Содержание к диссертации
Введение
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
2.1. Характеристика иптерферопов 12
2.2. Индукция и клетки-продуценты интерферона 14
2.2.1, Индукторы а-ИФН 15
2.2.2 Индукторы р-ИФН 16
2.2.3 Индукторы v-ИФН 17
2.3. Противовирусное действие 18
2.4 Пробнотнки, микроорганизмы-антагонисты 2S
III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
3.1 Материалы н методы. ...46
3.1.1- Вирусы 46
3.1.2, Клеточные культуры 46
3.1.3 Наборы для определения интерленкнна в ИФА 47
3.1.4. Культура бактерий 48
3.1.5. Животные 49
3.1.6. Кулыивированис вирусов 49
3.1.7. Титрование вирусов ...49
3.1.8. Титрование интерферона 5(1
3.1.9. Экспериментальная инфекция 51
3.1.10 Статистическая обработка данных 51
3.2. Изучение образования интерферона и динамики гуморальных антител у телят после введения культуры Бае. subtilis н пирус-вакцины против НРТ и ПГ-3 КРС 52
3.3. Циркуляции возбудителей ВД-БС и ИРТ-ИПВ 58
3.4. Индукция интерферона на модели герпссвирусной инфекции лошадей 1 67
3.5. Изучение динамики секреции ИЛ-6 и ИЛ-10 в органах
мышей после введения культуры Вас. subtilis и вакцины 76
IV. ОБСУЖДЕНИЕ 86
V. ВЫВОДЫ 94
VI. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 95
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96
ПРИЛОЖЕНИЕ
Введение к работе
Успешная реализация программы развития животноводства страны требует ветеринарного обеспечения в плане защиты животных от массовых инфекционных болезней. Наибольший удельный вес в инфекционной патологии молодняка сельскохозяйственных животных приходится на болезни органов дыхания и пищеварения вирусной этиологии: инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3, вирусная диарея - болезнь слизистых и др. Часто эти заболевания протекают как вирусно-бактериальные смешанные инфекции с участием пастерелл, микоплазм, диплококков и других микроорганизмов.
Эффективная борьба с названными болезнями возможна при условии сочетания мер, обеспечивающих выращивание здорового потомства с достаточно высокой резистентностью организма и напряженной иммунной защитой против основных возбудителей массовых заболеваний.
Многочисленные неблагоприятные факторы внешней среды, включающие загазованность животноводческих помещений, высокое содержание условно-патогенной микрофлоры, нарушение температурного режима и др. снижают резистентность организма в первую очередь молодых животных и затрудняют применение средств специфической профилактики. В этом случае необходимо изыскивать альтернативные методы повышения устойчивости животных к инфекции, коррекции иммунной системы путем включения в арсенал защитных средств иммуномодуляторов и пробиотиков.
Актуальность темы.
Одним из значимых событий 20 века является открытие интерферона Isaacs A., Lindeman J., 1957. В настоящее время установлен широкий спектр биологической активности интерфероновых белков, которые наряду с другими цитокинами обладают многочисленными свойствами, включая антивирусное действие, регулирование взаимодействия главных интегративных систем организма - нервной, иммунной, эндокринной.
Система интерферона не имеет специализированных клеток или органов, она существует в каждой клетке. Каждая клетка в случае вирусной инфекции должна быть защищена от заражения вирусом (Ф.И.Ершов, 1982; М. Gale et al., 1996; S.V.Kotenko et al., 2000).
Различают три основных типа интерферонов: альфа — а, бета - р и гамма - у, которые в свою очередь разделяют на интерфероны 1 и 2 типов.
Создание генно - инженерных интерферонов позволило, в
частности, выяснить ответственность каждого белка за тот или
другой защитный эффект. Так, у - интерферон является
активатором макрофагов и усиливает их противоопухолевую
активность, подавляет репликацию вирусов. При вирусной
инфекции у - интерферон (ИФН-у) вызывает изменения
поверхности клеточной мембраны, при этом защищает клетки от
проникновения вируса, нарушает внутриклеточный синтез вирусов
вследствие усиления образования фермента
олигоаденилатсинтетазы и т.д. (В.В. Рафальский, 1997).
Благодаря рекомбинантной технологии в медицинскую практику вошли чистые препараты интерферонов, обладающие широким спектром действия у человека. Не меньшее значение
феномен интерференции имеет и в ветеринарии. Однако,
вследствие ряда объективных причин, во многих случаях
использование препаратов чистых интерферонов для животных
экономически мало оправдано или неэффективно, несмотря на все
их положительные свойства в отношении антивирусного,
антибактериального, противоопухолевого действия или
гармонизации гомеостаза, в том числе иммуногенеза.
Перспективным направлением в ветеринарии, по нашему мнению,
является изыскание активных индукторов эндогенного
интерферона. В первую очередь активных природных индукторов -
защитных белков клетки. Суммарный эффект защитного действия
а - р или у - интерферонов в организме, как результат применения
удачно подобранного индуктора, может быть использован в
комплексе профилактических и лечебных мероприятий при
вирусных инфекциях сельскохозяйственных животных.
Результативность этого метода во многом зависит от биологических характеристик индуктора эндогенного интерферона (Ф.И. Ершов, О.И. Киселев, 2005).
Следовательно, разработка новых индукторов интерферона является актуальной задачей.
Весьма перспективным направлением, по нашему мнению, в плане изыскания возможных естественных индукторов интерферона и иммуномодуляторов является большая группа хорошо изученных микроорганизмов с весьма полезными свойствами- пробиотиков (Т.И. Грязнев.а, 2005).
Накопленный большой объем научной информации свидетельствует, что пробиотики относятся к числу высокоэффективных лечебно-профилактических средств (В .А. Антипов, 1991; В.Н. Бабин, 1994; В.М. Бондаренко, 1997; Н.И. Малик, 2001; А.С. Панин, 1993; Б.А. Шендеров, 1997; B.R. Goldin,
1992; J.I. Gordon, 1997;)
Эффективность этих препаратов оказалась во многих случаях настолько высокой, что ряд исследователей пришли к заключению о наступлении «эры пробиотиков».
Весьма важным обстоятельством является наличие у бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, не только антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, но и ряда других полезных свойств таких как, иммуномодулирующих, антиаллергических и др. (Р.С. Будагов, 1996; Л.Г, Войчишина, 1991; А.А. Воробьев, 1997; Т.Д. Павлюк, 1995; А.Л. Позняк, 1997; В.И. Никитенко, 1990; А.Н. Петров, 2001).
Новым направлением в конструировании и
совершенствовании пробиотиков является включение в число основных претендентов бактерий рода Bacillus (В.В. Смирнов, 2002; В.В. Смирнов, 1993; И.Б. Сорокулова, 1996; И.Б. Сорокулова, 1997; М.А. McTigue, 1995; A.L. Mendonca, 1996; М. Muscettola, 1991; М. Muscettola, 1992).
Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте животных (В.И. Никитенко, 2000; СР. Резник, 1981; СР. Резник, 1985; СР. Резник, 1991; J.E. Pennington, 1976; R. Tanaka, 1983).
Цель и задачи исследования.
Указанное определило цель нашего исследования: изыскать
доступный природный индуктор интерферона и изучить его влияние на формирование защитных реакций организма при
некоторых вирусных инфекциях животных. Задачи исследования.
Определить возможность использования Вас. subtilis в качестве индуктора интерферона и отработать методику определения интерферона, используя в качестве тест -системы культуру клеток и чувствительный к интерферону вирус ВС.
Провести экспериментальные исследования по определению образования интерферона 1 типа и гуморальных антител у телят после прививки им вируса диареи - болезни слизистых.
Определить образование гуморального иммунитета и а/р интерферона в результате прививки им вирусов ПГ-3 и ИРТ.
Изучить на лабораторной модели - мышах линии BALB/c возможность индуцирования устойчивости к ВГЛ-1; синтез интерферона 1 типа и некоторых интерлейкинов вследствие инокуляции культуры Вас. subtilis.
Научная новизна исследовании.
Выяснены особенности секреции интерферонов 1 типа у телят после введения им культуры Вас. subtilis и вакцинных штаммов вирусов: ИРТ-ИПВ, ПГ-3 и ВД-БС крупного рогатого скота. Установлено, что индукция интерферона зависит от очередности и времени введения вакцин и индуктора интерферона. Показано, что иммунный фон и присутствие спонтанного интерферона у телят существенно влияют на секрецию цитокинов. В опытах на лабораторной модели - мышах линии BALB/c впервые установлена возможность защиты от экспериментальной летальной инфекции
вирусом герпеса лошадей - 1, путем индукции у них эндогенного интерферона. Впервые получены данные, характеризующие секрецию интерлейкинов 6 и 10 в ответ на введение Вас. subtilis и ВГЛ-1.
Практическая значимость работы.
Проведенными исследованиями показана перспективность применения культуры Вас. subtilis - препарата «Сахабактисубтил» в системе лечебных и профилактических мероприятий против респираторных инфекций телят. Применение этого препарата позволяет повысить иммунный статус животных и обеспечить защиту от инфекции вследствие образования эндогенного интерферона, который является важным фактором защиты молодого организма с недостаточно сформированной иммунной системой от вирусной инфекции.
Полученные результаты использованы при разработке «Системы ветеринарно - санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации», утвержденной 17 мая 2006 года заместителем директора Департамента отраслевого развития МСХ В.А. Апалькиным.
Апробация работы.
Материалы работы были представлены на международной научно - практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» посвященной 100 - летию со дня рождения Заслуженного деятеля паук РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ
ІІкова Романовича Коваленко (Москва, 2006 г.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно-производственном совещании научных сотрудников ГНУ «Всероссийского научно - исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (Москва, 2007 г.).
Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 2 научные работы.
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 117 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы содержит 197 источников, из них 62 - зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 17 рисунками.
Характеристика иптерферопов
Интерферон - биологически активные белки или гликопротеины, продуцируемые клеткой на чужеродные агенты -вирусы, бактерии, антигенное или митогенное воздействие. Изучено более 20 интерферонов, неоднородных по структуре и биологическим свойствам, объединенных в три вида (а, р, у), объединенных в два типа (I - а и р, II - у).
В настоящее время сложилось представление о системе интерферона, объединяющей гены и их репрессоры, сами интерфероны, специфические клеточные рецепторы и, наконец, ферментные системы, активирующиеся при взаимодействии интерферонов с этими рецепторами, прежде всего РНК-зависимые 2 ,3 -олигоаденилатсинтетаза (ОАС) и протеинкиназа (ПК). (В.П. Кузнецов, 1987; Н.В. Шабалина, 1995; Е.С. Borden and LA. Ball, 1981).
Ф.И Ершов и О.И.Киселев (2005) считают, что современное представление об интерферонах заключается в следующем: ИНФ относятся к цитокинам (медиаторам иммунитета) и представлены семейством белков, обладающих антивирусной, иммуностимулирующей, и противоопухолевой активностью, что позволяет отнести их биорегуляторам широкого спектра действия и гомеостатическим агентам.
Если стимулировать соответствующие клетки каким - либо индуктором, то происходит активация генов, кодирующих белки ИФН, и трансляция-продукция этих белков. Интерферон выделяется во внеклеточное пространство и через рецепторы действует на другие клетки, В результате воздействия ИФН на рецепторы стимулируется синтез протеинов, которые обеспечивают резистентность клетки к инфекционному агенту.
Возможен перенос таких протеинов на соседние клетки, не контактирующие ни с индуктором, ни с самим ИФН.
Методами генной инженерии установлено, что интерфероны являются модификаторами иммунной реакции. Это позволило создать новую классификацию подтипов интерферонов. В обзорной работе В.В. Рафальского (1997) указывается, что а/р интерфероны в настоящее время относятся минимум к 24 различным подтипам, которые схожи между собой, однако не идентичны по своей первичной структуре (табл.1).
В противоположность этому синтез у-интерферона кодируется всего одним известным геном. Доказанное структурное родство а- и Р-ИФН соответствует функциональной схожести обоих интерферонов. Они индуцируются вирусами и используют одни и те же клеточные рецепторы, чтобы реализовать свое биологическое действие (В.П. Кузнецов, 1986; К. Von Wild, 1996. -№2.-С.6).
Свойство продуцировать интерферон в различных количествах обладают все клетки организма. Активными продуцентами интерферона служат иммунокомпетентные клетки (Шабалина Н.В. с соавт., 1995). Система интерферона обеспечивает защиту каждой клетки и поэтому не имеет ни специализированных клеток, ни специализированных органов. Таким образом, каждая клетка должна иметь систему распознавания и элиминации чужеродной генетической информации, обобщенные данные представлены в таблице 2.
Индукторы а-ИФН
Агентов, индуцирующих синтез а -ИФН, очень много. К индукторам, стимулирующим образование а-ИФН лимфоцитами, относят: опухолевые клетки; вирустрансформированные клетки; вирусиндуцированные клетки; незараженные ксеиогенные клетки. а-ИФН синтезируется в ответ на индукцию как В-клеточными митогенами, например липолисахаридом, декстрансульфатом, так и Т-клеточными, в частности ФГА. Высокоактивными индукторами а-ИФН являются микроорганизмы, в частности бактерии. Классическими индукторами а -ИФН служат вирусы. а-ИФН способны синтезировать практически все иммуноциты. Основными продуцентами а-ИФН считаются макрофаги и В-лимфоциты. Синтез ИФН осуществляется в присутствии Т-клеток фенотипа Lyt 1+2+. В ответ на воздействие туморогенных и вирусиндуцированных клеток а-ИФН синтезируют NK-клетки. Способностью к синтезу а-ИФН обладают эозинофилы, тучные клетки (И.С. Фрейндлих, 1995).
Клетки разных органов обладают свойствам индуцировать интерферон, а именно - костного мозга и лимфы, миндалин, селезенки. Клетки человека способны синтезировать а-ИФН в такой же степени, что и лейкоциты периферической крови. Динамика образования интерферона клетками лимфы и лейкоцитами крови сходная. Макрофаги, выделенные из клеток костного мозга человека, синтезируют а-ИФН в ответ на заражение вирусами или обработку низкомолекулярными соединениями (И.С. Фрейндлих, 1995) Индукторами р-ИФН служат все вещества, относящиеся к классу двуспиральных ДНК как природного (выделенные из вирусов, бактерий и дрожжей), так и синтетического происхождения (пол ири бону клеотиды). [Ї-ИФН способны индуцировать растительные полифенолы.
Основными продуцентами р-ИФН являются клетки фибробластного и эпителиоидного типа, которые отвечают синтезом ИФН в ответ на все индукторы р-ИФН. Помимо вышеупомянутых, в продукции ИФН-р могут принимать участие и клетки иммунной системы. Лейкоциты периферической крови, В ответ на митогенную стимуляцию, также способны синтезировать Р-ИФН. Способностью синтезировать р-ИФН обладают В- и Т-лимфобластоидные линии клеток в ответ на вирусную стимуляцию.
Одним из существенных различий между ИФН 1-го типа и ИФН типа II (у-ИФН) является то, что индукторы типа I действуют на многие виды клеток, а индукторы типа II только на иммунокомпетентные (Н.М. Грачева с соавт., 1996).
Основными продуцентами у-ИФН являются Т-лимфоциты CD4+, то есть Т-хелперы 1-го типа (ТЫ) (Н.М. Грачева с соавт., 1996). Процесс синтеза зависит от присутствия вспомогательных клеток, в основном моноцитов и макрофагов. Последние не вырабатывают у-ИФН непосредственно сами, но в их присутствии синтез этого лимфокина резко усиливается. Также, помимо Т-лимфоцитов, возможными продуцентами у-ИФН могут быть В-лимфоциты в присутствии вспомогательных клеток. Показана роль дендритных клеток в качестве вспомогательных при синтезе у-ИФН тонзиллоцитами.
Материалы н методы
В работе использовали вакцинные штаммы вирусов ИРТ - ИПВ штамм «ТК - А (ВИЭВ)В-2», ПГ-3 штамм «ПТК-45/86» (Н,Н.Крюков с соавт.) и ВД-БС штамм «BK-I (BI)» (Жидков С.А. и Крюков Н.Н), применяемые в производстве коммерческих вакцин, разработанных в ВИЭВ, лабораторный штамм вируса везикулярного стоматита штамм «Индиана», вирус риноппевмонии лошадей (ВГЛ1) - штамм «ПП/1», адаптированный к белым мышам (С-В, Алексееикова с соавт,, 2003-2006гг.). Вакцины использовали в дозах по 2,0x5,0 logTCDso/nil. внутримышечно.
Для культивирования вирусов использовали перевиваемые клеточные культуры: почки кролика (RK-13), почки телёнка (MDBK) и семенники телёнка (СТ). Культуры клеток выращивали на среде Игла MEM (производства ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им, М.П, Чумакова РАМН») с добавлением 2мМ глутамина, 5% сыворотки крови КРС для культур клеток (производства ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ), пенициллина по 100 ЕД/мл. и стрептомицина по 100 мкг/мл.
Набор иммуноферментного анализа для определения мышиного ИЛ-6 (Innovation On The Move, mouse IL-6 ELISA, BMS 603) и мышиного ИЛ-10 (Innovation On The Move, mouse IL-10 ELISA, BMS 614) производство фирмы «Bender Med System» Вена, Австрия.
Перед постановкой опыта, предварительно строили калибровочную кривую, для этого использовали калибровочные растворы ИЛ-6 и ИЛ-10 из соответствующих коммерческих наборов.
Принцип теста
1. Мышиный анти-ИЛ-6 (anti-rnIL-б) моноклональные антитела адсорбируют на микропланшеты,
2. Мышиный анти-ИЛ-6 (mTL-б) презентированы (показаны) в образце (стандарте), связываются с антителами которые были адсорбированы на микропланшеты добавляют Биотинированные мышиные анти-ИЛ-6 антитела, конъюгированные с Биотипом (Biotin-Conjugate), которые связываются с мышиным ИЛ-6, которые в свою очередь уже связались с первичными антителами,
3. Проводится трехкратная промывка промывочным буфером (Wash Buffer) для удаления не связавшихся Биотинированных антител, затем добавляется Стрептовидин-пероксидаза (Streptavidin-HRP),
4. Проводится трехкратная промывка промывочным буфером (Wash Buffer) для удаления не связавшихся Стрелтовидинилированных антител, после этого добавляют хромогенный субстрат (ТМВ Substrate Solution),
5. Реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты.
6. Учет реакции проводили спектрофотометрически при длине волны 450 нм.
Принцип постановки теста на ИЛ-10 аналогичен принципу постановке теста на ИЛ-6,
Культура Вас. subtil is с концентрацией 5 млрд м.к,/мл-препарат «Сахабактисубтил» на основе штаммов «ТНП-3» и «ТНП-5», выращенных на твердой питательной среде и суспензированных в физиологическом растворе хлорида натрия, с концентрацией 5 млрд. живых м.к./мл. Препарат применяли подкожно по 2,0 мл. или внутрь по 10 мл. телятам, и по 10-20 мкл- подкожно белым мышам.
