Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
2.1 Общая характеристика вируса гриппа типа А 9
2.2 Экологические аспекты эпизоотологического мониторинга гриппа типа А 11
2.3 Территориальные и популяционные аспекты эпизоотологического мониторинга гриппа типа А среди диких птиц 24
2.4 Заключение по обзору литературы 31
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
3.1 Материалыи методы 33
3.2 Результаты собственных исследований 40
3.2.1 Оценка природно-географических особенностей мест обитания диких "птиц на территории полуострова Таймыр, видовой структуры орнитофауны, а также ее миграционных путей с позиций эпизоотологической значимости в отношении гриппа птиц типа А 40
3.2.1.1 Природно-географическая характеристика мест обитания диких птиц с позиций условий для сохранения жизнеспособности вируса 40
3.2.1.2 Анализ видовой структуры диких птиц на Таймыре с учетом степени восприимчивости к вирусу гриппа 44
3.2.1.3 Анализ миграционных путей диких птиц, проходящих через территорию полуострова Таймыр с позиций их эпизоотологической значимости в отношении гриппа птиц 65
3.2.2 Эпизоотологический мониторинг гриппа птиц типа А на территории полуострова Таймыр с использованием результатов лабораторных исследований 79
3.2.2.1 Результаты вирусологических исследований биоматериала (клоакальные мазки) 79
3.2.2.2 Результаты серологических исследований сывороток крови 83
3.2.2.3 Результаты серологических исследований желтков яиц . 93
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 102
5. ВЫВОДЫ 109
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 111
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
ПРИЛОЖЕНИЕ 129
Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что дикие птицы являются природным резервуаром возбудителей многих инфекционных болезней, представляющих явную или потенциальную опасность для всей остальной дикой фауны, а также для домашних и сельскохозяйственных животных, птиц и даже людей.
В последние годы во многих странах мира среди птиц были зарегистрированы массовые эпизоотии гриппа типа А. Международное эпизоотическое бюро относит грипп типа А к списку особо опасных трансграничных зоонозных болезней.
Вирусы гриппа типа А {Orthomyxoviridae, Orthomyxovirus) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их естественными хозяевами и основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса (Д.К. Львов и др., 2004; D.J1 Alexander, 2000). При этом основная роль в распространении инфекции отводится сезонным миграциям птиц (Д.К. Львов и др., 1979).
Исходя из изложенного, места' обитания диких птиц, с учетом миграционных процессов, способствующих географическому распространению различных инфекционных патогенов, в том числе вируса гриппа, представ^ ляют научный и практический интерес в качестве основного объекта эпизоотологического мониторинга.
Одним из опасных вариантов вируса гриппа является H5N1. Начав циркулировать в 1997 г. в Гонконге, вирус этого варианта инфицировал как птиц, так и людей, охватывая все новые районы Азии. В течение нескольких лет он распространился на территории всего континента, при этом практически все заболевшие домашние птицы погибли.
В 2004 г. в азиатских странах была зафиксирована вспышка «птичьего» гриппа H5N1 среди людей. При этом вирус оказался более вирулентным, чем в предыдущие годы, на что указывали необычно высокий падеж среди, птиц, а также летальные случаи заболевания у людей.
Общепризнано^ что особенности природных условий конкретной' местности являются? важнейшим фактором в естественном отборе и образовании, новых субтипов;вирусов.
Полуостров Таймыр является уникальной территорией, на которой сосредоточивается многомиллионное поголовье пернатых мигрантов из разных уголков-мира и сходятся все четыре значимых для России миграционных пути.
Таким образом, эпизоотологический мониторинг в местах обитаниядиких птиц на территории полуострова Таймыр весьма актуален в наз^ном и практическом, отношении не только в местных, но и глобальных масштабах, причем как с эпизоотологической, так и с эпидемиологической точки зрения.
Цель исследований- эпизоотологический мониторинг гриппа типа А среди перелетных диких, водоплавающих птиц и птиц околоводного комплекса на территории полуострова Таймыр.
Задачи исследований:
• провести оценку природно-географических особенностей мест обитания диких птиц на территории полуострова' Таймыр, видовой , структуры орнитофауны, а также ее миграционных путей с позиций', эпизоотологической значимости в отношении гриппаптиц типа А;
• осуществить эпизоотологический мониторинг гриппа птиц типа А на территории полуострова Таймыр с использованием результатов лабораторных исследований.
Научная новизна. Подтверждена значимость территории: полуострова Таймыр для проведения мониторинговых исследований, направленных на эпизоотологическую оценку популяций мигрирующих через нее диких птиц по гриппу типа. А. Установлена эффективность ретроспективной серологической диагностики гриппа птиц типа А при исследовании сывороток- крови и желтков яиц от птиц. При этом доказана технологичность серологического исследования желтков яиц без ущерба для информативности.
Практическая и теоретическая значимость. Полученные в настояпдей работе данные, подтверждающие контакты диких птиц полуострова Таймыр с вирусом гриппа типа А на различных путях миграции, будут способствовать повышению эффективности прогнозирования эпизоотической ситуации по гриппу птиц в Европейской и Центральной части России, а также других государств ближнего и дальнего зарубежья.
Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и одобрены на: Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» (Москва, 2006), научной сессии €НМЦ Россельхозакадемии и Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства ^ (СанктПетербург, 2006), Ш Международной научно-практической- конференции молодьтх ученых «Новейшие направления-развития аграрной науки в работах молодых ученых» (пос. Краснообск, 2008), XI Международной научнопрактической конференция «Развитие АПК азиатских территорий» (Новосибирск,- 2008), Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы.исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), на ежегодных ученых советах ГНУ НИИСХ Крайнего Севера СО Россельхозакадемии (2005-2008).
Публикации результатов исследований. Основные положения диссертации отражены в 8 работах, в том числе в трудах Международных конференций, 1 статья в издании, рекомендованном ВАК Минобразования РФ «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки».
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах и включает разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована 21 таблицой и 17 рисунками. Список литературы содержит 156 источника, в том числе 37 работ отечественных авторов и 119 работ иностранных авторов.
Внедрение результатов исследований. На основе материалов исследований подготовлены и изданы методические рекомендации «Эпизоотологический мониторинг гриппа типа А среди диких птиц в местах их обитания на территории полуострова Таймыр», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 5 от 28 мая 2008 г.), основные положения которых используются при планировании И' проведении противоэпизоотических мероприятий в Норильском промышленном районе и буферной (охранной) зоне Государственного природного заповедника «Путоранский».
Основные положения, выносимые на защиту^
• результаты» оценки природно-географических особенностей мест обитания диких птиц на территории полуострова-Таймыр, видовой структуры орнитофауны, а также ее миграционных путей с позиций эпизоотологической значимости в отношении гриппа птиц типа А;
• материалы эпизоотологического мониторинга гриппа птиц типа А на территории полуострова Таймыр с использованием результатов лабораторных исследований.
Благодарности Выражаю большую благодарность доктору ветеринарных наук, членкорреспонденту Россельхозакадемии Лайшеву Касиму Анверовичу; доктору ветеринарных наук, профессору Димову Сергею Константиновичу; кандидату биологических наук Шестопалову Александру Михайловичу, а также всем сотрудникам отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора и в частности с.н.с. Дурыманову Александру Гавриловичу; кандидату биологических наук Кокореву Якову. Ивановичу за ценные советы и указания, высказанные при выполнении и обсуждении данной работы.
Общая характеристика вируса гриппа типа А
Вирус гриппа рода A {Influenzavirus А) принадлежит к семейству ортомик-совирусов (Ortomyxoviridae). Это оболочечный вирус с нуклеокапсидом спиральной симметрии. Геном вируса сегментирован и представлен 8-ю молекулами одноцепочечной РНК негативной полярности (WHO, 1980; N.J. Сох et al., 2000).
Типирование ортомиксовирусов проводят на основе антигена нуклео-капсида и антигена матрикса, которые сходны также, для всех вирусов гриппа А. Субтипирование производится на основе антигенов гемагглютинина (НА) или нейраминидазы (NA). В настоящее время известны 16 подтипов,гемагглютинина (HI-HI 6) и 9 подтипов нейраминидазы.(N1 -N9) вируса гриппа A (WHO; 1980; V.S. Hinshaw et al., 1982; Y. Kawaoka et al., 1990; С Rohm et al., 1996a; R.A. Fouchier et al, 2005).
Согласно Международной номенклатуре штаммы вируса гриппа А обозначаются по следующим правилам: а) тип антигена; б) вид животного-хозяина; в) регион распространения; г) ссылка на номер штамма; л) год вы- деления; е) для вирусов гриппа А необходимо указывать подтипы Н и N. Так, например: А/индейки/Англия/199/79 (H7N7) (WHO, 1980).
Строение вириона. Вирионы вируса гриппа А представляют собой частицы плейоморфной, чаще округлой формы, диаметром 80-120 нм (рис. 1). Липидный компонент оболочки вируса имеет клеточное происхождение. На поверности липидной оболочки присутствуют 2 вида шипиков (диаметром 10-14 нм), образованных гликопротеинами - гемагглютинином (НА) и ней-раминидазой (NA) (R.A. Lamb, R.M. Krug, 1996).
Шипики 1-го вида состоят из 3-х молекул НА, которые организованы в палочкообразную структуру. Каждая молекула НА состоит из двух субъединиц (НА1 и НА2), соединенных дисульфидной связью (LA. Wilson et al., 1981; SJ. Watowich et al., 1994). Выступы 2-го вида образованы 4-мя молекулами NA, которые организованы в грибоподобную структуру (J.N. Varghese,
P.M. Colman, 1991). Кроме перечисленных гликопротеинов, в липидную оболочку вириона встроен интегральный мембранный белок М2, тетрамеры которого образуют каналы, обладающие ионной Н+ активностью (S.L. Zebedee, R.A. Lamb, 1988; L.H. Pinto et al., 1992). Внутреннюю поверхность липидной оболочки выстилает матриксный белок Ml, который связан с рибонуклео-протеиновыми структурами.
В вирионе выявлено 8 классов рибонуклеопротеиновых структур (РНП), каждая из которых состоит из однонитевой молекулы РНК и 4-х видов белков: нуклеопротеина (NP), в который заключена РНК, и 3-х белков РНК-полимеразного комплекса (РВ1, РВ2 и PA) (R.A. Lamb, R.M. Krag, 1996). Кроме того, в вирионе присутствует небольшое количество NS2 белка, который связан с Ml белком (R.A. Lamb, R.M. Krag, 1996).
Заболевание животных и человека, называемое гриппом, вызывают представители семейства ортомиксовирусов {Orthomyxoviridae): вирусы гриппам родов; A (InfluenzavirusА), В; (InfluenzavirusВ) и С (Influenzavirus С). Из них только вирус гриппа А имеет широкий круг хозяев, включающий различные виды млекопитающих-иптиц; Вирус гриппа В изолирован только от человека, а вирус гриппа С - только от человека и свиней (R.G;Webster et al., 1992).
Для штаммов вируса гриппа А» изолированных от разных видов животных часто используют экологические названия, обозначающие: источник изоляции вируса, напримерj «вирус гриппа птиц», «вирус: гриппа свиней» и «вирус гриппа лошадей» и др..
. Циркуляция вируса гриппа At вмопуляциилюдеш ч У человека вирус гриппа А поражает органы дыхания; вызывая;острое: респираторное заболевание. Передача: возбудителя, происходит воздушно-капельным путем (X. Эндрюс, 1967; M.R. Moser et al., 1979). Для данной инфекции характерно распространение в виде эпидемий и пандемий, однако зарегистрированы спорадические случаи выделения штаммов вируса гриппа А от людей и в межэпидемический период (ЗІД. Кильбурн, 1978).
Эпидемии гриппа, вызываемые вирусом гриппа А регистрируются в популяции человека ежегодно и поражают около 20% населения (A.W. Crosby, 1990; L. Simonsen et al., 2000). В северном полушарии пик эпидемии обычно приходится на зиму, первую четверть года. В южном полушарии, где сезоны обратно: пропорциональны; северным, эпидемическая кривая возрастает в летний период. В тропиках эпидемии гриппа происходят в сезон дождей (ЭД. Кильбурн, 1978; Y. Ghendon, 1991).
Материалыи методы
Работа выполнена в отделе ветеринарии и биотехнологии Государственного научного учреждения Научно-исследовательского института Крайнего Севера СО Россельхозакадемии, при содействии отдела зооанозных инфекций и гриппа Федерального государственного учреждения науки Государственного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнад-зора, г. Новосибирск, в различные сезоны 2005-2008 гг. Объектом исследования служили дикие водоплавающие, птицы и птицы околоводного комплекса, мигрирующие на территорию полуострова Таймыр.
Оценку природно-географических особенностей мест обитания диких птиц на-территории полуострова1 Таймыр, видовую структуру орнитофауны, а также ее миграционные пути с позиций, эпизоотологической значимости изучали на основании литературных данных, а также собственных" наблюдений, в т.ч. проведенных совместно со ст. научным сотрудником ГНУ НИИСХ Крайнего Севера, кандидатом биологических наук Кокоревым Я.И.„ Районы сбора проб различного биоматериала от диких водоплавающих птиц и птиц околоводного комплекса определяли с учетом путей- сезонных миграций, а также мест массовой линьки.
Лабораторные исследования проведены по методикам, разрешенным Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ и рекомендованным Всемирной-. Организацией Здравоохранения, на базе отдела зооанозных инфекций и гриппа ФГУН ГЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора
Для вирусологических исследований от птиц брали клоакальные мазки. Использованные материалы:
- транспортная, среда глицерин/ФСБ;
- криопробирки, объем 2 мл;
- ватные палочки;
- жидкий азот (сосуд Дьюара).
Подготовка транспортной среды:
Стерильная среда для транспортировки и хранения клоакальных мазков готовилась непосредственно в лаборатории согласно рекомендованной методике (WHO, 2002).
Первоначально был приготовлен фосфатно-солевой буфер (ФСБ) (табл. 2). Затем стерильный фосфатно-солевой буфер смешивали со стерильным глицерином в соотношении объемов 1:1. Затем к среде добавляли антибиотики: пенициллин, стрептомицин, гентамицин и нистатин до конечных концентраций 2 х 106 ед/л, 0,20 г/л, 0,25 г и 0,5 хЮ6 ед/л, соответственно. Приготовленную среду фасовали по 1 мл в стерильные 2-х мл пластиковые пробирки. Все манипуляции со средой (смешивание компонентов и фасовка) проводили в стерильных условиях. Пробирки со средой хранили при +4 С или при комнатной температуре не более 2-х дней; при необходимости более длительного хранения - при температуре -20 С.
Взятие клоакального мазка:
Мазки брали сухими тампонами и помещали в пронумерованные пробирки (мазок от каждой особи помещали в отдельную пробирку), а в рабочем журнале записывали соответствующий номер пробирки.
Собранный материал до анализа хранили в жидком азоте или в низкотемпературной морозильной камере при температуре не выше -70 С (WHO, 2002).
Выделение изолятов вируса гриппа А Выделение изолятов вируса гриппа А из клоакальных мазков птиц проводили: на развивающихся; куриных эмбрионах (КЭ) путем проведения трех последовательных пассажей, согласно рекомендованной методике (WHO,- 2002).
Проведение I пассаэ/са. Пробирку с мазком размораживали, встряхивали на вортексе и= оставляли для: отстаивания на 30 мин; при комнатной температуре. Затем по 100-200 мкл среды, содержащей мазок, инокулировали в; аллантоисную полость 9-10 дневного КЭ. Каждый образец биологического материала; был инокулироват в 3 КЭ; Эмбрионы инкубировали во влажной атмосфере при +37 С и осматривали ежедневно для выявления погибших. У погибших КЭ немедленно собирали; аллантоисную жидкость (а.ж.): По? истечении 3 суток инкубирования а.ж. собирали у всех КЭ; объединяя жидкости, собранные у эмбрионов; зараженных одним, и тем же образцом; биологического материала; Собранную а.ж. тестировали на присутствие гемагглютинирующеи; активности в реакции- гемагглютинации (PFA); Образцы а.ж. с выявленной гемагглютинирующеи активностью были взятьк дляс дальнейшего; тестирования; на присутствие в них. вируса гриппа А молекулярно-биологическими методами. Образцы а.ж. в которых не было выявлено гемагглютинирующеи активности были взяты для проведения следующего пассажа.
Проведение II и III пассажа проводили аналогично первому, с тем отличием, что в данном случае инокулятом являлся образец а.ж., собранной в предыдущем пассаже и не показавший гемагглютинирующеи активности в РГА. Перед введением в эмбрион а.ж. осветляли низкоскоростным центрифугированием в течение 5 мин и добавляли те же антибиотики и до тех же конечных концентраций как и при приготовлении среды для транспортировки мазков (см. выше). При отсутствии гемагглютинирующеи активности у а.ж. после третьего пассажа делали вывод об отсутствии BE А в-исходном образце соответствующего биологического материала.
Обсуждение результатов
Вирусы гриппа типа A (Orthomyxoviridae, Orthomyxovirus) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их естественными хозяевами и основным резервуаром в природе являются дикие водоплавающие птицы, чайки и птицы прибрежной полосы (Д.К. Львов и др., 2004; DJ. Alexander, 2000; D.L. Suarez, 2000): Кроме этого, как недавно стало известно, к вирусу гриппа А восприимчивы: скворцы, страусы, зяблики, домашние воробьи, волнистые попугайчики, голуби, грачи» и другие птицы (DJ. Alexander, 2000; L.E. Perkins, 2003).
При этом основная роль в распространении инфекции отводится сезонным миграциям птиц (Д.К. Львов, В.Д. Ильичев, 1979).
Исходя из изложенного, места обитания диких птиц;, с учетом миграционных процессов, способствующих географическому распространению? различных инфекционных патогенов,,в.том числе вирусов гриппа типа-А, представляют научный и практический интерес в качестве, основного объекта эпизоотологического мониторинга.
Общепризнано, что особенности природных условий конкретной местности являются важнейшим фактором в естественном отборе и образовании новых субтипов вирусов (Э.Д. Кильбурн, 1989; Д.К. Львов, 2004; R.G. Webster, 1992).
Полуостров Таймыр является уникальной территорией, на которой сосредоточивается многомиллионное поголовье пернатых мигрантов из разных уголков мира и сходятся все четыре значимых для России миграционных пути.
Таким образом, эпизоотологический мониторинг гриппа типа А на территории полуострова Таймыр весьма актуален в научном и практическом отношении не только в местных, но и глобальных масштабах, причем как с эпизоотологической; так и с эпидемиологической точки зрения.
Эпизоотологический мониторинг гриппа типа А среди диких водоплавающих птиц и птиц околоводного комплекса на полуострове Таймыр нами проведен впервые.
Первоначально была проведена оценка природно-географических особенностей мест обитания диких птиц на территории полуострова Таймыр, видовой структуры орнитофауны, а также ее миграционных путей с позиций эпизоотологической значимости в отношении гриппа птиц типа А.
Места обитания диких птиц по природно-географической характеристике с позиций условий для сохранения жизнеспособности вируса оказались вполне приемлемыми.
Мнения о сроках сохранения вирусов гриппа А во внешней среде неоднозначны. Известно, что вирус гриппа птиц может сохраняться- в окружающей среде: в фекалиях птицы в течение 35 дней при температуре 0Є и не менее 4 дней при +25С (K.F. Shortridge et al., 1998), в охлажденных тушках птиц как минимум в течение 23 дней. D.A. Senne с соавторами (1994) показали, что вирус гриппа А полностью инактивируетсявшод-стилке в течение 10 дней. По данным других авторов (Hi Lu et ah, 2003) вирус высокопатогенного гриппа A (H7N2) мог быть инактивирован в срок 7 сут. при окружающей температуре от +15 до +20С и в течение 30 минут при +56С. X. Эндрюс (1967) отмечал, что «при - 70С и в лиофи-лизированном виде вирус сохраняется в течение нескольких лет».
Однако, в целом можно утвердительно говорить об удовлетворительных условиях для сохранности вируса гриппа А на территории Таймыра.
Низкие температуры, преобладающие на территории полуострова, позволяют вирусу сохранить свою жизнеспособность в течение долгого времени.
Прилет мигрирующих диких птиц на гнездовье весной и отлет их осенью на зимовки, на всей территории Таймыра происходит, когда температура окружающей среды еще далека от положительной, от -5 до -20С. То есть, теоретически, занесенный вирус попадает в благоприятные условия для консервации. То же самое происходит и осенью, температура во время отлета птиц на зимовки на Таймырском полуострове так же может варьировать от 0С до -10-15С, что в свою очередь благоприятствует консервации вируса, который культивировался в гнездовой период в популяции птиц и выделялся в окружающую среду.
Обилие водных ресурсов - рек, озер и болотистых участков на мониторинговой территории полуострова, так же способствует сохранности и передачи вируса от носителей вируса к восприимчивым организмам. Вирус гриппа птиц успешно выделяли из свежих фекальных масс, а также из неконцентрированной озерной воды (R.G. Webster, 1978). В дикой природе объектами передачи вируса могут быть: растительность, почва и вода (В.Н. Сюрин и др., 1998; R.G. Webster, 1978; B.C. Easterday et al., 1997).
Для всей территории полуострова Таймыр - от полярных пустынь района м. Челюскин до северной окраины тайги на широте Норильских озер орнитофауна гнездящихся птиц представлена 132 видами.
Зарубежными исследователями проведена сравнительная оценка встречаемости вируса гриппа А среди птиц различных семейств. Оценивая частоту встречаемости инфекции в категориях "часто".; "иногда", "редко" и "очень редко", они отнесли семейство Anatidae к группе, в которой вирус гриппа встречается "часто", семейства Scolopacidae, Charadriidae и Laridae — к группе "иногда", семейства Ardeidae и Threskiornithidae - "редко" (J.P. Tracey et al., 2004). Следует отметить, что все семейства птиц, попавшие в категории "часто", "иногда" и "редко", относятся к группе водно-болотных птиц. В категорию "очень редко" попали семейства птиц, не относящиеся к водно-болотным (J.P. Tracey et al., 2004).
