Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Краткая характеристика Т-, В- и А- систем иммунитета 9
1.1.1. Иммунокомпетентные клетки 10
1.1.2. Повышенная чувствительность замедленного типа в противотуберкулезном иммунитете 14
1.1.3. Взаимосвязи в системе иммунитета 20
1.2. Атипичные микобактерии и их роль в эпизоотологии туберкулеза 24
1.3. Экономическое значение неспецифических реакций на туберкулин.. 32
1.4. Заключение к обзору литературы 34
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
2.1. Материалы и методы исследования 36
2.2. Региональные особенности эпизоотологии неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота скота и обоснование схемы борьбы с ними 38
2.3. Иммунный статус у морских свинок, зараженных М. bovis и М. phlei 43
2.3.1. Клеточные реакции у морских свинок, зараженных М. bovis и М. phlei 43
2.3.2. Взаимосвязи в системе иммунитета у морских свинок, зараженных М. bovis и М. phlei 48
2.4. Парааллергические реакции у морских свинок, ранее привитых вакциной БЦЖ 61
2.5. Оценка иммунного статуса на основе взаимосвязей в системе иммунитета у крупного рогатого скота, инфицированного атипичными 62 микобактериями
2.6. Оценка иммунного статуса у коров, нереагирующих на ППД- туберкулин, и привитых вакциной БЦЖ 66
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 80
4. ВЫВОДЫ 87
5. ПРАКТИЧЕСІСИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 88
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90
ПРИЛОЖЕНИЕ 119
- Краткая характеристика Т-, В- и А- систем иммунитета
- Атипичные микобактерии и их роль в эпизоотологии туберкулеза
- Материалы и методы исследования
Введение к работе
Актуальность темы. Туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии в большинстве стран мира, включая Россию. Несмотря на проводимые профилактические и оздоровительные мероприятия, эпизоотическая ситуация по этой болезни остается напряженной и даже чревата осложнениями.
Основным методом прижизненной диагностики туберкулеза является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих. Однако часто возникают неспецифические или парааллерги-ческие реакции на туберкулин, обусловливающие неясность эпизоотической ситуации, необоснованный убой продуктивных животных, потерю продукции и приплода, ограничение племенной работы, а также дополнительные затраты на дифференциальную диагностику.
Большинство исследователей (Т.Н. Байтерякова, Ю.А. Макаров, 1982; Л.М. Каримова, Б.Я. Хайкин, 1987; Н.М. Колычев и др., 1990; Л.М. Каримова, 1998; Ю.Ю. Данко, 2000; А.И. Завгородний, 2000; Н.П. Овдиенко и др. 2002; А.С. Донченко и др., 2004;), основной причиной появления парааллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, считают сенсибилизацию организма животных атипичными микобактериями.
В.М. Авилов и др., 1997, считают, что возникновение проблемы неспецифических реакций на туберкулин в неблагополучных по туберкулезу зонах свидетельствует об улучшении эпизоотической ситуации, также установлено, что инфицированность животных ассоциациями атипичных микобактерий сдерживает развитие патологического процесса, вызванного M.bovis, повышает защитные свойства вакцины БЦЖ и дает неопределенные результаты симультанной пробы с ППД туберкулином для млекопитающих и КАМ (СЮ. Быкова, 1994). Атипичные микобактерий обладают иммуногенными свойствами и под-
5 держивают противотуберкулезный иммунитет у животных в стадах, где одновременно персистируют атипичные и патогенные микобактерии (Н.Г. Кассирская, Д.Д. Меньшиков, 1965; М.П. Зыков, Т.Б. Ильина, 1978; О.В. Мартма, К.К. Тяхнас, 1986; А.А. Бойко, Е.П. Сапегина, 1991).
Совершенствование методов и средств профилактики микобактериозов может основываться на знаниях иммунного статуса здоровых животных и инфицированных различными видами микобактерии. Иммунная система - это большая сложная система, компоненты которой ориентированы на выполнение единой цели, подчиняются законам функционирования больших систем и работают как единое целое. Она может функционировать в двух принципиально различающихся режимах: спокойного функционирования, достаточного для поддержания внутренней среды организма, и активной борьбы с внедрившимся чужеродным при воспалительном процессе (К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, 2003).
Открытие ведущей роли Т- и В-лимфоцитов в иммунитете, их клеточной кооперации с макрофагами, разработка методов идентификации иммунокомпе-тентных клеток создают возможность более объективной оценки иммунного статуса животных. Контроль за изменениями в иммунной системе может осуществляться с помощью математического моделирования состояний, сущность которого состоит в том, что в системе выделяются несколько доминирующих для того или иного состояния компонентов и создают на их основе математическую модель, которая представляет собой уравнение или систему уравнений, связывающие несколько показателей в единое целое (Г.И. Марчук, Р.В. Петров, 1982; Г.И. Марчук, Л.Н. Белых, 1986). Исходя из этого, авторами предложен вариант регрессионного анализа - метод группировки иммунологических параметров (дискретно-динамический анализ), позволяющий описать иммунный статус животных на основе взаимосвязей параметров.
В последующем на основе выявленных сочетаний параметров с различными взаимосвязями в иммунной системе, составляют дифференциально-прогностические таблицы, с помощью которых прогнозируют формирование
протективного иммунитета или патологии (М.А. Бажин, 1995; М.А. Бажин, B.C. Власенко, А.Н. Новиков, 2003).
Однако исследования иммунного статуса крупного рогатого скота, инфицированного различными видами микобактерий, на основе данного метода ранее не изучались.
Цель и задачи исследований. Цель - определить иммунный статус и взаимосвязи в системе иммунитета у животных, инфицированных различными видами микобактерий, и обосновать возможность его практического использования в целях профилактики микобактериозов у крупного рогатого скота. Для достижения цели поставлены следующие задачи:
определить иммунный статус у морских свинок, зараженных М. bovis и М. phlei на основе взаимосвязей иммунологических параметров;
изучить парааллергические реакции у морских свинок, ранее привитых вакциной БЦЖ;
определить иммунный статус у крупного рогатого скота, инфицированного атипичными микобактериями, на основе взаимосвязей иммунологических параметров;
определить иммунный статус у коров, нереагирующих и реагирующих на ППД-туберкулин, а также у привитых вакциной БЦЖ;
Научная новизна. С использованием иммунологических, а также корреляционного и регрессионного методов исследований определен иммунный статус у животных, инфицированных различными видами микобактерий. Установлен уровень иммунокомпетентных клеток в периферической крови и впервые изучены взаимосвязи в системе иммунитета у животных, инфицированных различными видами микобактерий. Установлено, что число животных с повышенной активностью иммунокомпетентных клеток увеличивается.
Установлена роль вакцины БЦЖ на формирование иммунитета, способствующего подавлению парааллергических реакций у животных, инфицированных атипичными микобактериями.
Определены критерии оценки благополучия ферм по туберкулезу, позволяющие снять ограничения при наличии в стаде животных, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих.
Практическая и теоретическая значимость. Эпизоотологически и иммунологически обоснована возможность совершенствования методов профилактики микобактериозов крупного рогатого скота. По материалам составлена заявка на изобретение "Способ профилактики парааллергических реакций".
Также установлена возможность снятия ограничений по туберкулезу крупного рогатого скота при наличии в стаде животных, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, которая включает получение четырехкратных отрицательных результатов патологоанатомических и бактериологических исследований биоматериала от реагирующего крупного рогатого скота.
Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых Сибирского региона, посвященной 175-летию Сибирской аграрной науки (Омск, 2003г.); Международной научной конференции, посвященной 175-летию аграрной науки Сибири (Омск, 2003г.); Международной научно-практической конференции "Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных" (Москва, 2003г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук (Омск, 2004г.); Международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию профессора Н.Г. Кондюрина (Омск, 2004г.); Четвертой межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины" (Омск, 2005г.).
Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 119 страницах компьютерного набора и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и приложение. Список литературы включает 287 источников, в
*
8 том числе 215 отечественных и 72 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами, 4 рисунками. На защиту выносится:
Материалы по изучению иммунного статуса на основе взаимосвязей в системе иммунитета у животных инфицированных различными видами микобактерий.
Возможность профилактики микобактериозов крупного рогатого скота и определение критериев оценки благополучия ферм по туберкулезу.
Краткая характеристика Т-, В- и А- систем иммунитета
Иммунную систему рассматривают как совокупность лимфоцитов, макрофагов, ряд сходных с макрофагами клеток (дендритные; эпителиальные, клетки Лангерганса), а также специализированные эпителиальные клетки лим-фоидных органов (У. Пол, 1987). Клеточный состав формируется за счет дифференцировки единого предшественника - гемопоэтической стволовой клетки, находящейся в костном мозге. Каждая стволовая клетка дает начало всем росткам дифференцировки клеток лимфоидной и миелоидной ткани (В.Г. Галактионов, 1986; P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 2000; С. Janeway et al., 1997).
Клеточные элементы иммунной системы организованы в тканевые и органные структуры, которые делятся на центральные и периферические. К центральным органам иммунной системы относят тимус (вилочковая железа — место генерации Т-клеток) и сумку Фабрициуса у птиц или аналог этого органа у млекопитающих. Предположительно таким аналогом является костный мозг (место генерации В-клеток). К периферическим органам иммунной системы относятся лимфатические узлы, селезенка, пейеровы бляшки кишечника, лимфа и кровь (У. Пол, 1987; В.Г. Галактионов, 1986).
Иммунологическую функцию в организме в основном выполняют специализированные и относительно самостоятельные системы клеток и органов. Система лимфоидных клеток генерализована по организму, в отличие от системы органов её элементам свойственно рециркулировать, пролиферировать, дифференцироваться и продуцировать специфические антитела в ответ на стимуляцию организма антигеном (П.Д. Горизонтов, 1981; Р.В. Петров, 1982 ).
В связи с этим в настоящее время центральным звеном иммунитета признана лимфоцитарная система (Э. Купер, 1980; С. Martin, 1985), структурным элементом которой является лимфоцит. Работами ряда учёных (Р.В. Петров, А.Н. Чередеев, 1974; А.Н. Чередеев, 1976; R. Stewart, 1985) установлено, что лимфоциты крови подразделяются на 2 категории: тимусзависимые (Т-лимфоциты) и тимуснезависимые (В-лимфоциты). При этом Т-лимфоциты осуществляют реализацию клеточного иммунитета и В-лимфоциты гуморального иммунитета. Клеточным представителем Т-системы является тимусзависимый лимфоцит, характеризующийся определенной морфологией, наличием соответствующих рецепторов и маркеров на клеточной поверхности, а также специфическим гистогенезом от стволовой кроветворной клетки. В-клетки, так же как и Т-клетки, изучены по морфологии, рецепторам и маркерам клеточной поверхности, гистогенезу (В.Г. Галактионов, 1986).
Иммунитет долгое время представлялся как состояние невосприимчивости организма к инфекционным заболеваниям (Э. Купер, 1980). Но в последнее время это понятие дополнено тем, что он обусловлен взаимосвязанными биологическими процессами, которые направлены на восстановление нарушенного иммунного гомеостаза (П.Д. Горизонтов, 1981).
Академиком Р.В. Петровым иммунная система представлена как совокупность всех лимфоидных органов и клеток, а сам иммунитет - как свойство организма защищаться от веществ, несущих на себе признаки генетически чужеродной информации (Р.В. Петров, 1976, 1982; P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 2000). Таким образом, в совокупности и взаимосвязи они и составляют единый орган иммунитета.
Атипичные микобактерии и их роль в эпизоотологии туберкулеза
В 30-х годах XX века, появляются сообщения о выделении от человека микобактерии, которые быстро росли, иногда образовывали пигмент и не были патогенными для морских свинок. Микобактерии, которые по своим свойствам отличались от возбудителей туберкулеза, стали называть атипичными, неклассифицированными, неидентифицированными, анонимными или оппортунистическими (Ю. К. Вейсфейлер, 1975).
Атипичные микобактерии не отличаются от возбудителя туберкулеза по морфологическим и тинкториальным свойствам, но отличаются по культураль-ным, биохимическим и вирулентным (А.И. Каграманов, 1979), и атипичные микобактерии считают самостоятельным видом микобактерии (L. Wayne 1971). Атипичные микобактерии приближаются по культурально-морфологическим, ферментативным и патогенным свойствам к М. avium и происходят из этого вида, так как при пассаже на курах они теряют пигмент, патогенные свойства их становятся более выраженными и неотличимыми от свойств возбудителя туберкулеза птичьего вида (Л. А. Ищенко, 1973).
Используя различные свойства микобактерии, многие исследователи предпринимали попытки систематики микобактерии (М.М. Дыхно, 1964; Р.А. Лотоцкая, 1977; В.И. Ротов, 1978; Т.Б. Ильина, 1980; Т.И. Козулицина и соавт., 1980; Т.М. Байтерякова, Р.Х. Зайнулина, 1981; A.M. Кадочкин, А.В. Ткачев-Кузьмин, 1983; Е. Runion, 1959; Н. Nagayama et al., 1961; R. Bonicke, 1962; M. Buraczewska, 1963; C. Collins, 1966; W. Kappler, 1966; R. Ollar, 1994; M. Pereira et al., 1996).
М.П. Зыков, Т.Б. Ильина (1978) указывают на то, что в разные периоды существовали классификации, основанные на генетическом родстве микобактерии, а также базирующиеся на биохимических свойствах микобактерии и математическом методе сравнения отдельных свойств. Вместе с тем, с момента первого упоминания о микобактериях и до настоящего времени не удалось разработать универсальной классификации рода микобактерии.
Наиболее популярной является классификация Е. Runyon (1959), которая учитывает образование каротиноидных пигментов и скорость роста микобактерии (О. Meissner, A. Schmiedel, 1967). По этой классификации выделяются 4 группы микобактерии в соответствии с их скоростью роста на питательных средах и способностью образовывать желтый или оранжевый пигмент колоний на свету:
-фотохромогенные (образующие каротиноидные пигменты на свету);
-скотохромогенные (формирующие каротиноидные пигменты в темноте);
-нефотохромогенные (не образующие пигмента), быстрорастущие, кислотоустойчивые сапрофиты.
Дальнейшее изучение атипичных микобактерий было связано, в основном, со способностью их вызывать сенсибилизацию организма животных к ППД-туберкулину для млекопитающих, на который реакции по интенсивности и характеру не отличались от специфических (А.С. Донченко, 1980; Н.П. Овдиенко и др., 1980; Л.А. Ищенко, Л.Н. Коршунова, 1983; A.M. Кадочкин, А.В. Ткачев-Кузьмин, 1983; М.В. Харитонов, 1983; A.M. Кадочкин, 1984; В.Е. Щуревский и др., 1984; И.И. Румачик, А.А. Солоненко, 1984; В.Н. Кудяков, 1984; Ю.Я. Кассич и др., 1985; Н.М. Мандро и соавт., 1985; В.П. Урбан и др.., 1986; Л.М. Ходун, 1988; А.Н. Керимжанова, 1991; I. Kazda, 1967; I. Meszaraz, 1967; Н. Mets, 1971; J. Nassal et. al., 1974; P. Saurat, 1975; E. Fodstad, 1977 и др.).
Атипичные микобактерий широко распространены в природе, в том числе в организме животных и птиц. При обследовании крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин для млекопитающих, наряду с патогенными микобактериями туберкулеза, выделяли атипичные (Н.К. Чурбаков, 1967; B.C. Тырина, 1968; А.Н. Байгазанов, 1986; Л.В. Погуляева, Т.А. Беспалова, 1991; И.П. Фоминов, 1997; R. Wozikowski, 1984; L. Dvorska et. al., 1999).
От реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, выделяли М. fortuitum, М. terrae, М. scrofulacetum, М. aquvae и другие атипичные микобактерий (О. МогеШ et. al. 1982), в 40,0% случаев атипичные микобактерий выделял В.Н. Кудяков (1984), 47 (24,8%) выделяемых культур атипичных микобактерий, которые идентифицировали как микобактерий комплекса avium-intracellulare-18, М. terraeriviale-9, М. fortuitum-8., М. smegmatis-4, М. phlei-4, М. scrofulac-etum-2, М. gordonae-1, М. vaccae -1 (Н.П. Овдиенко и соавт., 1989). Аналогич 27 ные виды атипичных микобактерий обнаруживали и в объектах внешней среды. Наиболее частой причиной парааллергических реакций является сенсибилизация организма животных М. intracellulare 30,6%, М. avium 15,3%, М. vaccae 14%, М. phlei 6,5% (Г.А. Юдин, 1987).
Существуют данные, что атипичные микобактерий выделяют от крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин, как в благополучных, так и в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах (О.В. Мартма, К.К. Тяхнас, 1983; Л.М. Каримова, Б.Я. Хайкин, 1987; Л.В. Погуляева, Л.А. Ильиных, 1988; А.С. Донченко, 1989; Л.М. Ходун и соавт., 1990; Л.В. Погуляева, Т.А. Беспалова, 1991; Ю.Я. Кассич, 1991; Н.С. Боганец и соавт., 1997; Л.М. Каримова, 1998).
Крупный рогатый скот в прибалтийских республиках сенсибилизируют к ППД-туберкулину для млекопитающих, в основном микобактерий, принадлежащие к комплексу avium-intracellulare — 64% случаев (О.В. Мартма, 1982; О.В. Мартма, К.К. Тяхнас, 1986).
В Белорусской ССР из материала, отобранного от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, выделили только атипичные микобактерий, принадлежавшие к 4-й группе по Раньону. При исследовании биоматериала от реагирующих коров в хозяйствах Ивано-Франковской области в 2,1% случаев выделяли атипичные микобактерий, которые также отнесены к 4-й группе по Раньону (И.И. Румачик и А.А. Солоненко, 1984)..
При исследовании 22 проб биоматериала от реагировавших на ППД-туберкулин для млекопитающих животных в Дагестане, Северной Осетии, Чечни и Краснодарском крае, в 12,2% случаев выделяли атипичные микобактерий. Из них 51,3% относились ко 2-й группе, 4,2% -к 3-й и 44,5% -к 4-й группе по классификации Раньона, среди выделенных культур основная масса относилась к М. scrofulacetum, М. gorgonae, М. smegmatis и М. fortuitum (И.В. Эфендиева и соавт., 2001).
Материалы и методы исследования
Настоящая работа выполнена в отделе туберкулеза ГНУ Всероссийский научно - исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (ВНИИБТЖ) Сибирского отделения Россельхозакадемии, секторе иммунитета и специфической профилактики туберкулеза, ОПХ и хозяйствах Омской области, в период 2001 - 2004 г.г. по заданию НИР 02.01.08. «Разработать новые методы иммунологической защиты животных на основе применения молекулярных препаратов и методов оценки иммунологических феноменов».
Эпизоотическую ситуацию по туберкулезу крупного рогатого скота, в том числе распространение неспецифических туберкулиновых реакций, изучали по данным ветеринарной отчетности и на основании материалов собственных аллергических и бактериологических исследований. Использованы также данные мясоперерабатывающих предприятий.
Материалом для исследования служила периферическая кровь 110 голов: из них 100 коров и 10 молодняка крупного рогатого скота, 90 из благополучных и 20 из неблагополучных по туберкулезу хозяйств. В опытах с заражением культурами возбудителя бычьего вида и атипичными микобактериями всего использовано 109 морских свинок, массой 350-400г.
Лабораторных животных содержали в условиях вивария, кормление осуществляли согласно нормам рациона для лабораторных животных (Е.А. Финкель, Л.В. Михайлова, 1976). За подопытными животными вели постоянное наблюдение, в опыт брали только клинически здоровых животных.
Для аллергических исследований использовали ППД-туберкулин для млекопитающих производства Курской биологической фабрики.
Лабораторных животных заражали культурами полевых производственных штаммов М. bovis (шт. 14), М. phlei и смесью атипичных микобактерий, изолированных во ВНИИБТЖ от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств региона Сибири.
Количество Т-лимфоцитов в периферической крови определяли с помощью реакции спонтанного розеткообразования (Е-рок); лимфоцитов- киллеров - реакцией непрямого глобулинового розеткообразования (ЕА-рок); В-лимфоцитов - реакцией комплементарного розеткообразования (ЕАС-рок); им-мунокомпетентные клетки, распознающие антигены микобактерий, с помощью розеткообразования с эритроцитами быка (ЕТ-рок), адсорбировавшими ППД-туберкулин (М.А. Бажин с соавт.,1989).
Окраску мазков крови, подсчет лейкоцитов и выведение лейкоцитарной формулы проводили по общепринятым методикам.
Анализ данных, полученных в экспериментальных исследованиях, проводили с помощью корреляционного и дискретно-динамического анализа, сущность которого состоит в том, что исследуемую группу животных делят по значению одного из параметров, принятого в качестве базисного, на три приблизительно равные по величине группе. В 1-ю входят животные с минимальными значениями базисного параметра, во П-ю - с максимальными и в Ш-ю - со средними значениями. В каждой подгруппе рассчитывают среднее значение остальных (вариабельных) параметров. В тех случаях, когда средние значения вариабельного параметра в подгруппах с минимальными и максимальными значениями базисного параметра достоверно различаются, констатируют наличие взаимосвязей между данными базисного и вариабельного параметрами. Взаимосвязь положительна, если при увеличении базисного параметра уровень вариабельного также увеличивается; отрицательна, если при увеличении базисного параметра уровень вариабельного снижается. В работе использованы две подгруппы - с минимальными и максимальными значениями, так как подгруппа со средними значениями существенно не отражает взаимосвязь исследуемых параметров. Для оценки существенности различий между двумя средними величинами Мх и Му использовали t-критерий по Стьюденту (В.Ю. Урбах, 1964; А.Т. Усович, П.Т.Лебедев,1970). Экономический ущерб определили по методике Ю.И. Смолянинова с соавт. (2004).
