Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Проблема выбора критериев микотоксикологического контроля 10
1.2 Состояние и перспективы развития аналитической методологии 29
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
2.1 Материалы и методы исследования 39
2.2 Токсинообразующий потенциал грибов рода Fusarium Link 50
2.2.1 Компонентный состав токсичных метаболитов 50
2.2.1.1 F.graminearum Schw 50
2.2.1.2 F.poae (Peck) Wr 67
2.2.1.3 F.sporotrichioides Sherb 68
2.2.1.4 F.avenaceum (Corda ex Fr.) Sacc 68
2.2.2 Характеристика географически локализованных популяций 74
2.2.2.1 F.graminearum Schw 74
2.2.2.2 F.poae (Peck) Wr 80
2.2.2.3 F.sporotrichioides Sherb 84
2.2.2.4 F.avenaceum (Corda ex Fr.) Sacc 90
2.2.2.5 F.acuminatum Ell.et Ev 90
2.2.2.6 F.culmorum (W.G.Smith) Sacc 91
2.2.2.7 F.equiseti Corda (Sacc.) 92
2.2.2.8 F.moniliforme Sheld. и его подвиды 94
2.3 Микотоксины в объектах ветеринарно-санитарного и экологического надзора 99
2.3.1 Зерно по территориям возделывания 99
2.3.1.1 Фузариотоксины 99
2.3.1.2 Охратоксин А 116
2.3.2 Корма для промышленного животноводства 123
2.3.2.1 Зерно кукурузы 123
2.3.2.2 Жмыхи и шроты 125
2.3.2.3 Комбинированные корма 127
2.4 Методы микотоксикологического анализа 131
2.4.1 Хроматографическое определение 8-оксотрихотеценов 131
2.4.1.1 Способы пробоподготовки 131
2.4.1.2 Тонкослойная хроматография - флуориметрия 135
2.4.1.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография 139
2.4.1.4 Хромато-масс-спектрометрический анализ 142
2.4.2 Методы на основе иммуноферментного анализа 148
2.4.2.1 Способы пробоподготовки 148
2.4.2.2 Аналитические характеристики 157
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 166
4 ВЫВОДЫ 173
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 175
6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 177
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 178
Введение к работе
Диссертация является итогом научно-исследовательской работы, выполненной в период с 1985 по 2004 гг. в лаборатории микотоксикологии Государственного научного учреждения
«Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственных наук в соответствии с государственными планами фундаментальных НИР (№№ гос. per. 01.86.0 112582, 01.9.60 012296, 01.9.80 002037,01.2.00 103315).
Актуальность темы. В группе природных соединений, обладающих токсическим действием на организм человека и животных, особое место принадлежит метаболитам несовершенных микроскопических грибов - микотоксинам. Способность токсигенных грибов поражать посевы всех видов сельскохозяйственных растений и активно развиваться на агропродукции после уборки и в период хранения, возможность трансмиссии микотоксинов в органы и ткани продуктивных животных, а также высокие уровни их токсичности, опасные и разнообразные формы ее проявления, придают этой проблеме чрезвычайную значимость.
Микотоксикология в прошлом столетии совершила стремительный взлет от первых описаний клинических признаков отравлений, вызванных плеснеобразующими грибами, до разносторонних фундаментальных исследований токсиногенеза грибов, химического строения, механизмов биосинтеза и физиологического действия микотоксинов. Наиболее важным достижением этого периода стало выяснение причин возникновения таких острых и хронических интоксикаций человека и животных как эрготизм, акабаби-токсикоз, болезнь «желтого риса», алиментарная токсическая алейкия, балканская эндемическая нефропатия и многие другие.
Последние десятилетия прошедшего века были отмечены общим ухудшением микотоксикологическои ситуации в мире. Вредоносные грибные заболевания зерновых культур стали все чаще приобретать характер обширных и затяжных эпифитотий (Канада, США, 1980-82 гг.; СССР, 1985-89 гг.). Произошли массовые отравления людей фузариозным зерном (Индия, 1987 г., Китай, 1989, 1991 и 1993 гг.), в странах Африки и Юго-Восточной Азии были выявлены новые очаги распространения онкологических заболеваний микогенной этиологии, во многих странах наблюдалось возрастание числа регистрируемых случаев микотоксикозов животных, были описаны новые формы фузариотоксикозов (лейкоэнцефаломалация лошадей, отек легких у свиней).
Прогнозы распространения микогенных заболеваний растений были также неблагоприятными в связи с возрастающим уровнем антропогенных воздействий на состояние биоценозов и смещением экологического равновесия. В этих условиях стала очевидной необходимость кардинального изменения прежней тенденции развития микотоксикологическои науки и ее переориентации от исследований post factum на поиск приемов упреждающего контроля агропродукции и кормов. Новое направление нуждалось в проведении масштабных национальных проектов, призванных определить приоритетные критерии обеспечения безопасности кормов и продовольствия в рамках сложившейся структуры агро- и кормопроизводства.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы стало создание системы микотоксикологического контроля зернопродукции и кормов в Российской Федерации на основе научно-обоснованного выбора приоритетных критериев их безопасности и разработки эффективных аналитических приемов обнаружения, идентификации и количественного определения.
В соответствии с поставленной целью нами решались следующие задачи:
- изучение токсинообразующего потенциала основных возбудителей фузариоза зерновых культур;
- исследование распространенности микотоксинов в зерне по территориям его возделывания;
- обследование санитарного состояния кормов в промышленном животноводстве;
- разработка методологии микотоксикологического анализа для наиболее значимых объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора.
Научная новизна работы. Создано новое направление микотоксикологических исследований по оценке последствий фузариозного поражения зерновых культур, основанное на изучении особенностей токсиногенеза отдельных изолятов и популяций возбудителей. В ходе масштабного изучения микотоксикологической ситуации впервые в стране осуществлен научно-обоснованный выбор основных критериев контроля агропродукции и кормов. Разработаны новые методы идентификации и количественного определения микотоксинов с применением спектрального, хроматографического и иммуноферментного анализа. Получены новые сведения относительно биогенеза и состава токсичных метаболитов грибов рода Fusarium, установлено строение группы ранее неизвестных природных соединений.
Практическая значимость. Работа относится к фундаментальным исследованиям в области микотоксикологии и имеет социальное и народнохозяйственное значение. Полученные результаты нашли отражение в 12 методических рекомендациях и наставлениях по организации и обеспечению микотоксикологического контроля, утвержденных Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ, ГУП ГАП СССР, отделением ветеринарной медицины РАСХН и Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ:
1. «Методические рекомендации по количественному анализу дезоксиниваленола (вомитоксина) в фуражном зерне с применением капиллярной газожидкостной хроматографии», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.
2. «Методические рекомендации по количественному определению афлатоксинов Gi, G2, Вь В2 в кормах методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии под давлением», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.
3. «Методические рекомендации по препаративному получению афлатоксинов с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии под давлением», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.
4. «Методические указания по организации микотоксикологического контроля фузариозного зерна и продуктов его переработки фуражного назначения», утв. ГУВ ГАП СССР 10.10.88 г.
5. «Методические рекомендации по количественному определению дезоксиниваленола в зерне с применением обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии», утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1995 г.
6. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения Т-2 токсина «Т-2 токсин - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0514;
7. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения зеараленона «Зеараленон - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0515;
8. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения охратоксина А «Охратоксин А - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0516;
9. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения фумонизина Bi «Фумонизин Ві - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0519;
10. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения афлатоксина В і «Афлатоксин В і - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0520;
11. «Временное наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения роридина А «Роридин А - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0517;
12. «Временное наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения стеригматоцистина «Стеригматоцистин - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0518.
Материалы диссертации использованы на лекциях и семинарах в системе повышения квалификации специалистов государственной ветеринарной службы и животноводческих предприятий.
Апробация результатов исследований. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международном симпозиуме по азот-содержащим микотоксинам (Пущино, 1991 г.), годичном общем собрании отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 1995 г.), Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (Москва, 1999 г.), научной сессии Россельхозакадемии (Москва, 2002 г.), Первом съезде микологов России (Москва, 2002 г.), Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003, 2004 гг.), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВСГЭ в 1985-2004 гг.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 75 статей и тезисов докладов в отечественных и зарубежных изданиях, 5 методических указаний и рекомендаций.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Особенности токсинообразования видов Fusarium graminearum, F. роае, F.sporotrichioides и F.avenaceum на зерновых субстратах.
2. Токсигенный потенциал географических популяций доминирующих возбудителей фузариоза колоса и прогнозирование состояния контаминации зерна по территориям возделывания.
3. Характер распространенности фузариотоксинов и охратоксина А в зерне колосовых культур.
4. Приоритетные критерии микотоксикологического контроля основных видов кормового сырья и кормов.
5. Методы количественного определения 8-оксотрихотеценов на основе тонкослойной хроматографии - флуориметрии, газовой и обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.
6. Унифицированный прием экспрессного иммуноанализа микотоксинов в зернопродукции и кормах.
7. Хроматографические и спектральные методы анализа и идентификации фузариотоксинов в мицелиально-зерновой биомассе грибов.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка сокращений и библиографического списка, включающего 468 источников, из которых 54 опубликованы в отечественных и 414 - в зарубежных изданиях. Работа иллюстрирована 55 таблицами и 18 рисунками.
Проблема выбора критериев микотоксикологического контроля
Так, в США с учетом данных по токсинообразованию фитопатогенных грибов и грибов, связанных с отравлениями животных [134, 269, 438, 439], было проведено изучение загрязненности основных видов возделываемых культур - кукурузы [174, 385], пшеницы [155, 191, 365, 366], сои [365] и сорго [261, 364]. Были организованы первые длительные ряды наблюдений за состоянием зерна пшеницы и кукурузы [367, 454] и изучено распространение микотоксинов в зернофураже и кормах на отдельных территориях [101, 132]. У изолятов A. fumigatus и Р. crustosum из кукурузы, вызвавшей интоксикацию скота, были выявлены треморгеновые микотоксины [146]. Регистрация 8 случаев афлатоксикоза скота в штате Айова в 1983-85 гг. подтвердила необходимость контроля кормов на загрязненность афлатоксинами [131].
В Канаде для грибов рода Aspergillus из состава микофлоры зерна и агропродукции была установлена способность продуцировать охратоксины, цитринин и стеригматоцистин [195, 358] и затем изучена загрязненность кормов этими микотоксинами в провинции Онтарио [169] и в Западной Канаде [66, 311, 312]. Для группы изолятов вида F.graminearum, интенсивно поражающего зерновые культуры в провинции Онтарио, была выявлена способность продуцировать трихотецены и зеараленон [184, 286-288], изучен характер распространенности 4-дезоксиниваленола в зерне пшеницы [353, 356, 420] и установлено влияние погодных условий на контаминацию кукурузного зерна зеараленоном [394].
В Японии по результатам токсикологической оценки грибов рода Aspergillus [458] была изучена частота встречаемости афлатоксинов, охратоксинов и цитринина в агропродукции [220, 285, 406]. Вместе с исследованиями распространенности грибов рода Fusarium, продуцирующих зеараленон [201] и трихотецены [419], на ячмене и пшенице, а также описанием основных хемотипов вида F.graminearum, образующего трихотецены и зеараленон [200], была дана оценка контаминации трихотеценами возделываемого зерна [419].
В Польше было проведено подробное изучение токсинообразующих свойств фузариев, поражающих зерно пшеницы, ячменя, ржи, кукурузы и кормовое сырье [113, 115, 119, 123, 124, 252], а также встречаемости токсинов в зерне колосовых культур [137] и в кормах [215, 381]. В Италии была показана способность фузариев из состава микофлоры колосовых культур продуцировать зеараленон, трихотецены и монилиформин [94, 97, 100] и выявлен характер распространенности зеараленона в зерне [95].
Практика исследований в этих странах показала, что экспериментальная оценка токсигенного потенциала грибов позволяет прогнозировать характер загрязненности объектов и может служить основой для организации мониторинговых исследований. Такой вывод был вполне обоснованным, поскольку работы были проведены в географически удаленных районах мира, где микотоксикологические ситуации, являющиеся отражением взаимодействия токсигенных грибов со всеми участниками биоценозов при влиянии факторов внешней среды, имели специфические черты. Последующее применение этого подхода во многих других европейских странах - Австрии [93, 96], Великобритании [105], Венгрии [346], Германии [153, 254, 453], Греции [430], Финляндии [270, 419], Франции [419], Чехословакии [435,436], Швеции [342], Югославии [419], а также в странах Центральной и Латинской Америки - Венесуэле [202], Мексике [78], Чили [408], Азии - Индии [291, 318, 326], Индонезии [176], Китае (о. Тайвань) [111,419], Корее [219, 329], Африки - Египте [60], Нигерии [150], ЮАР [255, 315, 413, 421] и в Австралии [92] подтвердило его перспективность.
F.graminearum Schw
F.graminearum Schw. По данным предварительного ТСХ анализа типовые изоляты этого вида (табл. 1.1) показали способность продуцировать ДОН (№№ 44/2, 253 и 579), НИВ (№№ 15/2 и 82/3), а также ЗЕН, 5-ААФ и ФУЗ. Для подробного изучения компонентного состава 8-оксотрихотеценов группы ДОН была использована биомасса изолята № 579, способ выделения индивидуальных соединений из которой представлен на рис. 2. После ЖХ очищенного экстракта на силикагеле в градиентной ПФ, состоящей из бензола и 10%-ных добавок ацетона, были получены три фракции, каждую из которых далее подвергали разделению ЖХ на силикагеле или ВЭЖХ на обращеннофазовом сорбенте Lichrosorb RP-8.
Из фракции 1 после ЖХ в градиентной ПФ гексан-этилацетат были выделены два вещества, которые имели значения хроматографический подвижности 0,15 и 0,26 при ТСХ в ПФ гексан-этилацетат (1:3) и образовывали флуоресцирующие в УФ комплексные соединения с хлористым алюминием. После дополнительной очистки методом ВЭЖХ они были получены в виде бесцветных пленок и далее охарактеризованы по совокупности физико-химических характеристик как З-ацетокси-7,15-диокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-он (3-ацетил-ДОН, 3-Ац-ДОН) и 15-ацетокси-3,7-диокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-он (15-ацетил-ДОН, 15-Ац-ДОН) (рис. 3).
Совпадение данных ИК-, УФ-спектров и аналогии в !Н-ЯМР, 13С-ЯМР и масс-спектрах указывали на идентичность их строения с различием по расположению одной ацетоксильной группы. Для 3-Ац-ДОН (Rf = 0,15) получили [a]22D +22,2 (с 0,3; метанол), ИК-спектр (KBг, у макс., см"1): 3450 (ОН), 1744 (-0-С=0), 1684 (С=С-С=0); УФ-спектр (метанол, X макс., нм): 220 (є 5746); МС (ЭУ) (m/z, интенсивность, % от максимального): 338 (100), Н-ЯМР (CDC13, 8, м.д.) 2,20 (ЗН, СН3СО); ТМС-эфир: МС (ХИ) ПИ (NH3): 500 (100) MNH4+, 483 (18) МН+. Для 15-Ац-ДОН (Rf = 0,26) получили [a]22D +25,6 (с 0,3; метанол), ИК-спектр (КВг, у макс., см"1): 3480 (ОН), 1742 (-0-С=0), 1684 (С=С-С=0); УФ-спектр (метанол, X, маКс., нм): 217 (є 5407); МС (ЭУ) (m/z, интенсивность, % от максимального): 338 (100), !Н-ЯМР (CDC13, 5, м. д.): 1,95 (ЗН, СН3СО); ТМС-эфир: МС (ХИ) ПИ (NH3): 500 (8) MNH4+, 483(100) МН+.
Комбинированные корма
В качестве подготовительной процедуры для выполнения ТСХ и ВЭЖХ была выбрана общая схема, состоящая в извлечении 8-оксотрихотеценов из образцов смесью ацетонитрила и воды в объемном соотношении 6:1 и последующей очистке экстракта на колонке, заполненной окисью алюминия и активированнным углем [334].
В серии лабораторных экспериментов было изучено влияние объемно-весового соотношения экстракционной смеси и образца и условий выполнения экстракции (кратковременное интенсивное перемешивание, длительное умеренное встряхивание и стационарный режим с кратковременным перемешиванием в начале и в конце). Наиболее целесообразным был признан прием, состоящий в добавлении экстрагента к навескам образцов зерна, жмыхов, шротов, комбикормов в 5-кратном объемном избытке, к навескам образцов соломы и половы - в 10-кратном. Наилучшее извлечение в обоих случаях достигалось путем комбинирования интенсивного встряхивания в начале и в конце процедуры с промежуточным стационарным выдерживанием в течение 14-16 ч.
Эксперименты по оптимизации условий очистки экстрактов включали выбор адсорбентов среди активированных углей ОУА, АГ-3 и диатомитовых носителей Celite-535 (0,18-0,25 мм), Celite-545 (0,25-0,40 мм) (FERAK, Германия), Порохром 1М (0,25-0,315 мм), Цветосил М-Л (0,25-0,315 мм), Цветохром 1кМ (0,46-0,63 мм) и Цветохром МО (0,46-0,63 мм) производства НПО ММП Армянской ССР. Далее проводили подбор их композиций, способов внесения адсорбентов в колонку, а также количеств и скорости потока элюента.
Наиболее эффективная очистка достигалась на колонке, заполненной в нижнем слое 1,2 г смеси мелкодисперсной (менее 0,08 мм) фракции активированного угля марки АГ-3 и диатомита Порохром-1М (0,250-0,315 мм) в объемном соотношении 1:1 и в верхнем - 4,0 г окиси алюминия нейтральной. После фильтрования 20 мл порций экстрактов при разряжении 90 тыс. Па и затем пропускания через колонку 20 мл смеси для экстракции, занимающего 14-16 мин, объединенные элюаты высушивали в вакууме на роторном испарителе при 50С. Сухие остатки очищенных экстрактов зерна, жмыхов, шротов и комбикормов далее могли быть использованы для анализа. Сухие остатки экстрактов соломы и половы после растворения в 2 мл воды было необходимо фильтровать через мини-колонку SEP-PAK Qg и затем элюировать 8-оксотрихотецены 2 мл смеси метанол-вода в объемном соотношении (3:7). В этих условиях степень извлечения ДОН составила 98±4%, его моноацетатов - 97±4%.
Для разработки суммарного метода определения этих соединений были изучена возможность исчерпывающего гидролиза 3-Ац-ДОН и 15 Ац-ДОН при обработке растворами аммиака и КОН в смеси метанол-вода в соотношении 9:1. Степень гидролиза 15-Ац-ДОН для всех концентраций аммиака и в 0,01 н. растворе КОН оказалась существенно выше, чем 3-Ац-ДОН, что и следовало ожидать из-за присутствия в молекуле ОН-группы при С7, сближенной с ацетильной группой при Ci5 (рис. 13).
