Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1.Возбудитель туберкулеза и его основные свойства 11
1.2. Методы диагностики туберкулеза животных 13
1.3. Бактериологическая диагностика туберкулеза
1.3.1. Бактериоскопический метод 17
1.3.2. Культивирование микобактерий на питательных средах
1.3.2.1. Консервирование, хранение и предварительная обработка биологического материала 24
1.3.2.2. Питательные среды и их совершенствование 33
1.3.3. Биологическая проба на лабораторных животных 51
2. Собственные исследования 60
2.1. Материал и методы исследований 60
2.1.1. Место и сроки выполнения работы 60
2.1,2. Соответствие работы тематическим планам НИР 60
2.1.3. Гносеология работы 61
2.1.4. Сельскохозяйственные и лабораторные животные 61
2.1.5. Культуры микобактерий 61
2.1.6. Диагностические препараты 62
2.1.7. Экспериментально-производственные хозяйства 63
2.1.8. Мясоперерабатывающие предприятия 64
2.1.9. Основные лабораторные приборы и оборудование 2.1.10. Питательные среды 65
2.1.11. Объемы диагностических исследований 65
2.1.12. Первичная документация 65
2.1.13. Методы и методики исследований 67
2.1.14. Экономическая эффективность научных разработок 69
2.1.15. Математическая обработка экспериментальных данных з
3. Результаты исследований 70
3.1. Уровень бактериологической диагностики туберкулеза животных в РФ 70
3.2. Видовой спектр микобактерий, изолированных от крупного рогатого скота и из внешней среды в регионе Сибири
3.2.1. Частота изоляции и видовой состав микобактерий 75
3.2.2. Коллекция музейных эпизоотических штаммов микобактерий 81
3.2.3. Характеристика культуры М. bovis, шт. 14 (ВНИИБТЖ) 83
3.3. Усовершенствование культуралыюго метода бактериологического исследования 89
3.3.1. Влияние методов консервирования биологического материала на высеваемость микобактерий 89
3.3.2. Сравнительная оценка методов предварительной обработки биологического материала 94
3.3.3. Эффективность различных видов пробок при хранении культур микобактерий 99
3.3.4. Влияние различных концентраций серной кислоты на высевае
мость микобактерий из биологического материала 103
3.3.5. Информативность плотных питательных сред при культивировании разных видов микобактерий 107
3.3.6. Информативность плотных питательных сред с использованиСхМ химических и биологических добавок 115
3.3.7. Совершенствование технологии приготовления плотных питательных сред 121
3.4. Усовершенствование биологического метода диагностики туберкулеза 131
3.4.1. Чувствительность белых мышей к М. bovis 131
3.4.2. Эффективность интратестикулярного заражения морских свинок 135
3.4.3. Ускоренная постановка биологической пробы на морских свинках в диагностике туберкулеза животных на основе феномена Коха 1 3.4.3.1. Теоретическое обоснование 140
3.4.3.2. Летальная доза туберкулина для здоровых морских свинок 143
3.4.3.3. Летальная доза туберкулина для морских свинок,
зараженных М. bovis 147
3.4.3.4. Оптимальный срок введения туберкулина, вызывающий гибель зараженных М. bovis морских свинок 153
3.4.3.5. Летальность морских свинок после введения туберкулина в зависимости от дозы заражения культурой М. bovis 157
3.4.4. Методика ускоренной постановки биологической пробы на туберкулез 159
3.4.5. Комиссионное производственное испытание метода ускоренной постановки биологической пробы на туберкулез 165
3.4.6. Экономическая эффективность метода ускоренной постановки
биологической пробы на туберкулез 172
4. Обсуждение результатов исследований 174
5. Выводы 193
6. Практические предложения 196
7. Список литературы
- Культивирование микобактерий на питательных средах
- Соответствие работы тематическим планам НИР
- Частота изоляции и видовой состав микобактерий
- Методика ускоренной постановки биологической пробы на туберкулез
Культивирование микобактерий на питательных средах
Основными методами первичной диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных являются патологоанатомический и бактериологический, результаты которых предопределяют окончательный эпизоотический статус хозяйства (фермы, стада). Заболевание туберкулезом считается установленным, если диагноз подтверждается данными патологоанатомических исследований внутренних органов и лимфатических узлов, а при отсутствии характерных для туберкулеза видимых изменений - положительными результатами бактериологического исследования биологического материала.
Основы бактериологической диагностики туберкулеза разработаны еще в 30-50 годы прошлого столетия в медицине. В дальнейшем эти методы стали широко использовать в ветеринарной бактериологической практике, но с тех пор они не претерпели существенных изменений.
В соответствии с нормативно-законодательными положениями при туберкулезе животных для первичной постановки диагноза необходимо выявить специфические туберкулезные изменения в органах и тканях убитых с диагностической целью животных, реагирующих на туберкулин, или выделить культуру возбудителя туберкулеза бычьего или человеческого вида. Таким образом, решающими в эпизоотической оценке хозяйства (фермы, стада) по туберкулезу являются результаты патологоанатомических и бактериологических исследований.
В ряде стран эти методы являются основными в первичной диагностике туберкулеза животных. Так, в Швеции с 1970, а в Нидерландах — с 1980 года ту-беркулинизацию крупного рогатого скота не проводят и осуществляют контроль диагностики только на бойнях (G. Bjorkman, 1982; М. Nielsen, 1982). В Канаде также проводят диагностический контроль на бойнях, однако при обнаружении поражений, характерных для туберкулеза, подтверждают диагноз комплексным бактериологическим исследованием биоматериала (Agrinevs, 1979; The Canad. Vet., 1980; В.П. Шишков с соавт., 1986). Следует отметить, что довольно часто при диагностическом убое реагирующих на туберкулин животных характерных для туберкулеза изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаруживают, однако при бактериологическом исследовании биоматериала выделяют возбудителя туберкулеза. В таких случаях бактериологический метод постановки диагноза на туберкулез становится решающим.
Учитывая важность бактериологического исследования в системе противотуберкулезных мероприятий, B.C. Федосеев и др. (1988, 1991) вводят понятия «микробиологический мониторинг», и «микробиологический надзор» позволяющие не только проводить индикацию возбудителя, но и отслеживать его биологические свойства и прогнозировать течение туберкулеза животных. Бактериологическое исследование биоматериала на туберкулез включает в себя ряд последовательных, дополняющих друг друга этапов (методов), направленных на повышение информативности и всесторонней оценки выделенной культуры возбудителя туберкулеза.
При бактериологическом исследовании на туберкулез используют три основных метода: бактериоскопический, культивирование на питательных средах (собственно бактериологический) и биологический (биологическая проба на лабораторных животных).
Бактериоскопический метод основан на обнаружении микобактерий в мазках отпечатках или мазках, приготовленных из суспензии исследуемого материала в обычном световом микроскопе. В целом бактериоскопический метод является ориентировочным, так как по его результатам официально подтвердить или исключить туберкулез нельзя.
Для получения положительных результатов микроскопии мазка необходимо наличие в 1 мл биологического материала не менее 50-100 тыс. микобактерий (Ф.В. Шебанов, 1969; В.Н. Васильев, 1971; Т.Н. Ященко, И.С. Meчева, 1973), поэтому их количество в мазке тесно связано с их концентрацией в исследуемом материале (К. Томан, 1980). Эксперименты показали, что при концентрации микобактерий в пробе ниже определенного значения вероятность переноса их в мазок и дальнейшее микроскопическое выявление приближается к нулю.
По данным М. Tsucamura. Н. Toyma (1984), результаты микроскопии совпадают с результатами культурального метода только в 3,3% случаев. Обнаружение в очагах поражения видимых, но не растущих микобактерий авторы объясняют их нежизнеспособностью.
В отличие от других микроорганизмов состав микобактерий характеризуется высоким содержанием липндов (от 30,6 до 38,9%), вследствие чего они медленно воспринимают анилиновые красители. Микобактерий плохо окрашиваются по Грамму, однако, восприняв окраску, не обесцвечиваются этанолом, приобретая темно-фиолетовый цвет. Поэтому их принято считать грам пол ожи-тельными, хотя логичнее относить ни к тем, ни к другим. С трудностями окраски микобактерий впервые столкнулся еще Р. Кох, сумевший разглядеть их в мазках из мокроты больного человека только после 24-30 часов инкубации в щелочном растворе метиленовой синьки (А.Н. Маянский, 2000).
Способы избирательной окраски микобактерий основаны на так называемой «кислотоустойчивости», включающей два этапа - повышение проницаемости клеточной стенки для насыщения раствором красителя (расплавление жиро-воскового слоя прогреванием или протравливанием детергентами) и промывание препарата раствором кислоты. Обесцвечивая другие бактериальные клетки, этот прием сохраняет окраску микобактерий.
Наиболее распространены следующие способы окраски микобактерий: Ци-ля-Нильсена, Муха, Муха-Вейсса, Шпенглера (Справочник фтизиатра, 1975). В медицинской и ветеринарной бактериологической практике наибольшее распространение получил метод окраски микобактерий по Цилю-Нильсену (в модификации Хузе).
Соответствие работы тематическим планам НИР
Благополучные и неблагополучные по туберкулезу. Использовались в работе как модельные, в которых проводили аллергические исследования, диагностический убой реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, отбор проб биоматериала для индикации патогенных возбудителей туберкулеза и атипичных микобактерий с последующим изучением их свойств и видовой принадлежности, а также отработки разрабатываемого метода ускоренной постановки биологической пробы.
Омская область: свинокомплекс «Лузинский», Троицкое, конезавод «Омский», Знамя, Заря, Милоградовское, Камышловское, Хомутинское, Соловецкое, Охотниковский, Малиновский, Сибиряк, Ермак, Иконниковское, Соляное, Звонаревкутское, Боевое, Россия, Родная Долина, Истоки.
Плотные: Левенштейна-Иенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-ЗЛ, Петранья-ни, «Новая» (Г.Г. Мордовской); жидкие — Сотона, Школьниковой (казеиново-солевая), Павловского (глицериновый картофель). Кроме того, использовали мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА).
1. Статистико-аиалитический. Использован при анализе эпизоотической ситуации и уровня бактериологической диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных в РФ.
2. Аллергический — на крупном рогатом скоте и других видах животных благополучных и неблагополучных по туберкулезу экспериментальных хозяйств и опытных лабораторных животных, зараженных вирулентными культурами возбудителя туберкулеза, атипичными микобактериями и биоматериалом . Исследования проведены согласно «Наставлению по применению (ППД) туберкули-нов для млекопитающих и для птиц» (1999) и «Наставлению по применению сухого очищенного комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) в симультанной аллергической пробе при диагностике туберкулеза у животных (1986).
3. Патологоапатомический. На крупном рогатом скоте - для сканирования результатов аллергических исследований на туберкулез и отбора проб биологического материала; на лабораторных животных - при проведении опытов с заражением культурами микобактерий. Метод использован согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных» (1986, 2002).
Экспертизе, с отбором проб биоматериала, подвергали лимфатические узлы (подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные, портальные, мезен-териальные, предлопаточные, надвымянные, паховые, коленной складки и др.) и внутренние паренхиматозные органы (легкие, печень, почки, селезенка). Индекс пораженное туберкулезом внутренних органов разных видов лабораторных животных (белые мыши, морские свинки, кролики) определяли по методикам А.И. Тогуновой (1965) и Ю.К. Вейсфсйлера (1975), А.А. Триус (1976), Feldman(1943).
4. Бактериологический (микроскопический, культуральный, биологический) — в соответствие с нормативно-технической документацией: «Наставление по диагностике туберкулеза животных» (1986, 2002), «Методы лабораторной диагностики туберкулеза», ГОСТ 26072-89 (СТ СЭВ 3457-81),
5. Кулыпуралъио-биохимические свойства изолированных кислотоустойчивых микобактерии изучали во второй генерации после накопления бактериальной массы с предварительной проверкой культуры на чистоту визуально и в мазках. Учет и оценку выросших на питательных средах культур микобактерии проводили по четырехбалльной схеме (Г.Н. Перший, 1971).
Комплекс бактериологических исследований биологического материала от реагирующих на туберкулин разных видов сельскохозяйственных животных и птиц, принадлежащих хозяйствам всех форм собственности, а также проб из объектов внешней среды на туберкулез в Российской Федерации проводят республиканские, областные (краевые) и районные (межрайонные) ветеринарные лаборатории, в ряде случаев — специализированные подразделения научно-исследовательских ветеринарных учреждений и ВУЗов ветеринарного профиля. По результатам бактериологических экспертиз определяется эпизоотический статус хозяйств, проводится контроль тяжести эпизоотического процесса и, в ряде случаев, снятие ограничений по туберкулезу.
Ретроспективный анализ динамики уровня бактериологической диагностики туберкулеза в РФ за 2000-2004 годы, по данным статистической ветеринарной отчетности показал, что количество проведенных лабораториями экспертиз из биоматериала от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота относительно стабильно. Ежегодно суммарно в ветеринарных лабораториях страны за анализируемый период проводилось от 18 (2004 г.) до 22,4 тыс. бактериологических исследований на туберкулез (20, 1 тыс. в среднем за год). В целом за 5 лет анализа проведено 104,2 тыс. бактериологических экспертиз (табл. 2).
Некоторое динамичное и равномерное снижение количество бактериологических экспертиз на туберкулез по годам тесно коррелирует как со снижением численности поголовья крупного рогатого скота в стране, так и улучшением эпизоотической ситуации по показателям количества неблагополучных пунктов, заболеваемости и, по данным мясоперерабатывающих предприятий, пора-женности туберкулезом туш убитых животных (г = 0,8-0,9).
К сожалению дифференцированно уровень бактериологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и других видов животных из благополуч- ных и неблагополучных хозяйств провести не удается ввиду отсутствия такой градации в статистической ветеринарной отчетности.
Согласно нормативно-технической документации при туберкулезе, диагностическому убою с отбором проб биоматериала и бактериологическим исследованием подвергают реагирующих на туберкулин животных благополучных по туберкулезу хозяйств после каждого профилактического аллергического исследования на туберкулез. По данным официальной статистики в благополучных по туберкулезу хозяйствах РФ в 2002 г. выявлено суммарно 93,5 тыс. реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, в 2003 г. — 93,7 тыс. В эти годы ветеринарными лабораториями страны проведено соответственно 21,6 и 19,9 тыс. бактериологических исследований проб биоматериала на туберкулез. Исходя из этого, в среднем в одной экспертизе при бактериологическом исследовании на туберкулез в 2002 г. использовано 4,3 головы реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, в 2003 г. - 4,7 головы.
Количество положительных заключений бактериологических экспертиз, включая индикацию патогенных для крупного рогатого скота М. bovis и М. tuberculosis, а также М. avium и атипичных микобактерий, сравнительно невелико и колебалось в различные годы анализируемого периода от 3,3 до 5,9%. При этом в общем количестве изолированных культур доля патогенных микобактерий составляет в целом 59,3% и 40,7% - различные виды атипичных микобактерий.
Анализ структуры видовой принадлежности патогенных (М. bovis, М. tuberculosis) микобактерий и М. avium, изолированных ветеринарными лабораториями страны из биоматериала от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота за 2000—2004 гг. показал, что подавляющее количество культур приходится на М. bovis — в среднем 96,2% в год и в динамике этот показатель почти не подвержен значительным колебаниям (табл. 3).
Частота изоляции и видовой состав микобактерий
Целью данного фрагмента исследований явилось определение восприимчивости трех линий мышей к заражению возбудителем туберкулеза бычьего вида при различных способах заражения - внутривенном и подкожном, а также установление возможности использования мышиной модели для экспериментального подтверждения туберкулеза.
В опыт взяли 210 мышей — по 70 для линий BALB, C57BL/6 и аутбредиых (беспородных). Мышей в возрасте от 4 до 6 недель, одного пола, массы, разделили на группы (табл. 34). Животных 1-3, 5-7 и 9-11 групп заражали подкожно; 13, 14, 16, 17, 19 и 20 - внутривенно. Контрольных мышей не заражали.
Для заражения использовали выращенную на среде Левенштейна-Иенсена 4 недельную культуру М. bovis, шт. 14 (ВНИИБТЖ). Взвесь культуры готовили непосредственно перед заражением. Для этого культуру с питательной среды платиновой лопаткой помещали для просушивания между листками фильтровальной бумаги. После взвешивания культуру тщательно растирали стеклянной палочкой до получения гомогенной массы, добавляя по каплям физиологический раствор из расчета 1 мл на 10 мг сухой массы культуры. В приготовленную гомогенную взвесь добавляли физиологический раствор до разведения 1:50 (0,1 мг культуры в 0,5 мл раствора). Из исходной культуры методом последовательных разведений получали последующие разведения.
Мышей заражали внутривенно в каудальную вену в дозах 0,1 и 0,05 мг и подкожно в области спины в дозах 0,1, 0,01 и 0,001 мг. За животными наблю 132 дали 4 мес., после чего оставшихся в живых декапитировали под эфирным наркозом и проводили натологоанатомические исследования.
Эффективность заражения определяли по количеству павших в группе лабораторных животных, интенсивность - по специфическому поражению внутренних органов (легких, печени, селезенки); количество микобактерий в мазке и их высеваемость- на плотной питательной среде Левенштейна-Иенсена. Материалом для посева служили кусочки печени, легких, селезенки. Принадлежность выделенной культуры к исходной М. bovis подтверждали в ИФА.
По окончании опыта результаты суммировали и определяли пораженность внутренних органов, количество микобактерий в мазках и их высеваемость на питательных средах по каждой группе животных.
Результаты исследований показали, что при подкожном заражении мышей линии BALB/C и аутбредных в дозах (0,1 и 0,01 мг) пало до 50% животных в сроки от 1,5 до 2 месяцев. У всех животных при патологоанатомическом исследовании макроскопических специфических туберкулезных поражений внутренних органов не отмечали, за исключением трех мышей, зараженных культурой микобактерий в дозе 0,1 мг, в печени которых имелись единичные полупрозрачные очажки сероватого цвета.
Средний показатель продолжительности жизни (вирулентность) мышей во всех группах, зараженных культурой в дозе 0,001 мг, составил 3,5 месяца. У всех животных этой группы при патологоанатомическом исследовании макроскопических специфических туберкулезных изменений также не обнаружено. У мышей 5 и 6 групп линии C57BL/6 на вскрытии отмечали увеличение печени, размеры селезенки в 3-4 раза превышали норму, однако специфических, характерных для туберкулеза поражений не обнаружено.
При бактериоскопическом исследовании мазков установлена высокая обсе-менешюсть внутренних органов опытных лабораторных животных микобакте-риями туберкулеза. Пораженность органов в группах мышей, зараженных в дозах 0,1 и 0,01 мг, составил 3,8 4,0, а в группах, зараженных в дозе 0,001 мг не превышал 1,2.
После посева биоматериала от мышей всех опытных групп на питательную среду Левенштейна-Иенсена получен рост исходной заражающей культуры М. bovis, что подтверждалось результатами ИФА.
Высокую интенсивность роста культуры (85-100 колоний на скосе среды одной пробирки) отмечали в группах мышей, зараженных в дозе 0,1 и 0,01 мг. При использовании для заражения дозы 0,001 и 0,0001 мг интенсивность роста микобактерий из органов была значительно ниже - 12-34 колоний. Скорость первичного роста колоний составила 8-10 дней.
Мыши контрольных групп были активны, хорошо поедали корм и отличались большей упитанностью от зараженных животных. При патологоанатоми-ческом исследовании внутренних органов изменений, свойственных туберкулезу, не обнаружено. При посеве биоматериала на питательные среды рост культур также не получен.
При внутривенном заражении мышей линий BALB и C57BL/6 в дозе 0,1 мг смертность в течение месяца в каждой из групп составила 70%. При патолого-анатомическом вскрытии в легких у них отмечали единичные, мелкие, серые очажки. У павших мышей этих же групп в более поздние сроки (40-45 дней) в легких находили множество желтых некротических бугорков.
В группах аутбредных мышей смертность не отмечали, животные оставались живы до 3,5-4 месяцев (срок наблюдений). Бактериологически (посев на питательные среды) от мышей всех опытных групп выделена исходная заражающая культура микобактерий. Из биоматериала убитых мышей контрольных групп рост культуры не наблюдался.
В группах мышей линии BALB/C и аутбредных, зараженных в дозе 0,05 мг, гибель отмечали через 3,5-4 месяца. При патологоанатомическом вскрытии во внутренних органах регистрировали единичные, микроскопические очажки. Печень была увеличена, полнокровна, без видимых очаговых изменений. При посеве суспензии на питательные среды из органов и тканей получен рост исходной заражающей культуры. Однако показатели скорости и интенсивности роста культур на среде Левенштеина-Иенсена были ниже — 30-50 колоний на поверхности среды одной пробирки, чем в группах мышей, зараженных в дозе 0,1 мг.
В группе мышей линии C57BL/6, зараженных в дозе 0,05мг, смертность всех животных (100%) отмечали в сроки от 1,5 до 2 месяцев. При патологоанатомическом вскрытии в отличие от животных других линий регистрировали резкое увеличение объема легких, печени с множеством сероватых, полупрозрачных, нередко сливающихся очагов. При посеве биоматериала па питательные среды получен рост исходной культуры микобактерий.
Таким образом, исходя из результатов исследований, мыши линий BALB/C, C57BL/6 и аутбредные восприимчивы к возбудителю туберкулеза бычьего вида при подкожном и внутривенном методах заражения. Эта биологическая модель вполне приемлема для биологических исследований, в частности научно-исследовательских для определения вирулентности микобактерий туберкулеза по показателям пораженпости органов и летальности, что приведет к экономии в стоимости лабораторных животных, затрат на их кормление и содержание.
Методика ускоренной постановки биологической пробы на туберкулез
Результаты опыта показали, что организм здоровых морских свинок (не зараженных М. bovis) индифферентен к ППД туберкулину для млекопитающих при внутрибрюшинном введении в дозах стандартного разведения до 5 мл, или 250000 ME. Летальная доза аллергена для них составляет 15-20 мл, что позволило сделать заключение о возможности проведения дальнейших исследований по отработке регламента применения туберкулина в ускоренной постановке биологической пробы на туберкулез.
Полученные нами результаты в определенной степени согласуются с данными Л.А. Зильбера (1958), в опытах которого здоровая морская свинка легко переносила внутрибрюшинное введение 10 мл чистого альттуберкулина.
Следующим этапом исследований явилась отработка летальной дозы при внутрибрюшинном введении ППД туберкулина для млекопитающих зараженным М. bovis морским свинкам. В опыте на 30 свинках нами установлено, что оптимальной (оттитрованной) летальной (100%) дозой туберкулина является 1 мл (50000 ME) стандартного разведения. При этом у зараженных культурой возбудителя туберкулеза бычьего вида морских свинок наблюдается явление анафилактического шока и гибель в течение 16-24 часов.
По данным Л.А. Зильбера (1958) смертельной для зараженной возбудителем туберкулеза морской свинки является 0,1 мл альттуберкулина при внутрибрюшинном и 0,00001 мл при внутримозговом введении.
Различия в разрешающих (летальных) дозах, по нашему мнению, обусловлены видом возбудителя туберкулеза и свойствами туберкулиновых препаратов. Так, в отличие от опытов Л.А. Зильбера, который заражал лабораторных животных культурой М. tuberculosis, мы использовали культуру М. bovis, а вместо альттуберкулина — ППД туберкулин для млекопитающих.
В дальнейших исследованиях экспериментально нами установлено, что оптимальный срок внутрибрюшинного введения ППД туберкулина для млекопитающих, при котором воспроизводится анафилактический шок и гибель морских свинок, зараженных М. bovis, составляет 30 дней.
Результаты дополнительного опыта показали, что в динамике туберкулезного процесса морские свинки даже с наличием характерных для туберкулеза поражений остаются живыми еще не менее 47 дней после заражения культурой М. bovis. Срок гибели лабораторных животных, а, следовательно, и срок первичной постановки диагноза на туберкулез, можно сократить, как минимум, на 29 дней воспроизведением анафилактического туберкулинового шока.
В последующем эксперименте мы установили, что проявление анафилактического туберкулинового шока с гибелью в течение суток через 30 дней после внутрибрюшишюго введения ППД туберкулина для млекопитающих зараженных культурой М. bovis морских свинок зависит от дозы заражения. С ее увеличением возрастает количество павших животных. Повторное введение туберкулина через два месяца после заражения дополнительно вызывает анафилактический шок и гибель 25-100% лабораторных животных.
Ряд исследователей (Л.Л. Зильбер, 1958; P.O. Драбкина, Т.С. Гинсбург, 1956; P.O. Драбкина, 1963; В. Бонд, 1969) для воспроизведения анафилактического туберкулинового шока у морских свинок использовали не только туберкулиновые препараты, но и взвесь убитых микобактерий и производное аминокислоты - гистамин при различных методах и дозах введения. Мы считаем, что для этой цели наиболее приемлемо и целесообразно использование ППД туберкулина для млекопитающих внутрибрюшинпо - как наиболее доступного и сравнительно дешевого.
На основе результатов экспериментальной отработки регламента применения ППД туберкулина для млекопитающих для воспроизведения анафилактического шока с последующей гибелью лабораторных животных нами разработан ускоренный метод постановки биологической пробы на морских свинках в диагностике туберкулеза животных.
Явление анафилактического туберкулинового шока у морских свинок хотя и являлось ранее предметом изучения рядом исследователей, однако не было использовано в практике бактериологической диагностики туберкулеза, как животных, так и человека, в частности в постановке биологической пробы. Учитывая результаты экспериментов, нами разработан и апробирован ускоренный метод постановки биологической пробы на морских свинках в диагностике туберкулеза животных, в частности крупного рогатого скота.
Для сокращения срока постановки биологической пробы на морских свинках, зараженных суспензией биоматериала от убитых с диагностической целью реагирующих на туберкулин животных, метод предусматривает воспроизведение анафилактического туберкулинового шока. Этот феномен достигается внутрибрюшинным введением морским свинкам стандартного разведения ППД туберкулина для млекопитающих в дозе 1мл, или 50000 международных туберкулиновых единиц через 30 и 60 дней после заражения.
Сравнительное изучение эффективности предлагаемого и традиционного методов постановки биологической пробы (40 параллельных биологических проб) при туберкулезе крупного рогатого скота выявило их следующие основные характеристики.
Среднее время гибели морских свинок после заражения суспензией биоматериала от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств при традиционном методе постановки биологической пробы составил: первой —65,3 дня с колебаниями от 45 до 87 дней; второй - 69,7 дней (46-89 дней).
С учетом первичного срока гибели морских свинок в предлагаемом методе биопробы с воспроизведением анафилактического туберкулинового шока средняя продолжительность постановки диагноза на туберкулез составила 35,3 дня. Разница в постановке диагноза на туберкулез разработанным нами и традиционным методом постановки биологической пробы на морских свинках (при естественном развитии инфекционного процесса) составила 29 дней в среднем, что в 1,8 раза меньше.
