять с пробирок алюминиевую фольгу, которой закрываются пробирки. При полном снятии фольги с пробирок и открытии на 50 % наблюдался высокий процент гибели растений в условиях in vitro. При открытии пробирок на 1/3 (30 %) газообмен условий in vitro и in vivo протекает плавно и нежные ткани листьев винограда адаптируются постепенно и повышается выход растений винограда до 85...90 %.
На этапе перевода пробирочных растений in vitro в нестерильные условия in vivo 3 качестве субстратов в сосуд-пакетах нами использовался песок в различных соотношениях. Процент приживаемости и развитие побегов при этом были намного ниже в контрольном варианте. Это свидетельствует о том, что гнилостные (патогенные) бактерии, находящиеся в песке, подавляют нормальное развитие нежной корневой системы растений. Следовательно, при переходе на промышленную основу производства оздоровленного посадочного материала in vitro нами предложено в разрабатываемую технологию, на этапе перехода растений in vitro в условия in vivo, использовать в качестве субстрата песок стерилизованный марганцовокислым калием + раствор Чеснокова.
При адаптации и выгонке растений in vitro в сосуд-пакетах в поисках оптимальных факторов среды - тепло, свет, влажность, питание - мы пришли к заключению, что условия для растений, находящихся при температуре 25...27 С, освешенности 3000 люкс и относительной влажности воздуха 75 %, являются оптимальными. Такое сочетание температуры воздуха и освещенности способствует активному развитию корневой системы, что, в свою очередь, обеспечивает хороший рост и развитие растений.
Черенкование растений винограда из сосуд-пакетов дает возможность значительно увеличить коэффициент размножения оздоровленных растений in vitro. В этих же целях эффективно использовать субстрат мелкой фракции (двухразовый обжиг) перлита, при котором наилучшие показатели приживаемости растений в условиях in vitro.
Использование регуляторов роста ИМК, ИУК в концентрациях 100 и 200 мг/л активизировало рост корневой системы. Вариант с ИМК (100 мг/л) отличался усиленнным ростом корневой системы и побегов и сокращением периода адаптации. Обработка же гиббереллином в концентрации раствора 25 мг/л стимулировала рост побегов и выход зеленых черенков. Обработка БАП также стимулировала рост надземной и подземной части растения, однако в меньшей степени, чем обработка ПС.
Оптимальным сроком высадки растений винограда, размноженных in vitro и прошедших адаптацию в сосуд-пакетах, в неотапливаемую весеннюю теплицу является первая декада апреля. В этом случае к концу вегетации растения достигают размера стандартных саженцев.