Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Этиологическая структура гнойно-септических заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами 8
1.2. Современные аспекты профилактики и лечения гнойно-септических заболеваний 14
2.0. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1. Материал и методы исследований 35
3.0. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 39
3.1. Анализ гнойно-септических заболеваний домашних животных 39
3.2. Видовой состав условно-патогенной микрофлоры при основных формах гнойно-септических заболеваний 43
3.2.1. Микрофлора при пиодермии 43
3.2.2. Микрофлора отитов у домашних животных 46
3.2.3. Микрофлора свежих и гнойных ран при травмах живот- 49 ных
3.3. Биологические свойства синегнойной палочки и стафилококков, выделенных при гнойно-септических заболеваниях собак 55
3.3.1. Морфологическая, культуральная и биохимическая характеристика культур Ps.aeruginosa 55
3.3.2. Биологическая характеристика культур стафилококков 56
3.3.3. Изучение чувствительности к антибиотикам и химиопре паратом основных возбудителей гнойно-септической раневой инфекции домашних животных 58
3.4. Теоретическое обоснование получения и применения иммуноактивных препаратов для терапии и профилактики гнойно-септических заболеваний 60
3.4.1, Разработка состава жидкой синтетической питательной среды для культивирования Ps.aeruginosa, пригодной для получения вакцинного препарата 62
3.4.2. Получение стафилококкового анатоксина 67
3.5. Экспериментальное моделирование пиодермии вызванной синегнойной палочкой и золотистым стафилококком и раневого гнойно-септического очага 68
3.6. Изучение эффективности вакцинотерапии на моделях искусственной пиодермии 70
3.7. Изучение эффективности сочетания вакцинотерапии и инъекционной формы АСД-второй фракции при гнойно-септической инфекции на белых мышах 73
3.8. Испытание новых методов лечения и профилактики гнойно-септических заболеваний 79
3.9 Специфическая и неспецифическая иммунотерапия гнойно-септических заболеваний собак 80
3.9.1. Иммунотерапия раневой инфекции 82
3.9.2. Иммунотерапия при пиодермии собак 82
3.9.3. Влияние инъекционной формы АСД-2-Й фракции на заживление ран у собак 86
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 90
ВЫВОДЫ 98
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 99
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 100
ПРИЛОЖЕНИЕ
- Этиологическая структура гнойно-септических заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами
- Материал и методы исследований
- Анализ гнойно-септических заболеваний домашних животных
Введение к работе
Актуальность темы. За последние десятилетия в инфекционной патологии людей и животных значительно возросла роль условно патогенной микрофлоры как возбудителей различных инфекционных заболеваний, в том числе септических и гнойно-воспалительных осложнений при травмах и оперативных вмешательствах (Говалло ВИ., 1983; Ермаков A.M., 1996, 1997, 1998; Игнатов П.Е, 1995; Черванев В.А., 2001, 2002; Черномордик А.Б., 1989 и др.).
Лечить больных с гнойно-септической инфекцией с каждым годом становится все труднее, что связано с приобретенной резистентностью возбудителей к большинству применяемых в клинике химиотерапевтических препаратов. По сообщению ВОЗ, 1997 появились микроорганизмы, устойчивые ко всем применяемым антибиотикам, что грозит непредсказуемыми последствиями для животного мира на Земле. И это одна из величайших угроз, о которой в 60-е годы 20 века предупреждал ЛМ.Громашевский - «на горизонте науки возникает проблема эпидемиологии инфекционных процессов, обусловленных условно-патогенными возбудителями и на первый план выходят ряд инфекций, которые в прежнее время доставалась лишь второстепенная роль».
Многочисленные литературные источники свидетельствуют, что в этиологии гнойно-септических заболеваний участвуют различные виды так называемых условно-патогенных микроорганизмов. Если в медицине этой проблеме давно уделяется исключительно важное значение, то в ветеринарии этиологическая и эпизоотологическая значимость отдельных видов патогенов в возникновении гнойно-септических заболеваний практически не раскрыта в научной литературе. Между тем вопросы раскрытия этиологии и патогенеза каждой нозологической формы гнойно-септического заболевания являются непременным условием решения важного вопроса - поиска путей и определения перспектив борьбы с данной инфекцией.
В последние годы зарубежные исследователи все чаще обращают внимание на разработку так называемых средств вакцинотерапии, не без основания отдавая им предпочтение перед антибиотико- и химиотерапией (J.Grange, J.Stanford, 1996). Следует отметить, что в настоящее время в ветеринарии практически отсутствуют препараты для проведения целенаправленной иммунотерапии и иммунопрофилактики гнойно-септической инфекции. Указанное обстоятельство и обусловило нашу цель и задачи исследований по поиску средств иммунотерапии и иммунопрофилактики гнойно-септических заболеваний животных.
Цель исследований. Экспериментальное обоснование и практические подходы целенаправленной иммунотерапии и иммунопрофилактики наиболее распространенных форм гнойно-септических заболеваний у собак.
Для решения посташіенной цели были поставлены следующие задачи:
- Провести анапиз гнойно-септических заболеваний домашних животных и определить ведущие патогены, вызывающие их основные нозологические формы.
- Теоретически обосновать, в эксперименте и в производстве апробиро
вать новые средства специфической и неспецифической иммунотерапии и
иммунопрофилактики гнойно-септических заболеваний.
Научная новизна - Изучена роль стафилококков и синегнойной палочки в этиологии и патогенезе свежих и гнойных ран, пиодермии у собак;
Разработаны и запатентованы состав жидкой синтетической питательной среды вьфащивания синегнойной палочки (патент РФ №2203943 от 10 мая 2003 г.) и способ получения анатоксина синегнойной палочки (патент РФ № 2270867 от 27.02.06.)
Разработан способ получения стафилококкового анатоксина (патент РФ №2179860 от 27.02.2002).
Проведенные в эксперименте опыты позволили определить новые подходы в профилактике и лечении гнойных ран и пиодермии у собак.
Практическая значимость. В данной работе проведена оценка влияния новых средств специфической и неспецифической иммунотерапии на течение инфекционного и воспалительного процесса в гнойной ране и при пиодермии у собак.
По результатам научных исследований разработана научно-техническая документация на среду для выращивания синегнойной палочки, способы получения анатоксина синегнойной палочки и стафилококкового анатоксина, по которым получены патенты РФ.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
- Роль и место стафилококков и синегнойной палочки в этиологии и па
тогенезе основных нозологических форм гнойно-септических заболеваний
собак;
- Теоретическое обоснование и практические подходы в вопросе полу
чения и применения новых средств иммунотерапии и иммунопрофилактики
пиодермии и гнойных ран у собак.
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на Ученом совете Курского НИИ АПП за 2001-2006 гг.; на международной научно-практической конференции. Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. - Воронеж, 2002; на международной научно-практической конференции «Использование научного потенциала вузов в решении проблем научного обеспечения в АПК в России», Орел, 2000 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринария. Современные аспекты и перспективы», Орел, 2002 г.; ежегодных конференциях профессорско-преподавательского состава Орловского ГАУ, 2000-2006 гг.
Публикации. По материалам исследований, представленных к защите получено три патента на изобретение и опубликовано 7 статей.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Этиология и патогенез основных нозологических форм гнойно-
септических заболеваний непродуктивных животных;
- Теоретическое обоснование и практические подходы разработки и применения новых эффективных средств и методов терапии гнойно-септической инфекции.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 2 рисунками, содержит в себе следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, включающий в себя 195 источника, в том числе 28 иностранных авторов и приложение.
Этиологическая структура гнойно-септических заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами
При современном уровне физического, химического и биологического загрязнения окружающей среды, домашние и сельскохозяйственные животные в не меньшей, если не большей степени страдают от вторично индуцированного иммунодефицита - разбалансировки нормального функционирования иммунной системы. Это приводит к существенному снижению общей сопротивляемости организма к различным заболеваниям вирусной и бактериальной природы. Инфекционные заболевания домашних и служебных животных являются одной из главных проблем их владельцев, содержателей питомников и ветеринарной службы. Существует множество причин возникновения данной группы болезней. К основным группам возбудителей относятся патогенные микроорганизмы - вирусы, бактерии. Кроме этого существует огромная «армия» условно-патогенной микрофлоры, которая при определенных, благоприятных для нее условиях, переходит «границу» условности и начинает активно патогенно воздействовать на макроорганизм.
В настоящее время насчитывается несколько десятков видов условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих гнойно-септические заболевания. Значение различных микроорганизмов в этиологии гнойно-воспалительных заболеваний не равнозначны, оно меняется во времени и зависит от профиля лечебного стационара. Считается, что основными факторами риска развития хирургической раневой инфекции этом являются тип раны, длительность предоперационного периода, предоперационная подготовка операционного поля, длительность операции и наличие нелеченной трудно обнаруживаемой инфекции. При этом следует учитывать и особенности раневого очага, которые заключаются в разрушении тканей в зоне повреждения, внедрения в поврежденные ткани микробно-загрязненных инородных тел и клеточных ультраструктур, а также постоянной эндотоксемии. На развитие раневой инфекции влияют также сроки оказания квалифицированной хирургической помощи, обширность повреждений тканей, объем хирургических вмешательств, применение антибиотиков и антисептических средств, а также дефекты хирургической обработки раны (Брюсов П.Г.,2001). О наличии раневой инфекции свидетельствуют наличие эритемы вокруг краев раны более 2 см, боль при пальпации, индурация, флюктуация, отделение гнойного содержимого. Доминирующими при нозокоминальных (внутри-больничных) инфекциях возбудителями в хирургии и травматологии, в аку-шерско-гинекологических заболеваниях являются стафилококки, стрептококки, синегнойная палочка, протей.
В экспериментах и клинических наблюдениях показаны зависимость риска приобретения послеоперационной инфекции от количества бактерий, попадающих в рану, типа ран, а также дозо-зависимая связь между количеством бактерий в ране и развитием послеоперационного раневого сепсиса (Дж.У.Александр, P.P. Гуд, 1974; Кузин М.И. и Костюченко Б.М., 1990; D.Raahave, 1991). Для возникновения инфекционного процесса необходимо, чтобы общее количество микробов превысило «Критический уровень», который составляет 10-10 бактерий в 1 гткани, взятой из глубины раны.
Микробный пейзаж гнойных ран может быть самый разнообразный в зависимости от давности существования, локализации и предшествующего лечения. При «свежих» гнойных процессах, с давностью существования до 3-5 дней обычно превалируют стафилококки, сменяющиеся в дальнейшем преобладанием развивающейся колонии синегнойной палочки, которая и усугубляет процесс развития болезни. Среди грамотрицательных возбудителей инфекции выделяются три основные семейства бактерий - Pseudomonas, Enterobacterial ае, Bacteroides. Из них в ранах и на поверхности кожи чаще всего встречаются представители Pseudomonas aeruginosa, которые относятся к строгим аэробам и могут вызывать инфекции с серьезными последствиями вплоть до летального исхода. При разрушении этих бактерий освобождается эндотоксин, а сами микробные клетки продуцируют экзотоксин, подобный гемолизину и протеазам. Кроме того, следует учитывать, что синегнойная инфекция серьезно влияет на течение основной болезни и требует особого лечения. А это, в свою очередь, предполагает необходимость точного определения этиологии гнойно-септических заболеваний. Резистентные псевдомонады в настоящее время встречаются все чаще. (Тихонин В.В.,Карпецкая НЛ.,2003).
Так, Сафаров С.Ю., Алиев М.А. (1993) из свежих ран выделили золотистый стафилококк в 12 % случаев, стрептококк, синегнойную палочку в 8 %, протей-3 %, кишечную палочку- 3 ,%.
Долидзе Н.Г. с соавт. (1986) получил практически схожие результаты. Авторы при исследовании микрофлоры в «свежих» гнойных ран стафилококк высевали в 62,1 % случаев, кишечную палочку - 18,2 %, стрептококк- 8,6 %, синегнойную палочку- 6 6 %, протей -4,5 %, однако в дальнейшем рост культуры си негнойной палочки значительно усиливался до 52,7% по сравнению с остальными представителями ассоциации микробов.
Материал и методы исследований
Работа выполнялась в период с 2000 по 2005 г. г. в соответствии с тематическими планами Курской государственной сельскохозяйственной академии, Орловского государственного аграрного университета и Курского НИИ агропромышленного производства, в условиях ветеринарных лечебниц Орла и Брянска.
В процессе работы использовались эпизоотологический, клинический, бактериологический и гистологический методы исследований.
Основой эпизоотологических исследования был анализ ветеринарной отчетности,и заболеваемости домашних и служебных животных инфекционными болезнями. Особое внимание уделяли регистрации гнойно-септических заболеваний.
Клинические исследования предполагали определение общего состояния животных, возраст, упитанности, температуры тела, состояния пульса и дыхания. Для проведения научных опытов методом выбора формировались группы животных имеющие клинические признаки гнойно-септической раневой инфекции, с пиодермией и отитами.
Для изучения этиологического фактора было использовано 217 домашних и служебных животных с гнойными ранами, ниодермитами, отитами. Материалом для проведения бактериологических исследований служили раневые истечения, выделения из слухового хода, пораженные пиодермией участки кожи.
Взятие материала проводили по обычной методике стерильным тампоном, который сразу же переносим в пробирку с мясопептонный бульоном (МПБ). Далее пробы помещали на 24 часа в термостат при 37С.
Морфологические свойства выделенных колоний микробов изучали путем микроскопии мазков окрашенных по Граму.
Для выделения чистых культур исследуемый материал засевали на чашки МПА с 5-10 % дефибрированной крови барана с добавлением 0,5-1 % глюкозы и без нее.
Для определения окислительного или ферментативного типа расщепления глюкозы использовали среду Хью-Лей фсена в модивикации Л.Г.Воронежской.
Гистологические исследования проводили по общепринятой методике, препараты окрашивали гемотоксилин-эозином.
Идентификацию видов бактерий осуществляли с помощью определителя Д. Берги (1974); методических указаний по диагностике стафилококкоза и стептококкоза (Есепенок В.Е. с соавт., 1997); псевдомоноза животных и птиц (Третьяков А.Д., 1998).
Чувствительность выделенных культур к антибиотикам (пенициллин, оксациллин, гентамицин, фармазин, энфролакса-цин) определяли методом индикаторных бумажных дисков. Результаты оценивали по величине зоны задержки роста микробов.
Определение чувствительности культур проводили путем их высева в бактериальные чашки с МПА. Чашки ставили в термостат на 30 минут для подсыхания, после чего на поверхность посева размещали бумажные диски, пропитанные антибиотиками. После суточного пребывания чашек в термостате учитывали результаты исследований по зоне задержки роста исследуемых культур. При наличии задержки 16 мм и более, культуры считали чувствительными к препарату, которым пропитан диск.
Для получения вакцинных препаратов против псевдомоноза и стафилококкоза использовали собственно разработанные жидкие питательные синтетические среды.
Детоксикацию культуральной жидкости стафилококков и синегнойной палочки проводили добавлением формалина до 0,3-0,4%. Детоксикацию проводили не отделяя биомассу от культуральной жидкости при температуре 44-45С в течение 10 дней. Ежедневно 3-4 раза в день, взбалтывая содержимое биобутылей. После чего фильтрацией отделяли биомассу от инактивированной формалином культуральной жидкости. Последнюю, после расфасовки по флаконам и заключительной стерилизации, проверки на стерильность и безвредность, использовали в качестве нативных вакцинных препаратов вначале при испытании на лабораторных животных при моделировании у них разных форм гнойно-септических заболеваний, а впоследствии применяли в лечебной практике ветеринарных клиник Орла и Брянска.
Проверку на безвредность и токсичность вакцинных препаратов проводили на белых мышках, массой 18-20 г, вводя им внутрибрюшинно по 0,3-0,5 мл испытуемого препарата. Препарат считался безвредными при отсутствии гибели животных в течение 10 дней.
Стерильность препарата контролировалась при высеве на МПА, МПБ и МПБ под вазелиновое масло. Отсутствие роста синегнойной палочки свидетельствовало о стерильности препарата.
Инъекционную форму антисептика Дорогова (АСД) второй фракции получали путем снижения концентрации биологически активных веществ препарата до 2% и нейтрализуя остаточную щелочность добавлением янтарной кислоты.
Анализ гнойно-септических заболеваний домашних животных
В настоящее время гнойно-септические заболевания занимают ведущее место в инфекционной патологии домашних животных. Для гнойно-септических заболеваний характерно многообразие клинических форм проявления, общими для которых являются наличие гнойного очага поражения и возможность возникновения при определенных условиях септического процесса. Однако, несмотря на высокий уровень и инфекционный характер эти заболевания не имеют официального учета в принятой отчетности. Это обусловлено тем, что этиология этих болезней бывает самой различной. В то же время без знания истинных показателей заболеваемости не представляется возможным определение их этиологического состава, что необходимо для проведения целенаправленных лечебно-профилактических мероприятий и углубления наших знаний в целом об эпизоотологии инфекций, вызываемых условно-патогенной микрофлорой.
Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований по определению уровня различных нозологических форм гнойно-септических заболеваний домашних животных, в частности, собак и выявление основных патогенов, вызвавших эти заболевания.
За период с 2002 по 2004 годы нами в условиях ветеринарных лечебниц Орла и Брянска проанализированы следующие показатели: динамика заболеваемости, нозологическая структура, сезонность. Для определения этиологии гнойно-септических заболеваний проводились бактериологические исследования определяемого из патологических очагов, в том числе и в динамике инфекционного процесса По данным ветеринарных лечебниц гнойно-септическую патологию собак составили следующие нозологические формы заболеваний, которую мы приводим в таблице .
Исходя из данных таблицы следует, что ведущее место в структуре гнойно-септических заболеваний принадлежит болезням кожи, среди которых с наибольшей частотой встречалась пиодермия. Клинически пиодермия протекала в виде поверхностных или глубоких гнойновоспалительных процессов и чаще всего регистрировалась в теплое время года.
Наблюдения показали, что при поверхностной пиодермии в патологический процесс вовлекаются все слои эпидермиса, а также поверхностные структуры волосяных фолликулов. Излюбленным местом первичной локализации пустулезных высыпаний являются складки кожи у некоторых пород собак, а также паховая и подмышечная область. Возникающий сильный зуд сопровождается расчесами и травмами, что приводит к быстрому прогресси-рованию воспалительного процесса на другие здоровью участки кожи, быст-роразвивающиеся поражения кожи могут охватывать подгрудок, шею, хвост, нижнюю часть живота.
При глубокой пиодермии в воспалительный процесс вовлекались не только поверхностные слои, но и собственно дерма и подкожная клетчатки с образованием фурункулезных очагов. Эта форма пиодермии была как локализованной, так и генерализованной. . Следует отметить, что генерализованная форма пиодермии чаще всего ; была связана с демодекозом, что утяжеляло клиническое течение основного заболевания. При отсутствии лечения или его неэффективности пиодермия нередко осложнялась вагинитами, поститами, отитами, конъюнктивитами. В \ отдельных случаях генерализованный процесс пиодермии принимал и злокачественное течение, когда резко ухудшалось общее состояние, повышалась температура тела, вовлекались в воспалительный процесс лимфатические узлы и некоторые железы.
Второе место после пиодермии в структуре гнойно-септических заболеваний собак занимали гнойные раны, на долю которых приходилось -23,96% заболеваний. Некоторое повышение количества случаев гнойно-септических раневых заболеваний отмечалось в периоды открытия весеннего и осеннего сезонов охоты.
