Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Характеристика бруцеллёза маралов 7
1.2. Роль специфической профилактики в системе противобруцеллёзных мероприятий у животных 16
1.3. Живые противобруцеллёзные вакцины 19
2. Собственные исследования 34
2.1. Материалы и методы исследования 34
3. Результаты исследования 45
3.1. Биологические особенности маралов и система ведения пантового оленеводства 45
3.2. Противоэпизоотическая эффективность вакцины из штамма В. abortus при бруцеллёзе маралов в Алтайском крае 48
3.3. Изучение приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма 75/79-АВ в организме маралов 53
3.4. Изучение иммуногенных свойств вакцины из штамма В. abortus 75/79-АВ, определение оптимальной иммунизирующей дозы 57
3.4.1. Методика эутоназии опытных животных 71
3.5. Изучение сравнительной иммунологической эффективности и антигенных свойств противобруцеллёзных вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ в опыте на маралах 75
3.5.1. Патоморфологические изменения при экспериментальном бруцеллёзе маралов 100
Обсуждение полученных результатов 108
Выводы 119
Практические предложения 121
Библиографический список 122
Приложение 142
- Характеристика бруцеллёза маралов
- Материалы и методы исследования
- Биологические особенности маралов и система ведения пантового оленеводства
Введение к работе
Актуальность темы. Пантовое оленеводство - динамично развивающая отрасль сельского хозяйства, дающая два вида продукции: основную (панты) и побочную (мясо, кровь, хвосты, пенисы, жилы, зародыши), которые, в свою очередь, служат ценным лекарственным сырьем, применяемым в восточной и отечественной медицине для лечения различных заболеваний. Существенным сдерживающим фактором её развития являются инфекционные заболевания, одно из которых - бруцеллёз.
Бруцеллёз сельскохозяйственных животных является распространённой . инфекционной болезнью, поражающей животных всех видов и представляющей серьёзную угрозу здоровью людей.
Уже давно стало очевидным, что успешная борьба с этой зооантропоноз-ной инфекцией в широких масштабах практически невозможна без использования средств специфической профилактики (Косилов И.А., 1985, 1992; Шумилов К.В., 1987; Салмаков К.М., 1975, 1987; Димов С.К., 1993 и др.). Необходимость их применения особо возрастает в связи с изменениями, происходящими в агропромышленном комплексе нашей страны: расформирование колхозов, совхозов, создание акционерных обществ, фермерских хозяйств, расширение и увеличение крестьянских подворий.
Существуют различные типы противобруцеллёзных вакцин, но наибольший интерес вызвали живые вакцины из штаммов В. abortus 19 и 82. В настоящее время как на крупном рогатом скоте, так и на маралах используется вакцина из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82. Указанная вакцина обладает достаточно высоким уровнем иммуногенности и противоэпизоотической эффективности, однако имеет и ряд недостатков, связанных, прежде всего, с нестабильностью её биологических свойств, а также абортогенностью (Димов С.К., 1993; Климанов А.И. с соавт., 1983; Новицкий А.А., 1988; Ощепков В.Г., 1998). Результаты применения этой вакцины на маралах свидетельствуют о ещё
4 одной негативной стороне — длительном сохранении поствакцинальных реакций (от 12-18 месяцев и до 5 лет после иммунизации).
Таким образом, очевидна необходимость поиска новых, современных противобруцеллёзных вакцин. Одной из таких вакцин является вакцина из штамма В. abortus 75/79-АВ, которая была селекционирована и комплексно изучена И.П. Никифоровым (1996) на крупном рогатом скоте.
Апробация данной вакцины в производственных условиях показала, что её применение в общем комплексе противобруцеллёзных мероприятий позволяет резко ослабить напряженность эпизоотического процесса в течение 6-8 месяцев и добиться ликвидации очагов бруцеллёза крупного рогатого скота в более короткие сроки. Кроме того, вакцина не абортогенна, популяция микробных клеток однородна, угасание серологических реакций наступает через 2-3 месяца после иммунизации.
Все это позволяет считать работу с этой вакциной весьма перспективной, а её испытание на маралах - актуальным.
Цель исследований - изучить основные свойства вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-АВ на маралах.
Для выполнения указанной цели в задачи исследования входило:
Изучение эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов в Алтайском крае и противоэпизоотической эффективности вакцины из штамма В. abortus 82.
Изучение приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма 75/79-АВ в организме маралов.
Изучение иммуногенных свойств вакцины из штамма В. abortus 75/79-АВ на маралах, отработка оптимальной иммунизирующей дозы.
Изучение сравнительной иммунологической эффективности и анти-
генных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ в опыте на маралах. Научная новизна. Впервые на маралах изучены приживаемость, возможность миграции, а также иммуногенные свойства вакцины из штамма 75/79-АВ,
5 при этом определена оптимальная иммунизирующая доза. Проведена сравнительная оценка иммуногенных и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ на маралах; отработана методика эутоназии маралов миорелаксантом «Адилин-супер».
Практическая значимость. В ходе проведённых исследований разработаны рекомендации «Диагностика, профилактика и меры борьбы с бруцеллёзом маралов» (2005), утвержденные учёным советом ВНИИПО (протокол № 1 от 11 февраля 2005 г.), и рекомендованы к внедрению научно-техническим советом управления ветеринарии администрации Алтайского края (протокол № 2 от 18 марта 2005 г.).
Апробация работы. Результаты исследований доложены, обсуждены и одобрены на научно-практической конференции молодых учёных «Вопросы пантового оленеводства и болезней сельскохозяйственных животных» (г. Барнаул, 2003); региональной научной студенческой конференции «Достижения и перспективы студенческой науки в АПК» (г. Барнаул, 2003); Международной научно-практической конференции молодых учёных СО РАСХН «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учёных» (Новосибирская область, п. Краснообск, 2004); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирская область, ГНЦ ВБ «Вектор», 2004), учёных советах ВНИИ пантового оленеводства (2001-2004) и научно-техническом совете управления ветеринарии администрации Алтайского края (2005).
Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации отражены в 7 научных работах. Научные исследования, изложенные в диссертации, являются составной частью научных проблем Всероссийского научно-исследовательского института пантового оленеводства, тема № 02.01.01.
Выносятся на защиту:
1. Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов в Алтайском
крае и противоэпизоотической эффективности вакцины из штамма Brucella
abortus 82.
2. Приживаемость и возможность миграции вакцинного штамма
Brucella abortus 75/79-АВ в организме маралов.
3. Определение иммуногенных свойств вакцины из штамма Brucella abor
tus 75/79-АВ, изыскание оптимальной иммунизирующей дозы для маралов.
4. Определение сравнительной иммунологической эффективности и антигенных свойств вакцин из штаммов Brucella abortus 82 и Brucella abortus 75/79-АВ на маралах.
Характеристика бруцеллёза маралов
Бруцеллёз маралов - хроническая инфекционная болезнь, проявляющаяся часто абортами, задержанием последа, расстройством воспроизводительной функции животных. Инфекция от животных может передаваться человеку (Лу-ницын В.Г., 1998,2004).
Из пантовых оленей к бруцеллёзу восприимчивы только маралы (Третяк Н.Т., Хорьков И.А., 1978), особенно маралухи и маралушки в возрасте половой зрелости (Третяк Н.Т., 1984). Проявление инфекции наблюдается чаще в виде спорадических случаев, возможны и эпизоотические вспышки при отсутствии соответствующего ветеринарного контроля.
Клиническая картина заболевания в виде бурситов, артритов, абортов наблюдается очень редко (Третяк Н.Т., 1984). По данным Н.Т. Третяка (1985) из 5262 обследованных маралов лишь 9 голов были с поражениями суставов и 8 голов с баланопоститами. В другом сообщении (1981) автор утверждает, что клиническую форму бруцеллёза он наблюдал у 47 естественно больных маралов (у 37 - бурситы, 2 - орхиты, 7 - артриты, 1 - тендениты и тендовагиниты). Поскольку территория парка занимает несколько десятков гектаров, покрытых лесом и кустарником, и маралухи во время отёла прячутся в высокой густой траве, наблюдать аборты в естественных условиях практически невозможно. В эксперименте же они наступают на 6-8-м месяце беременности (Третяк Н.Т., 1972).
Первоначально заболевание у маралов диагностировалили по серологическим реакциям: реакции агглютинации (РА) и реакции связывания комплимента (РСК). Об этом свидетельствуют исследования А.Ф. Пинигина с соавторами (1966), которые из 524 маралов в 3 хозяйствах Горного Алтая выявили реагирующих в РА - 22,6% и РСК - 10%. В последующем Н.Т. Третяк (1971) из 260 рогачей карагайской фермы совхоза «Абайский» выявил в РА - 21 реагирующее животное, в РА с кольцевым антигеном - 14, а в РСК — 20. За период с 1969 по 1973 гг. в совхозе «Абайский» среди разных половозрастных групп было выявлено 1,13% реагирующих в серологических тестах животных (Третяк Н.Т., 1981). По другим данным Н.Т. Третяка (1972), в 1970-1971 гг. на бруцеллёз в совхозе «Абайский» исследовано в РА и РСК 997 рогачей и 593 маралухи. Из них реагировало 147 голов (14,7%) рогачей, а маралух - 202 головы (34,06%).
Общий процент реагирующих маралов составил 21,9.
На других фермах, за период с 1969 по 1971 гг., совхозов «Амурский» и «Чергинский» исследовано 697 маралов, из которых 147 голов (21,1%) реагировали в РСК и 93 (13%) - в РА. На «Таллинской» маралоферме из исследованных 611 маралух и 487 маралов-рогачей реагировали соответственно 44 (7,2%) и 130 (2,69%) животных. На ферме «Курдюм» реагировали маралята после отбивки. Процент серопозитивных в разные годы колебался от 3,06 до 7,9.
Выделение культуры бруцелл из биоматериала является наиболее достоверным свидетельством наличия инфекции. Впервые это удалось сделать О.В. Постричевой в 1963 г., от реагирующих в серологических тестах маралов. Несколькими годами позже М.М. Ременцовой и другими исследователями (1969) были выделены бруцеллы вида Brucella suis, а Н.Т. Третяк (1971) при исследовании биоматериала от 4 маралов (лимфатические узлы, печень, селезёнка) изолировал возбудитель бычьего вида - Brucella abortus, 6-го биотипа. У диких маралов при бактериологическом исследовании материала, бруцеллёз не обнаружен (Пинигин А.Ф., 1971).
Возбудитель бруцеллёза маралов (Brucella abortus) полиморфен, встречаются кокковые, овоидные и палочковидные формы (0,6 х 1,5 х 0,5-0,7 мкм). Бруцеллы неподвижны, хорошо красятся анилиновыми красками, грамотрица-тельны. Лучший рост наблюдается на печоночных средах с добавлением глицерина и глюкозы (Ml И11 ГА, МППГГБ). По характеру роста на плотных средах различают S - типичные, гладкие, R - шероховатые и М - слизистые варианты ш колоний. Возможна их трансформация в L-формы (Третяк Н.Т., 1972, 1996;
Луницын В.Г., 1998,2004).
Устойчивость бруцелл к физико-химическим факторам невысокая. Так, Н.Т. Третяком (1972) было установлено, что при температуре 60С они погибают за 30 мин, при 70С - за 5-10 мин, а при 90-100С - моментально. Быстро погибают в гниющем материале, прямые солнечные лучи убивают их за 3-4 часа, растворы креолина, фенола (1%-ные) - за 1 час, 5%-ная свежегашеная известь — за 2 часа. В почве, навозе, воде, грубых кормах возбудитель сохраняется до 4-5 месяцев.
Источником болезни являются больные бруцеллёзом животные, которые выделяют возбудитель во внешнюю среду с мочой, калом, околоплодными водами, плодными оболочками, истечениями из половых органов, абортированными плодами. Особенно опасны животные в период выраженного клинического проявления болезни. Кроме того, источником инфекции для маралов может быть больной бруцеллёзом крупный рогатый скот, но ведущими факторами всё же остаются предметы ухода за животными, водоисточники, корма, почва и т.д. Маралята, как правило, заражаются бруцеллёзом алиментарно; взрослые алиментарно и контактно половым путём через слизистую оболочку и кожу. Особенно важен у маралов половой путь передачи инфекции из-за своеобразия гона, когда больной рогач может заразить весь гарем - 15-20 маток (Третяк Н.Т., 1982).
Бруцеллёз на маральник может быть занесён при бесконтрольном обмене высокопродуктивными рогачами, а также при контакте маралов с больным крупным рогатым скотом у изгородей. На отдельных маралофермах инфекция регистрируется по причине их строительства на месте бруцеллёзных изоляторов крупного рогатого скота (Третяк Н.Т. и др., 1975).
Материалы и методы исследования
Работа выполнялась с 2001 по 2005 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте пантового оленеводства, на кафедре эпизоотологии и ВСЭ ИВМ АГАУ, а также в мараловодческих хозяйствах Алтайского края.
Биологические особенности маралов и систему ведения отрасли мы описывали, руководствуясь работами B.C. Галкина, В.Н. Егеря, И.И. Миронова, П.В. Митюшова, а также основываясь на собственных наблюдениях.
Материалом для изучения и анализа эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов послужили архивные данные годовой ветеринарной отчётности Алтайского края за период с 1969 по 2003 гг. При этом выясняли количество неблагополучных по данной инфекции пунктов, число исследованных и реагирующих в серологических тестах (РА, РСК) животных, вынужденно убитых и иммунизированных противобруцеллёзными вакцинами маралов.
Для изучения приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма В. abortus 75/79-АВ в ОПХ «Новоталицкое» было взято 20 маралух 4-5-летнего возраста, раннее не вакцинированных никакими противобруцеллёзными вакцинами. Всех животных забирковали индивидуальными новозеландскими бирками и сформировали 2 группы: в I группе - 15 животных (опытные), во II группе — 5 (контрольные).
Перед закладкой опыта всех животных исследовали в реакции агглютинации (РА) и реакции связывания комплемента (РСК). Их постановка и учёт регламентированы действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).
Взятие крови и получение сыворотки для серологических исследований (РА, РСК) проводили следующим образом: животных фиксировали в панторезном станке (при содержании в виварии ВНИИПО в специальном расколе) и с правой стороны шеи в области яремной вены выстригали шерсть, накладывали жгут, место укола дезинфицировали 70 -ным раствором спирта (фото 1). Взятие крови осуществляли кровобрательной иглой Боброва А-26х4017И52. Пробы крови отбирали в бактериологические пробирки по 10-15 мл. Для получения сыворотки их помещали в термостат на 3 часа при температуре 37С, после ретракции сгусток осаждали центрифугированием (1000-1500 об/мин). Сыворотку сливали и исследовали в течение 10 дней свежую либо замораживали, сохраняя в таком виде непосредственно до проведения серодиагностики.
Животных опытной и контрольной групп содержали совместно на протяжении всего опыта (4 месяца). Кормление маралух осуществлялось по типовым рационам, в который входило (из расчета на 1 голову): сена - 6-7 кг, силоса -5-6 кг, концентратов - 0,5 кг, соли - 15-18 г. Общая питательность суточного рациона составила 3,9-4,2 к. ед., что удовлетворяет потребностям для данной возрастной группы. Источником питьевой воды в зимнике служил ручей. Иммунизацию маралух опытной группы проводили комиссионно, в панторезном станке. Вакцину из штамма В. abortus 75/79-АВ вводили подкожно, в область средней трети шеи, в дозе 50 млрд м.к., в объёме 5 мл. Разводили данный препарат в стерильном остуженном физиологическом растворе (0,85%-ный) из расчета одна доза для крупного рогатого скота в 10 мл растворителя. Шерсть на месте инъекции предварительно выстригали ножницами, а кожу обрабатывали 70 спиртом.
Динамику появления и угасания серологических реакций изучали, исследуя сыворотку крови в РА и РСК с единым бруцеллёзным биофабричным S- и R(ovis)-aHTHreHOM (изготовленный 15.01.2003 г. НПФ «Биоцентр», г. Омск, серия 1, контроль 1, срок годности 12 месяцев).
Сыворотку крови исследовали на 15, 33, 55, 89 и 122 день после иммунизации. В каждый срок, после забора крови, проводили убой 4 маралух (3 из опытной и 1 из контрольной групп) с последующим отбором биоматериала и бактериологическим исследованием. От каждого животного были взяты следующие органы: парные лимфатические узлы (подчелюстные, заглоточные, околоушные, предлопаточные, паховые, надвыменные, бронхиальные, тазовые, мезентериальные, парааортальные), непарные (средостенный и портальный), а также печень и селезёнка.
Биологические особенности маралов и система ведения пантового оленеводства
Пантовое оленеводство как отрасль занимается разведением двух видов оленей - марала и пятнистого оленя. Основной товарной продукцией являются панты (неокостеневшие рога). Наряду с этим от пантовых оленей получают побочную продукцию: мясо, сухожилия, хвосты, пенисы, плоды, кровь, являющиеся сырьем для изготовления лекарственных препаратов.
Разработка и практическая реализация эффективных мер профилактики и борьбы с любой инфекционной болезнью основывается не только на изучении всех аспектов заболевания, но и знаниях биологии и системы ведения отрасли.
Прежде чем приступить к изложению материала по бруцеллезу маралов, считаем необходимым кратко изложить биологические особенности и систему ведения данной отрасли, что важно для проявления данного заболевания у этого вида парнокопытных, подбора методик для экспериментальных исследований, разработки мер профилактики и борьбы с инфекцией.
Ферма, где содержатся маралы, представляет собой пастбище, огороженное сетчатой изгородью высотой не менее 2,5 м. На каждого марала приходиться 1,5 га. Вся территория фермы поделена на участки (сады) для содержания маралов по половозрастным группам: рогачи, матки, молодняк.
История одомашнивания пантовых олений насчитывает свыше 150 лет, в то же время поведение этих животных мало чем отличается от диких. Для них характерен дикий нрав, стадность, повышенная нервная возбудимость, сезонные биологические ритмы.
В зимний период, во время кормления, к животным можно подойти не ближе 10-20 м, а в летний - 50-100 м, так как они отвыкают от людей, выпасаясь на обширных территориях парков. Исходя из этого, специалистам очень трудно оказать какую-либо ветеринарную помощь. Все ветеринарные манипуляции с маралами проводят в специальном пан торезном станке. В результате чего малоприемлемы такие клинические исследования, как термометрия, аускультация, перкуссия и другие, потому что после фиксации, вследствие сопротивления и испуга, истинная картина исследования меняется.
Учитывая повышенную нервную возбудимость и пугливость пантовых оленей, связанную с рефлексами самозащиты, работа с ними требует спокойного и методического обращения. При испуге маралы всем стадом убегают, а если это происходит в тесном загоне, они могут бросаться на препятствие, что приводит к травматизму и гибели животных.
Марал - наиболее крупный из всех оленей. Высота в холке составляет 150-155 см, живой вес самцов — 250-380 кг, самок — 200-280 кг. Дважды в год благородные олени линяют - в апреле-июне и конце августа. У хорошо упитанных здоровых животных линька проходит за 3-4 недели.
Гон у маралов начинается с середины сентября и продолжается до середины октября. Рогачи в это время отбивают себе гаремы по 5-15 самок. За обладание ими быки ведут ожесточённую борьбу, теряя при этом до 20% живой массы. В конце октября-середине ноября рогачей отсортировывают, поскольку если этого не сделать, случка затягивается, что приводит к позднему покрытию самок и рождению слабого, нежизнеспособного приплода.
Беременность маралух составляет 8-8,5 месяцев, а отел проходит с мая по июнь. Подсосный период у телят длится 8-10 месяцев. Уже на второй день после отела теленка трудно поймать, а на 7-е сутки он не отстаёт от матери. В летний период наблюдается наибольший рост молодняка, а зимой он замедляется, что связано с сезонными биологическими ритмами. Половая зрелость у оленей наступает в возрасте 2 лет.
В мараловодстве принято следующее деление животных по половозрастным группам: маралята (приплод текущего года до 6 месяцев), сайки и саюшки (животные от 6 месяцев до 1,5 лет), перворожки и маралушки (от 16 месяцев до 2 лет), рогачи и маралухи (старше 2,5 лет).
Рога у пантовых оленей имеют только самцы. В период роста их называют пантами. Рост и ежегодная смена рогов происходит следующим образом: на границе лобных и теменных костей в 8-9 месяцев у телят появляются костные бугорки, а к началу 2-го года жизни у них обнаруживаются костные отростки высотой 6-8 см (у маралов). В возрасте 13-14 месяцев кожа на пеньках утончается, бугорки начинают расти в виде мягкого, хрящеобразного отростка, покрытого бархатистой шерстью. Эти стержни (первые рога) в течение 2-3 месяцев достигают 40-50 см (у маралов), а затем окостеневают, кожа осенью счищается. Первые рога называют шпильками, а животных — сайками. Границу между стаканом (пеньком) и шпилькой называют коронкой. Летом на 3-м году жизни в мае-июне шпильки спадают с костного стакана, и вырастает пант. Полное развитие рога заканчивается к началу сентября, т.е. к началу гона. Рост пантов длится 75-90 дней с момента сброса коронок. Вес и максимальная продуктивность пантов увеличивается у животных с 7 до 10 лет, затем идет их снижение. Первыми сбрасывают коронки и наращивают панты более взрослые высокопродуктивные животные. Срезка пантов в большинстве случаев влечет за собой прекращения роста рога, но иногда вырастает «отава» (вторые рога).
Технология ведения пантового оленеводства сложилась с учетом биологических особенностей животных. В пастбищный период (с мая по октябрь) пантовые олени содержатся в парках, и основным кормом для них является трава. Для предотвращения вытравливания пастбищ применяют пастбищеобо-рот. В ноябре, после гона, стадо ставят на зимнее содержание, что во многом зависит от погодных условий. В это время животных сортируют, пересчитывают, отбивают молодняк. Рогачей и телят маралов ставят в зимники с естественными водопоями, кормушками для сена и концентратов (огороженная площадка не мене 500 м2). Кормят маралов-рогачей с учетом сезонных изменений и биологических циклов, которые условно можно разделить на три периода: 1-й — подготовка к гону (август-первая половина сентября); 2-й — осенняя жи ровка после гона (вторая половина октября-декабрь); 3-й - выращивание пантов (март-май).
Панты после срезки консервируют комбинированным способом, сочетающим в себе варку в горячей воде (98С), жаровую (70-80С) и ветровую сушки. Процесс консервирования зависит от величины панта и равен в среднем 25-45 дням. У маралов вес пары сырых пантов составляет 6,5-9 кг, но отдельные рекордсмены дают до 15-20 кг и более.
В связи с перечисленными особенностями и биологическими циклами маралов разработка мер профилактики и борьбы с бруцеллезом у этого вида животных должна быть приурочена к системе ведения отрасли.
