ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ : 16
1.1. Перспективы использования пробиотиков в ветеринарии 16
1.2. Состав и назначение пробиотиков 29
1.3. Критерии отбора микроорганизмов в состав пробиотиков ветеринарного назначения 37
1.4. Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков.. 44
1.5. Пробиотики, выпускаемые биологической промышленностью
1.5.1. Пробиотики из лактобацилл и би ф идо бактерий 61
1.5.2. Пробиотики из других видов бактерий 66
1.6. Конструирование и свойства пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus 73
1.6.1. Культивирование бактерий-компонентов пробиотиков на основе бацилл 83
1.6.2. Стабилизация микробных суспензий и их консервирование 90
1.6.3. Характеристика лекарственных форм пробиотиков 94
1.7. Лечебно-профилактическая эффективность пробиотиков при желудочно-кишечных болезнях животных 102
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 115
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 115
2.1.1. Микроорганизмы 115
2.1.2. Экспериментальные животные 116
2.1.3. Материалы, питательные среды, растворы, реактивы 116
2.1.4. Технологическое оборудование 117
2.1.5. Методы исследований 118
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 131
2.2.1. Сравнительная характеристика биологической активности изолятов бацилл 131
2.2.2. Получение бактерий - компонентов препарата Биод-5 138
2.2.3. Приготовление опытных образцов препарата Биод-5 146
2.2.4. Изучение биологической активности препарата Биод-5 и его компонентов 157
2.2.4.1. Острая и хроническая токсичность препарата Биод-5 157
2.2.4.2. Влияние препарата Биод-5 на физиологические показатели периферической крови животных 159
2.2.4.3. Влияние Биод-5 на микрофлору кишечника животных 160
2.2.4.4. Изучение иммуностимулирующих и адыовантных свойств Биод-5 162
2.2.4.5. Изучение антивирусной активности Биод-5 163
2.2.5. Технология промышленного производства препарата Биод-5 в различных лекарственных формах 165
2.2.5.1. Получение бактериальной суспензии B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformisTnH 11 в биореакторах «БИОР-0,1» и «БИОР-0,25» 165
2.2.5.2. Методы концентрирования нативных культур B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformisTnH 11 194
2.2.5.3. Приготовление жидкой формы препарата Биод-5 203
2.2.5.4. Технология производства сухой формы препарата Биод-5... 209
2.2.5.5. Приготовление таблетированной формы препарата Биод-5 221
2.2.5.6. Исследование стабильности свойств разных форм препарата Биод-5 в процессе хранения 250
2.2.6. Методы контроля препарата Биод-5 256
2.2.7. Лечебно-профилактическая эффективность пробиотика Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях животных 264
2.2.7.1. Результаты применения препарата Биод-5 при желудочно кишечных болезнях сельскохозяйственных животных (телята, поросята, лошади) 265
2.2.7.2. Испытания препарата Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях плотоядных (пушные звери, собаки, кошки) 311
2.2.8. Экономическая эффективность применения пробиотика Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях животных 323
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 325
4. ВЫВОДЫ 336
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 339
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮНАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 340
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 342
ПРИЛОЖЕНИЯ 392
Актуальность темы. Разработка и внедрение в практику ветеринарии новых высокоэффективных препаратов отечественного производства для лечения и профилактики болезней животных представляет собой задачу, актуальность которой не вызывает сомнений.
На основании данных многочисленных источников литературы известно, что в число высокоэффективных лечебно-профилактических средств специи-алисты относят пробиотики (3-6, 21, 33, 59, 126, 132, 163, 269-274, 345, 382, 386,406, 434, 455, 468, 471, 492).
В настоящее время, которое некоторые ученые (352, 358, 456) называют "наступающей эпохой пробиотиков", биопрепараты на основе живых микробных культур широко применяются в медицине и ветеринарии для коррекции микрофлоры ЖКТ.
Vanbelle М. et al (494) отмечает, что только в странах ЕЭС зарегистрированы более 20 различных пробиотиков. Тем не менее, существует потребность в новых биопрепаратах, обусловленная ограниченностью спектра специфической активности известных пробиотиков и разнообразием микроэкологических нарушений нормальной микрофлоры, обусловливающих развитие ЖКБ животных.
Изучение отечественного рынка ветеринарных препаратов показало, что на пробиотики имеется устойчивый спрос. Причем востребованными оказываются препараты в различных лекарственных формах (36, 49, 63, 79, 122, 172,228,250,267,275,283).
Широкое использование в медицине и ветеринарии лактобактерина, би-фидумбактерина, колибактерина, бификола и др. для лечения и профилактики ОКИ и дисбактериозов подтвердило их высокую эффективность и перспективность (11,20,31,35, ПО, 136, 148,259,294,335,380,407,435,471).
Всестороннее изучение бактерий-компонентов пробиотиков выявило у них наличие не только антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, но и ряда других полезных свойств: иммуномодулирующих, антиаллергических, антитоксических, антирадиационных (38, 45, 47, 151, 161, 171, 185, 199, 231, 314, 496).
Использование пробиотиков, до последнего времени, сводилось к заместительной терапии при ОКИ молодняка животных и, в меньшей мере, санации желудочно-кишечного тракта от патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (49, 63. 65, 73, 93, 122, 172, 203, 238, 250, 267, 275, 278, 300, 434, 442, 472). Однако в результате полученных данных о новых свойствах и механизме действия пробиотиков, встал вопрос о расширении областей применения их в ветеринарной практике. Эти препараты можно использовать не только при ЖКБ, но и при респираторных, гинекологических, аллергических, хирургических и других заболеваниях животных. Положительный опыт разностороннего применения пробиотиков уже имеется в медицинской практике (9-11, 14, 34, 38, 43, 45, 67, 89,151, 161, 199, 185, 314).
По мнению большинства специалистов, основополагающим принципом при создании пробиотиков является использование только микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры животных (20, 34, ПО, 198, 294, 329, 335, 407, 459, 468). Но если на этом пути не возникают трудности с отнесением к безусловно нормальной микрофлоре некоторых основных групп микроорганизмов, чаще всего присутствующих в составе микробиоценоза кишечника в больших количествах (например, лакто- и бифидобактерий), то нередко очень по разному трактуется оценка содержания в микробиоценозе меньших по количеству, по не менее важных по физиологической активности некоторых экзогенных бактерий.
Перспективным направлением в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение бактерий рода Bacillus (209-227, 444-447). Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте животных (18, 43, 64, 75, 154, 179, 192-197, 458, 485, 501).
Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются безвредными для организма животных даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении (2, 13-18, 48, 58, 103, 121, 160, 234, 264, 387, 408, 420, 446, 453,481, 492).
Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов. В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих бактерий получены суперпродуценты различных биологически активных веществ (колицин Е2 и др). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с заданными свойствами и использования их новых свойств (15, 60, 116, 169,225, 491).
В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания препарата «Биоспорин», созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного HAH Украины, на основе штаммов B.subtilis BKnM№2335HB.licheniformis ВКПМ№2336 (209-227, 264). Было установлено, что «Биоспорин» более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза ЖКТ (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споро бактерии). На сегодняшний день пробиотик «Биоспорин» выпускается ОАО "Днеп-рофарм" (Украина). Существующая технология имеет ряд недостатков, прежде всего, из-за использования поверхностного способа культивирования бацилл, сопряженного с большими материальными затратами и высокой трудоемкостью. Продолжительность выращивания бацилл при такой технологии составляет 12 суток, а сырье для приготовления питательных сред является дефицитным. Кроме того, данная технология предусматривает производство пробиотиков только в ампулах по 1 или 2 дозы (128, 181, 257, 258).
Ветеринарной практикой востребованы препараты в различных лекарственных формах (жидкой, сухой, гранулированной, таблетированной и др), в зависимости от вида животных и способов их содержания. Однако традиционными лекарственными формами для пробиотиков являются, в основном, лиофильно высушенные препараты в ампулах или флаконах. Такая форма препарата может храниться длительное время. Тем не менее, упаковка про-биотика в ампулы или флаконы является непрактичной и неудобна для применения при групповом содержании животных (46, 208, 218, 256, 261, 265).
Пробиотик в жидкой форме особенно удобен в применении при групповом кормлении животных, например поросят-отъемышей. Его можно смешивать с любым кормом, водой, молоком. Поэтому, актуальным является разработка такого компонентного состава пробиотика, который бы позволил увеличить срок хранения жидкой формы препарата (28, 39, 62, 114, 240-242).
Известный отечественный и зарубежный опыт производства препаратов показывает, что таблетки занимают одно из ведущих мест на рынке фармацевтической продукции. К числу преимуществ таблеточной формы препаратов относятся точность дозирования, компактность, удобность упаковки, простота хранения и транспортировки. Однако пробиотики практически не выпускаются в таблетках по причине высокой инактивации микроорганизмов в процессе получения и хранения препаратов (208, 218, 254, 261, 265).
Безусловно, технология производства таблетированной формы пробиотиков на основе споровых бактерий может быть осуществлена только при высоком содержании зрелых спор в исходной субстанции и должна включать минимальное количество стадий, оказывающих неблагоприятное воздействие на жизнеспособность и биологические свойства бактерий.
Отмеченные выше обстоятельства обосновывают необходимость проведения исследований, направленных на получение и изучение свойств различных форм пробиотиков.
Лечебно-профилактическая эффективность пробиотиков при ЖКБ может достигать 90 % и более (36, 49, 63, 65, 73, 203, 228, 251, 267).
Некоторые авторы указывают, что пробиотики способствуют повышению привесов животных, улучшению усвояемости корма, увеличению яйценоскости кур и др. (93, 122, 172, 205, 238, 250, 275).
Многие отечественные и зарубежные специалисты высказывают мнение, что применение пробиотиков при болезнях животных и человека позволит отказаться от антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов (35, 101,239,260,363,470,478).
Поэтому работы по совершенствованию технологии производства пробиотиков, направленные на создание безотходных технологий и новых лекарственных форм для многих видов животных, являются весьма важными и нужными для ветеринарной науки и практики.
Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - разработка технологии производства пробиотика Биод-5 в различных лекарственных формах и оценка его лечебно-профилактической эффективности при желудочно-кишечных болезнях разных видов животных.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести исследования по выделению культур бацилл от животных и с объектов внешней среды и изучить биологические свойства бацилл, перспективных для разработки пробиотического препарата Биод-5. 2. Приготовить лабораторные образцы пробиотика и изучить его биологические и антагонистические свойства.
3. Разработать промышленную технологию глубинного культивирования производственных штаммов в биореакторах и подобрать наиболее перспективные методы концентрирования бактериальной массы, включенной в состав Биод-5.
4. Решить технологические проблемы приготовления жидкой, сухой и таблетиро ванной форм Биод-5 и определить методы контроля качества препарата.
5. Изучить лечебно-профилактическую эффективность Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях разных видов животных.
6. Рассчитать экономическую эффективность применения Биод-5.
7. Разработать и утвердить нормативную документацию на препарат Биод-5 и внедрить его в ветеринарную практику.
Научная новизна.
1. Впервые, на основе спорообразующих штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, выделенных с объектов животноводческих помещений, сконструирован новый пробиотик Биод-5 для применения в ветеринарии.
2. Теоретически обоснован и разработан метод глубинного культивирования штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 для производства пробиотика Биод-5 с использованием стандартизированных жидких питательных сред из отечественного сырья, позволяющий получить бактериальную суспензию, содержащую не менее 60 % зрелых спор.
3. Созданы промышленные технологии выпуска пробиотика Биод-5 в различных лекарственных формах (сухой, таблетированной и жидкой), с использованием отечественного технологического оборудования и материалов.
4. Разработана жидкая форма пробиотика Биод-5, которая сохраняет биологическую активность не менее 12 месяцев. 5. Разработан состав сухой микробной массы B.subtilis ТПИ 13 и B.licheni-formis ТПИ 11, который включает наполнитель и связующие вещества, что позволяет высушивать биомассу конвективным методом и снизить инактивацию микроорганизмов в процессе получения таблетированной формы препарата Биод-5.
6. Показано, что препарат Биод-5 обладает уникальными биологическими свойствами, отличающими его от других пробиотиков: подавление размножения сальмонелл, кандид и стафилококков; стимуляция роста лактобацилл и бифидобактерий in vitro и в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) животных; иммуностимулирующее и адьювантное действие.
7. Методы контроля качества пробиотика Биод-5 позволяют дать объективную оценку биологической активности бактерий-компонентов препарата и охарактеризовать качество сухой, жидкой и таблетированной форм Биод-5.
8. Показана высокая (96-100 %) лечебно-профилактическая эффективность готовых лекарственных форм пробиотика Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях телят, поросят, лошадей, пушных зверей, собак и кошек.
9. Научная новизна работы подтверждена положительным решением Российского агентства по патентам и товарным знакам по заявке № 2004121854 «Лечебно-профилактический препарат ветеринарного назначения на основе штаммов спорообразующих бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheni-fonnis».
Практическая значимость.
1. Для производства пробиотика Биод-5 селекционированы штаммы В. subtilis ТПИ 13-07.06.21-ДЕП/ВГНКИ и B.Hcheniformis ТПИ 11-07.06.22-ДЕП/ ВГНКИ, которые паспортизированы и депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ).
2. Разработаны и утверждены ТУ 9337-007-59088697-004 на пробиотик Биод-5; промышленный регламент производства пробиотика Биод-5 в сухой, таблетированной и жидкой лекарственных формах; разработано временное наставление по применению пробиотика Биод-5 в ветеринарии,
3. В соответствии с порядком регистрации ветеринарных препаратов в РОССИЙСКОЙ Федерации, нормативная документация и отчеты об испытании пробиотика Биод-5 прошли экспертизу в ФГУ ВГНКИ. Регистрационные испытания (от 06.07.2004 г) подтвердили соответствие показателей качества пробиотика Биод-5 требованиям ТУ.
4. На базе Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (Центр ВТП БЗ НИИМ МО РФ, г. Екатеринбург) создана автоматизированная технологическая линия промышленного производства пробиотика Биод-5. Получены серии сухой, таблетированной и жидкой форм препарата Биод-5, которые прошли производственные испытания.
5. На базе ООО «НПК ЦМВЭИ» (г. Москва) организовано серийное производство пробиотика Биод-5 в различных лекарственных формах.
6. В опытах на телятах, поросятах, лошадях, пушных зверях, собаках и кошках изучен механизм действия Биод-5, дана оценка его влияния на микробиоценоз кишечника, обменные и иммунные процессы организма животных, показана высокая лечебно-профилактическая эффективность препарата, что подтверждено актами, утвержденными руководителями хозяйств и ветеринарных клиник Московской, Свердловской и Нижегородской областей.
7. Разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ (per. № 13-5-02/1043 от 11.05.2004) методические рекомендации «Выделение и идентификация бактерий желудочно-кишечного тракта животных», в которых изложены количественные и качественные методы исследований микрофлоры кишечника животных, позволяющие рационализировать бактериологический анализ с целью прижизненной диагностики ЖКБ и дисбакте-риозов.
8. Результаты исследований по созданию технологии производства пробиотика Биод-5 включены в учебник «Биотехнология» с грифом «Допущено Министерством сельского хозяйства Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальностям 310700-Зоотехния и 310800-Ветеринария» (28.12.2004 г, № 06-1456).
Личный вклад соискателя. Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление исследований по выделению и оценке биологических свойств штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.Iichenifonnis ТПИ 11, испытание лечебно-профилактической эффективности пробиотика Биод-5 при ЖКБ разных видов животных, разработка технологии производства Биод-5 в различных лекарственных формах, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, разработка научно-технической документации на препарат.
В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с:
- Лысенко Н.П. (лаборатория радиобиологии и экологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К. И Скрябина - изучение иммуностимулирующих и адью-вантных свойств препарата Биод-5).
- Лиморенко А.П. (ЦВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ - разработка технологии глубинного культивирования штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformisTnHll);
- Скворцовым А.Э. (ЦВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ - разработка технологии производства сухой и таблетированной форм препарата Биод-5).
Всем соавторам выражаю глубокую благодарность. Особая благодарность ректору ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К. И Скрябина, академику РАСХН, профессору Воронину Е.С. и начальнику научно-исследовательского управления ЦВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ Васильеву П.Г. за помощь в организации производства препарата.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты проведенных исследований были доложены:
- на международных конгрессах: IX и XI международные ветеринарные конгрессы (Москва, 2001, 2003);
- на международных конференциях: международная конференция молодых ученых, посвященная 60-летию Кыргызского СХИ «Проблемы научного обеспечения повышения эффективности сельскохозяйственного производства» (Бишкек, 1992); международная конференция «Животноводство на Европейском Севере: фундаментальные проблемы и перспективы развития» (Петрозаводск, 1996); I международная конференция «Здоровье, разведение и защита мелких домашних животных» (Уфа, 2000); международная научная конференция «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине» (Москва, 2003); международная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Молодые ученые в решении проблем аграрной науки и практики» (Львов, 2003); международная научная конференция «Актуальные проблемы развития животноводства» (Львов, 2003); международная научно-практическая конференция «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов», посвященная 45-летию создания ВНИИВВиМ (Покров, 2003); международная учебно-методическая и научно-практическая конференция, посвященная 85-летию МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (Москва, 2004);
- на научно-практических конференциях: межвузовская конференция молодых ученых и специалистов «Новое в диагностике, лечении и профилактике болезней молодняка сельскохозяйственных животных» (Москва, 1991); научно-практическая конференция «Проблемы диагностики, профилактики и лечения сельскохозяйственных животных в Нечерноземной зоне» (Н.Новгород, 1992); научно-практическая конференция «Достижения ветеринарной науки - производству» (Чебоксары, 1994); научно-практическая конференция «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 54 научные и учебно-методические работы, в том числе 15 статей в научных журналах; 23 тезиса в сборниках конференций; 12 учебно-методических пособий по био 16
технологии и учебная программа по специальности «Биотехнология», утвержденные УМО высших учебных заведений РФ в области ветеринарии и зоотехнии; методические указания по изучению дисциплины «Биотехнология»; методические рекомендации, утвержденные Департаментом ветеринарии; учебник «Биотехнология» для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальностям 310700 - Зоотехния и 310800 - Ветеринария,
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 391 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (499 источников, из которых 286 отечественных и 213 иностранных). Работа содержит 124 таблицы, 52 рисунка, 30 страниц приложений.
На защиту выносятся следующие положения и результаты:
1. Теоретическое и экспериментальное обоснование состава и формы выпуска Биод-5 на основе штаммов В. subtilis ТПИ 13 и В. licheniformis ТПИ 11.
2. Промышленная технология производства пробиотика Биод-5 в сухой, таблетированной и жидкой формах.
3. Результаты изучения лечебно-профилактической эффективности жидкой, сухой и таблетированной форм пробиотика Биод-5 при желудочно кишечных болезнях разных видов животных.
