Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Зависимость иммуногенных свойств дерматофитозных вакцин от количества в них иммуногенных клеток
1.2. Влияние состава питательной среды на рост ы развитие культур
1.3. Влияние различных добавок в питательные среды на рост и спорогенез культур дерматофитов
Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Морфологические особенности культур дерматофитов рода Trichophyton, выращенных на сусло-агаре, изготовленном на различных сортах неохмеленного пивного сусла 3.5
3.2. Определение количества белка в партиях неохмеленного пивного сусла 47.
3.3. Определение аминокислотного состава в партиях неохмеленного пивного сусла 45
3.4. Влияние добавок в сусло-агар на рост и спорогенезкультур рода Trichophyton
3,5- Влияние на вирулентность культур рода Trichophyton добавок в сусло-агар
3.6. Проверка иммуногенной активности вакцин, изготовленных из культур рода Trichophyton, выращенных на сусло-агаре с различными добавками
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ .
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ **..
ПРИЛОЖЕНИЕ 9.0..
- Зависимость иммуногенных свойств дерматофитозных вакцин от количества в них иммуногенных клеток
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- Определение количества белка в партиях неохмеленного пивного сусла
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Трихофития (стригущий лишай) являлась одной из наиболее распространенных в конце 60-х — начале 70-х инфекций среди животных как в нашей стране, так и за рубежом. Это заболевание из-за большого распространения изучалось многие годы, и научными, а также практическими специалистами было предложено большое количество медикаментозных средств терапии и методов специфической профилактики. Однако их применение не приводило к существенному снижению заболеваемости животных от этой инфекции.
Работами сотрудников лаборатории антибиотиков и микологии ВИЭВ под руководством академика РАСХН (1967-1971) А.Х.Саркисова впервые в мире были созданы высокоэффективные средства специфической профилактики (препарат ТФ-130 и вакцина ЛТФ-130) для иммунизации крупного рогатого скота против трихофитии, что позволило оздоровить от этой инфекции абсолютное большинство хозяйств страны. В последующие годы сотрудниками ВИЭВ и ВГНКИ были предложены и внедрены в практику еще ряд биопрепаратов против трихофитии других видов животных, а также биопрепараты, введение которых предохраняло от заболевания трихофитией разные виды животных.
Работами, проведенными рядом авторов (И.И.Жарков, 1977, Z-Hussin, 1983), было установлено, что во всех противотрихофитийных вакцинах элементы грибов рода Trichophyton — микроконвдии являются основными носителями иммуногенных свойств данных биопрепратов Другие элементы, в т.ч, и вегетативная форма культур — Мицелий, обладают слабой иммуногенной активностью и не обеспечивают формирование напряженного иммунитета- А это не предохраняет животных от последующего заражения вирулентной культурой возбудителя трихофитии.
Согласно требованиям,действующих ь настоящее время КГДна проти вотрихофити иные вакцины, необходимо, чтобы Б профилактических целях животному внутримышечно было введено не менее 20 млн/смЗ гомогеншой взвеси иммуногенной культуры гриба рода Trichophyton, Для получения такой грибной суспензии надо, чтобы в исходном п^огенате (И3 которого и изготавливается биопрепарат против "грихофитии) концентрация микроконидий находилась в пределах 250-320 млн/смЗ. Таким образом, для изготовления проти^отрихофитийных вакцин используются высокоспорулирующие куПЬТуры рода Trichophyton. В практике это достигается двумя путями: путем последовательной постоянной сел%кции производственных штаммов грибов рода Trichophyton, а, также Путем изыскания питательной среды, на которой штаммы рода Trichophyton образуют большое количество МИКрОКОНИдИй.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ
Цель:
Изыскать условия повышения спорообразования вакцинных штаммов дерматофитов на питательных средах различного состава
Задачи:
1. Изучить в сравнительном аспекте культурально- .ьА^рфагст^уешде г^пйстда .цєуьштафмтов рсдэ Trichophyton прииспользовании для культивирования различных сортов пивного сусла.
Определить влияние на хара*стер роста и спорогенеза культур рода Trichophyton экспериментальных питательных сред с добавлением мальтозы.
Исследовать и оценить вирулентность культур рода Trichophyton, выращенных на экспериментальных питательных средах.
Изучить и дать сравнительную оценку стммуногенной активности микросерий вакцин, изготовленных из культур рода Trichophyton, выращенных на экспериментальных питательных средах.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проведены с использованием вакцинных и музейных штаммов Trichophyton verrucosum и Trichophyton mentagrophytes, полученных в лаборатории микологии и антибиотиков ВИЭВ. Определение аминокислотного состава различных сортов пивного сусла проводилось по общепринятым методикам, также использовано прямое заражение животных.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Изучен аминокислотный и белковый состав различных партий неохмеленного пивного сусла.
Установлена зависимость роста и спорообразования культур рода Trichophyton от аминокислотного состава неохмеленного пивного сусла, используемого для изготовления основной питательной среды — сусло-агара.
Установлено, что добавление мальтозы в различных концентрациях в сусло-агар способствует повышению процесса спорообразования вакцинных штаммов рода Trichophyton, при сохранении иммуногенной активности.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Полученные данные позволяют определить степень влияния состава питательных сред на рост и развитие культур дерматофитов рода Trichophyton. Это является необходимым обоснованием для выбора питательных сред, повышающих продуктивность вакцинных штаммов культивируемых в условиях предприятий биологической промышленности и лабораторий.
Это также дает возможность направленной селекционной работы по отбору перспективных штаммов для конструирования новых вакцин,
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Анализ аминокислотного состава различных сортов неохмеленного пивного сусла, используемого для приготовления сусло-агара,
Влияние аминокислотного состава различных сортов неохмеленного пивного сусла на культурально-морфологическиє свойства грибов рода Trichophyton.
3. Применение раствора мальтозы для повышения спорообразования культур рода Trichophyton.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы исследований по диссертационной работе доложены на межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ и на заседании Ученого Совета ВИЭВ.
ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
По теме диссертации опубликовано 2 научных статьи.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация изложена на 90 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результат собственных исследований, обсуждение полученных результатов, библиографический список литературы, приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 9 таблицами, Ї7 рисунками. Библиографический список литературы включает 88 источников, из них 37 иностранных,
Зависимость иммуногенных свойств дерматофитозных вакцин от количества в них иммуногенных клеток
AJ.Knigm (1976) в течение 7 дней пр0ращиВал на роговом слое кожи человека (в питательной среде) г,ри различных показателях температуры и влажности культуры ви а Тг. mentaproghytes Этим автором было установлено, что наибольший рост культур наблюдался при температуре выращивания 27 - 33 ос и оптимальной влажности 97%, хотя е0 время культивирования влажность колебалась в пределах 95 - $з%.
E.Kisielewska, S.Bujak (1977) изучали воздействие разных температур и значения рИ на гвдроли3 ксилана культуральными жидкостями пяти культур низших грибов для определения их целлюлозолитической активности. В ви е естественного субстрата использовали солому и кукурузные початки. В результате было установлено, что грибы обладали наибольшей активностью при температуре +40оСт а при более высокой температуре, особенно выше 60ос, их активность снижалась или прекращалась. Наибольшая активность у большинства грибов при гидролизе ксилана наблюдалась при рН 5,0 - 5,5, кроме культур рода Fusarium, у которых оптимум рН для действия ксиланолитических ферментов был 6,8. Н.П.Блинов (1965) в результате проведенных исследований установил, что микробные полисахариды определяют антигенную специфичность патогенных грибов. Этим автором установлено, что грибные полисахариды обладают способностью повышать резистентность тканей макроорганизмов к отдельным инфекциям.
Согласно данным Б.Б.Исмаиловой (1988), на пробирках с сусло-агаром с рН 3,7 и 7,0 - 8,8, засеянных культурами Тг. equinum и Тг. mentagrophytes, наблюдались плоские сероватые колонии со слабо развитым воздушным мицелием, тогда как при рН этой среды 4,3 - 6,5 морфология колоний была типичной для изучавшихся штаммов. У этого же автора процесс спорообразования на этой питательной среде наблюдался при рН 4,3 - 6,5. На сильно кислых (4,0) и щелочных (Ц6 ) средах у этих культур наблюдалось угнетение процесса образования микроконидий. МТШарманов, Н.П.Головина (1982) установили, что на питательной среде при сдвиге рН в кислую сторону в культуре Тг. verrucosum лучше сохраняется жизнеспособность микроконидий. Критическим у них в опытах было рН 6,6, а дальнейшее его повышение угнетало образование микроконидий, процент погибших спор особенно резко увеличивался при рН, равном 7,7. При рН 9Р18 практически все споры культуры Тг. verrucosum, выделенной от крупного рогатого скота, погибали. В то же самое время микроконидий в культурЄі выделенной от овец с клиникой трихофитии, были более устойчивы к изменению рН питательной среды, а отдельные обйывки мицелия сохраняли способность расти даже при значении рИ 9,18 -12,6, Z.S. Conrales, Т C.Bolivar (1983) предлагают в качестве простой питательной среды для культивирования дерматофитов водококосовый агар. Otcenasek (1968), j.c.Blackemore (1971) и H.F.Carroll (1974) - эту же питательную среду для диагностики дерматофитозов животных,
Дерматофиты, как и большинство грибов, могут расти и размножаться в широком диапазоне температур. Оптимальной для этих промессов является температура ъ пределах 25 - ЗЗоС. Они чувствительны к повышению температуры окружающей среды, но хорошо переносят замораживание (Э.Фейер и др., 1956, В.М.Лещенко, 1982). К.П.Летягиным и ТН.Мохиной (1984) установлено, что процесс образования микроконидий у дерматофитов Тг. mentagrophytes, Тг equinum, М. canis, М. gypseurn в интервале температур от 4 до юос не только не прекращался, но и значительно возрастал, хотя и имелись видовые различия в его интенсивности. Эти авторы утверждают на основании своих исследований, что обильное спорообразование у Тг. verrucosum при снижении жизнеспособности микроконидий является защитной мерой, которая способствует сохранению вида в природе. Полученные данные показывают, что образование микроконидий у дерматофитов в ответ на экстремальные условия внешней среды интенсифицируются, хотя количество нежизнеспособных спор в этом случае возрастает. Это объясняется, по-видимому, как и у других дерматофитов, механизмом генетического контроля образования таких структур, как споры бесполого происхождения, обеспечивающие им высокую степень приспособляемости к резко изменяющимся условиям внешней среды. Такого же мнения придерживаются и В.М.Шевцова, АГ.Касьяненко (1982), K.V.ShinhT S.CApavol (1982). которые отмечают, что температурный оптимум для прорастания микроконидий у культуры Tr. equinum 28оС. Скорость этого процесса замедляется как при понижении температуры до 22 -25оС, так и при повышении до 30 -35оС, а при 40оС этот процесс прекращается. В научной литературе (T.G.Zeithona, J.J.Stock, 1969) имеются данные, что повышение температуры до 370С стимулирует прорастание макроконидий- При температуре 37оС дерматофиты более интенсивно защелачивают среду по сравнению с 24оС (M.H.Paveia, 1975). Таким образом, ряд исследователей установили влияние температуры на стабильность культурально - морфологических признаков дерматофитов.
Также из литературы известно, что длительные пересевы на авизированных питательных средах приводят к интенсивности спорообразования, пигментообразования, а также к изменению некоторых биохимических свойств (НДНовиков, Э.С.Лебедь, 1980).
Б.Б.Исмаилова (1988) после многочисленных опытов, используя штаммы Тг. equinum и Тг. mentagrophytes, высевая их на пробирки с сусло-агаром, агаром Сабуро, среды Григораки, МПА, МПГ А и Чапека, установила, что наибольшее спорообразование
культур дерматофитов регистрировалось на сусло-агаре. Также этим автором установлено, что Повышение температуры отрицательно сказывается на процессе образования микроконидий, и, чем выше температура, тем меньше образование спор. Кроме того, установлено, что образование микроконидий зависело от кратности пересевов, в процессе которых оно может, как повышаться, так и понижаться. Автор установил, что в процессе пересевов образование макр эконидий в определенной степени снижалось, причем наиболее резко это наблюдалось у штаммов Тг equinum.
К.А.Цысина (1974) приравнивает картофельный агар по его свойствам к сусло-агару. Согласно данным КПТоловиной, Л,Г,Ивановой (1983), штаммы Тг. verrucqsum хорошо развиваются на сусловой и обогащенной картофельной среде. Агар Сабуро, в том числе обогащенный, не обеспечивает оптимального роста данного вида. Штаммы Jr. mentagrophyfes, Тг. ajelloi, М. gypseum одинаково растут на сусловой среде, картофельном агаре с обильным образованием макро- и ми роконидий. Обогащенная среда Сабуро является наиболее благоприятной для накопления биомассы грибов, относящихся к видам Тг, ajelloi, М. canisP М. gypseum. В.Н.Шатик (1964) установил, что подходящими питательными средами для выращивания 21-дневных культур грибов рода Miaosporum с наиболее обильной биомассой и спороношением являются суспо-агар и среда Поллачи по сравнению с средой Аелло с витамином, агаром Сабуро с глюкозой, средой Чапека, синтетической средой, предложенной Л.Н.Кашкиным. J J,Murray (1968), определяя способность патогенных (в основном дерматофитов) грибов усваивать аминокислоты, витамины и другие вещества на глкэкозо-пептонном агаре, с помощью биохимических тестов предложил схему их дифференциации. Было выяснено, что дерматофиты гидролизировали казеин, тирозин, желатин. Также им было установлено, что дерматофиты, в отличие от многих других грибов, способны повышать рН среды.
T.Chattway, J.Barloun (1961) показали, что штаммы Тг menfegroprVes не содержат аспаргиноЕ 0й кислоты, а Гг. rubrum, М. canis, Е. troccosum, наоборот, содержат эту кислоту. Было выяснено, что у этих грибов имеются различия в содержании стерола и эргостерола.
M.Palyusik (1980) установил, что на аг-ape Омита культуры вида Тг. verrucosum на 3 - 4 день образовывали небольшие колонии, которые в сипу массового образование артроспор к 5 - 7 дню идентифицировались. Эту среду автор предлагает для быстрой культивации данного гриба. D.Haack (1987) также предложил питательную среду для исследований кожных соскобов на наличие дерматофитов у лошадей. J.C.BIackemore (1971) предложил свою тест-среду для дифференциальной диаі-ностики дерматофитов от других микроорганизмов как грибного, так и бактериального происхождения. Так, в процессе роста культур М. canis, М. gypseum, Тг mentagrophytes среда окрашивалась в ярко-красный цвет, а грибы рода Aspergillus и PeniciHium окрашивали эту среду в желтый цвет. При посеве бактериальных культур среда окрашивалась в ярко-красный цвет, но рост наблюдался в виде слизистой пленки, тогда как культуры дерматофитов на этой среде росли в виде пушистых колоний.
J.Crzywniewicz с соавторами (1989) проверяли протеолитическую активность ферментов культур Тг. gallinae и Тг. verrucosus Эти авторы определили, что энзиматическая активность у испытуемых культур Тг. verrucosum увеличивалась увеличением количества грибной массы и образовывала протеазу быстро, независимо от источников углерода и азота. У культур Тг gallinae энзиматическая активность зависела от состава гїитатепьной среды. На питательной среде, содержащей перья и волосы (единственный источник углерода и азота), наблюдалось повышение протеолитической активности этих культур. Проявление протеолитической активности исследуемых штаммов имело прямую связь с патогенностью штаммов Тг. verrucosum и секретировало энзимы в ростковую питательную среду в присутствии субстрата, из которого легко ассимилировать глюкозу и пептон. Эти авторы считают, что сильная энзиматическая активность экстрэцелпюлярного типа протеаз дерматофитов имеет большое влияние на степень и глубину проникновения в кожу и подкожную ткань хозяина. Глубокое проникновение гриба в ткани вызывает обширные очаги некроза и быстрое распространение возбудителя.
T.Noguchi, Y.Banno и др. {1975) определяли таксономический характер углеводного состава на 13 видах дерматофитов и проводили анализ на нейтральные сахара с помощью метода жидкостной хроматографии. Было выяснено, что нейтральные сахарные компоненты клеточной стенку дерматофитов содержат маннозу и глюкозу в соотношении 1:2,7 ля Epidermophyton и 1:1,4 для Microsporunr У культур Tr, verrucosum эти соотношения были 1,6:1 и 3,8:1, как и культур вида Tr. rnentagrophytes, Для этих целей для исследований все культуры дерматофитов выращивали на жидком агаре Сабуро (4% глюкозы, 1% полтпептона, 0,5% дрожжевого экстракта) в термостате при температуре 28оСг А.П.Кашкин и Ю.И.Воеводин (1976) установили, что в результате длительного выращивания Tr. rnentagrophytes в культуральной жидкости не накапливается значительных количеств протеолитических ферментов. Ферменты Tr. rnentagrophytes оказались чувствительными к органическим растворителям, которые вызывают обратную денатурацию.
Л.Я.Телишевская с соавторами (1983) установили, что для большинства культур вида Тг. verrucosum наиболее благоприятным являлся рН сусло-агара, равный 6,0 - 6,5 при концентрации Сахаров равной 7,6+0,45%. Эти авторы утверждают, что для обильного роста культуры Тг verrucosum, по-видимому, желательно наличие комплекса аминокислот, хотя незаменимыми могут быть несколько из них. Было установлено, что для культур Tr. rnentagrophytes необходимы три аминокислоты: глутаминовая, аспарагиновая и серии. Однако лучший рост достигается при дополнительном внесении ароматических аминокислот. Полное потребление аминокислот может свидетельствовать о том, что они являются лимитирующим фактором при культивировании этого гриба, а количество фосфорных соединений в сусло-агаре, по-видимому, достаточно для жизнедеятельности культуры Тг. rnentagrophytes. Этими же авторами были подтверждены данные, что в сусло-агаре имеется большое количество углеводов (7,6%), и они угвериедают, что эта питательная среда по содержанию азотистых соединений сравнима с экстративными мясными питательными средами и хараю-еризуется высоким содержанием пролина.
По данным указанных авторов, гриб "П\ verrucosum при росте на сусло-агаре потребляет 2% Сахаров, все аминокислоты и некоторое количество фосфора. На основании своих данных они предполагают, что при создании новой питательной среды для грибов должен быть предусмотрен некоторый избыток аминокислот, более 2% углеводов, а фосфора - не менее 10 мгУ%,
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для работы использовались взятые из музея лаборатории микологии и антибиотиков Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ) штаммы культур Trichophyton verrucosum № 130 и Trichophyton mentagrophytes № 135, используемые в настоящее время для изготовления вакцин против трихофитии животных, и музейные культуры Тг verrucosum № 4ю и Тг. mentagrophytes № 210, В качестве питательной среды использовались сусло-агар, приготовленный из различных партий неохмеленного пивного сусла, и агар Сабуро. Партии неохмеленного пивного сусла, полученные с Трехгорного и Хамовнического пивоваренных заводов, предназначались для приготовления следующих сортов пива: "Жигулевское" ("Ячменный колос"), "Московское", "Хамовническое". Согласно стандартам изготовления вышеперечисленных сортов пива, записанным в НД, технологии приготовления неохмеленного пивного сусла для определенного сорта пива отлича-ются: по времени ферментации проростков ячменя и по времени окончания варки пивного сусла. Так, время варки пивного сусла так называемых "светлых" сортов пива, таких. как "Жигулевское" и "Ячменный колос", несколько короче (менее 20 часов), чем длительность варки "темных" сортов пива, таких, как "Хамовническое" и "Московское". Вследствие увеличения времени варки в свежеприготовленном неохмеленном пивном сусле
происходит разрушение некоторых ингредиентов, благодаря чему на более поздних технологических стадах приготовления пива к суслу добавляют новые ингредиенты, которые придают различный вкус разным сортам пива,
Полученное неохмеленное пивное сусло разливали по матровым колбам и стерилизовали при о5 ат в течение 45 мин. Для исследований на аминокислотном Анализаторе отбирали по 200 смЗ неохмеленного пивного сусла от каждой партии. Оставшееся количество пивного сус а использовали для приготовления партий сусло-агара. Д я этого неохмеленное пивное сусло разбавляли водопроводной водой до 7 % содержания Сахаров, по Баллингу устанавливали нужный рН добавлением 10%-ного раствора бикарбоната натрия и добавляли 2 % агар-агара. После растворения агар9 среду стерилизовали и разливали по матровым колбам и пробиркам, стерилизовали в автоклаве 30 минут под давлением 0,5 тм. После стерилизации рН сусло-агара - 6,3 - 6,5.
Агар Сабуро готовили по принятсій методике", на 1 литр дистиллированной воды пептона - 10 г, глюкозы - 40 г, агара - 20 г. Пептон и агар вносили в воду до расплавления агара, добавляли сахар, устанавливали нужный рН - 5,7 - бд после чего разливали в стерильную посуду и стерилизовали зо мин при 1120С. Для исследования на аминокислотном анализаторе готовили жидкую среду Сабуро без добавления агара.
Культуры вида Trichophyton verrucos m выращивались при Т 260 - 20 - 21 день, а культуры Trichophyton mentagrophytes выращивались при Т 260 , 14 - 15 дней. После окончания выращивания проводилось снятие микологическим крючком или
Грибная суспензия в зависимости от густоты разводилась физиологическим раствором до 1 : ю - 1 : 15. Подсчет микроконидий проводился в камере Горяева. Опыты проводились в 3 - 5-кратной повторносте
Проверка жизнеспособности грибных клеток в разведенных грибных суспензиях после подсчета концентрации микроконидий проводилась путем высева серийных разведений на чашки Петри с сусло-агаром. Подсчет выросших колоний и подведение результатов опыта проводили на 7 - 8 сутки культивирования посевов в термостате при температуре 26 + 280С.
В качестве добавки, повышающей спорогенез культур дерматофитов рода Trichophyton, нами был выбран, согласно предварительным литературным данным, раствор мальтозы в концентрации 1%, 3 %, 9 %. Опыты проводились в пятикратной повторное. Раствор мальтозы различной концентрации добавляли в емкости с полуфабрикатом суспо-агара (т.е. на 100 смЗ питательной среды добавляли 1 г, з г, 5 г и 9 г х.ч, порошка мальтозы). Сусло-агар после добавления раствора мальтозы разливался по матровым колбам и пробиркам и стерилизовался при 0,5 атм 40 мин, скашивался и на следующий день засевался испытуемыми культурами (0,3 смЗ грибной суспензии в пробирки и 8-9 смЗ - в матровые колбы). После выращивания в термостате при температуре 26оС в течение 15-21 дня в пробирки заливали по 5 смЗ? в матровые колбы - по 50 смЗ стерильного физиологического раствора, грибную культуру снимали микологический крючком (скребком). Полученную грибную суспензию в стерильных условиях переливали во флаконы. Для
подсчета концентрации микроконидий в камере Горяева и проверки жизнеспособности грибных клеток используемая грибная суспензия разводилась 1 : 10 или 1 : 15 в зависимости от густоты суспензии. Подсчет концентрации Микроконидий проводился согласно действующим в настоящее врЄМя НД для вакцин против дерматом икозов животных. Для проверки жизнеспособности грибных клеток грибную суспензию разводили до 10-5 и засевали по 0Г5 смЗ в каждую из 6 чашек Петр . подведение результатов опыта проводили на 7 - В сутки со дня засева грибной суспензии. Проверка вирулентности отобранных культур Тг. veirucosum № 130 и Тг mentagrophytes № 135 проводили на кроликах в НЭЛ ВГНКИ "Манихино". Были отобраны три группы кроликов, по три головы в каждой (две опытные и одна контрольная). Две группы кроликов экспериментально заражали культурами Тг verrucosum № 130 и Tr. mentagrophytes № 135, Которые выращивались на питательной среде с добавлением раствора мальтозы. Контрольная группа кроликов заражатись культурами, которые выращивали на пробирках с сусло-.агаром без добавления раствора мальтозы. Грибные суспензии в концентрации 1 млн/смЗ втирали в выстриженный скарифицированный дезинфицированный 70о спиртом участсж КОжи диаметром 2 х 2 см в области спины. Для получения бі; лее четкой клинической картины в первый день опыта на кроликов одевали картонные ошейники, которые на второй день сни али. Клинический осмотр животных начинали проводить на 5 день после экспериментального заражения, потог через каждые 5 дней. Начиная с 15 дня после экспериментального заражения и до окончания опыта (на 30 - 35 день) по пе клинического осмотра животных отбирали патологический материал с мест поражения. Патологический материал микроскоп Провали и высевали на пробирки с мясопептонным глицериновом агаром (МПҐА) и сусло-агаром для получения ретрокультуры.
Проверка иммуногенной активности использованных культур Тг. verrucosum № 130 и Тг. mentagrophyt s № 135 осуществляли на телятах 2 - 5-месячного возраста, принадлежащих ОПХ ТСХА "Михайловское" Подольского района Московской области.
Культуры выращивали в матровых колбах на сусло-агаре. Были изготовлены две опытные (в сусло-агар добавляли 0,5 % мальтозы) и две контрольные (сусло-агар без добавок) минисерии вакцины. Телят иммунизировали дважды с интервалом 14 дней определенной минисерией препарата nt 1 смЗ внутримышечно в область крупа. Спустя 14 дней, после ревакцинации, проводили клинический осмотр животных для Определения реакции на введение антигена. Через 28 дней посл ревакцинации произвели экспериментальное заражение всех телят двух опытных и двух контрольных групп 21-дневными вирулентными культурами Тг. verrucosum № 130 и Тг. mentagrophytes № 135. На обработанный 700 спиртом выстриженный скарифицированный участок кожи в области шеи наносили грибную суспензию в концентрации 1 млн/смЗ. С 5 по 28 - 30 день через ка ые 2-3 дня проводили клинический осмотр животных четырех групп. Для подтверждения диагноза от животных, проявивших клинику трихофитии, отбирали патологический материал (корни и волоски), который микроскопировали и высевали на пробирки с МПГА и сусло-агаром для выделения ретрокультур. Результаты проведенной работы после заключительного осмотра телят опытных и контрольных групп были отражены в комиссионном акте, составленном совместно с представителями вегслужбы хозяйства.
Определение белкового и амінокислотного состава в неохмеленном пивном сусле проводили во Всероссийском научно исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии. Определение белка в растворе биурет0ВыМ методом. Белок в растворе определяли биуретовым методом, описанным в методических рекомендациях в нашей модификации. Для этого в емкость объемом 10 мл, снабженную магнитом, вводили 1 мл пробы и 9 мл. биуретовои смеси (для стандарта навеску 5,78 мг растворяли в 5 мл биуретового раствора). В стандартную и холостую пробы вводили по 0,5 мл диализата, полученного при диализе образцов относительно водіу. Диализат вводили для уравнения фона.
Определение количества белка в партиях неохмеленного пивного сусла
При проверке аминокислотного состава нескольких партий неохмеленного пивного сусла, используемого, для изготовления сортов пива Жигулевское 1, "Хамовнич&ское" и "Московское", на аи кошслогколгг анализаторе с помощью ионообменной хроматографии, было установлено, что концентрация аминокислот в этих партиях колебалась от 0,002 до 1,143 г/100 г. При этом максимум приходился на долю глутаминовой кислоты и пролина, а минимум - на серосодержащие аминокислоты: цистин и метионин. В жидкой питательной среде Сабуро количество глутаминовой кислоты и пролина было немного меньшим. Так, в пивном сусле, используемом для изготовления пива "Жигулевское", глутаминовой кислоты 1т143, а в жидкой питательной среде Сабуро-1,107. Соответственно, в т.н. "Жигулевском" пивном сусле содержание пролина - 0,789 г/100 г, а в среде Сабуро - 0,568 г/100 г. Содержание цистеина, наоборот, в жидком питательной среде Сабуро было выше, чем в неохмеленном пивном сусле, -соответственно 0,108 и 0,74 г/100 г. Содержание метионина в обоих питательных средах было практически одинаковым. На наш взгляд, повышенное содержание в неохмеленном пивном сусле глутаминовой кислоты и лейцина объясняется наличием ячменного белка - глютелина, богатого глутаминовой кислотой и лейцином. Высокое содержание пролина свидетельствует о наличии ячменного пролаиина - гордеина, а также продуктов его распада. При анализе полученных результатов после проверки трех вариантов неохмеленного пивного сусла на анализаторе аминокислот отмечено, что содержание аминокислот в партиях пивного сусла, используемого для изготовления пива "Жигулевское", было выше, чем в неохмеленном пивном сусле, используемом для изготовления пива "Московское". Такт в пивном сусле, используемом для изготовления пива "Жигулевское", аспаргиновая кислота составляла 0,519 г/100 г, глутаминовая -1,143 г/100 г, пролин - 0,789 г/100 г. В то же время в неохмепенном пивном сусле, используемом для изготовления пива "Московское", эти показатели были равны соответственно 0,45, 0,934 и 0,578 г/100 г, В жидкой питательной среде Сабуро регистрировали 0,592 г/100 г аспаргиновой кислоты, что немногим выше, нежели в неохмеленном пивном суслег используемом для пива Жигулевское". В наших опытах в жидкой среде Сабуро глутаминовой кислоты и пролина было менее 0,107 г/100 г, чем в неохмеленном пивном сусле, используемом для изготовления пива Жигулевское".
При проверке на аминокислотном анализаторе состава аминокислот в партии сусло-агара, изготовленного из уже прошедшего аминокислотный анализ неохмеленного пивного сусла, наблюдалось снижение содержания всех аминокислот. Так, в пивном сусле, используемом для изготовления пива "Жигулевское", количество аспаргиновой кислоты равнялось 0,519 г/100 г, а в сусло-агаре, приготовленном из этого неохмеленного пивного сусла, этот показатель был равен 0,306 г/100 г.
Соответственно в сусло-агаре глугаминовой кислоты регистрировалось 0,840 г/100 г, а в исходной партии пивного сусла - 1, 143 г/100 г. Количество пролину в пивном сусле было зарегистрировано как 0,789, а в сусло-агаре, изготовленном из этого сусла, - 0,40 г/100 г. В результате проведения сравнительных опытов по добавлению в партии с сусло-агаром 1 %, з % и 9 % раствора мальтозы и культивировании на этих вариантах питательной среды культур Trichophyton verrucosus № 130 и Trichophyton mentagrophytes № 135 было установлено, что наибольшее влияние на рост и спорогенез культур оказывает 3 %-ный раствор мальтозы. Так, при визуальной оценке р )ст культур на 4 - 5 день у Tr. verrucosum № 130 и на 3 - 4 день у Т rrrentagrophytes № 135 в виде белых пушистых колоний, которыь быстро покрывали всю поверхность скоса в пробирке. На контрольной среде (сусло-агаре) и на сусло-агаре с добавлением 1 % раствора мальтозы рост Тг. verrucosum № 130 наблюдается с 9 . 10 дня; Trichophyton mentagrophytes № 135 - с 7 - 8 дня. На с сло-агаре с добавлением 9 % раствора мальтозы начало роста отМЄчалось на 11 -12 день, поверхность косяка покрывалась медпенц0ь
При микроскопии культур отмечалосЬі что на опытной среде с добавлением 3 % мальтозы единичные микроконидии обнаруживались на 6 - 7 день у Тг. verrucosum № 130 и на 4 - 5 день у Tr. mentagrophyles № 135. Свободные оторвавшиеся от веточек мицелия микроконидии (т.е. форменные элементы, характеризующие готовность данной культуры для изготовления стандартного препарата) регистрировались в достаточном количестве (более 60 - 70 % от всего количества этих элементов, выросших на веточках) на 18 - 19 сутки выращивания у Тг. verrucosum № 130 и на 11-12 сутки уТг. mentagrophytes № 135. На сусло-агаре без добавления мальтозы и с добавлением 1 % раствора эти показатели были равны образованию единичных микроконидий на 8 -10 день у Тг verrucosum № 130 и на 7 - 8 день уТг. mentagrophytes № 135. Достаточное количество микроконидий образовывалось на 19-21 деньу Тг. verrucosum и на 13-15 день у Тг. mentagrophytes. При проверке концентрации микроконидий и жизнеспособности грибных клеток в образцах грибных суспензий, полученных из культур Тг, verrucosum № 130 на 21 день роста и Тг. mentagrophytes № 135 на 15 день роста, собраны данные, которые отражены в таблице ( ),
Как видно из таблицы, вне зависимости от вида культуры показатели культур, выращенных на среде с добавлением 3 % раствора мальтозы, были выше, чем на сусло-агаре без добавления мальтозы или с раствором мальтозы 1 %, 9 % концентрации. Показатели количества жизнеспособности грибных клеток в грибных суспензиях испытуемых культур были ниже, чем показатели концентрации микроконидий в этих грибных суспензиях, но соотношения показателей, полученных от культур, выросших на экспериментальных партиях сусло-агара, были выше, чем показатели культур, выросших на контрольной питательной среде, что сходно с данными по проверке концентрации микроконидий.
