Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общая характеристика аэромоноза карпов 9
2.2. Клиническое проявление заболевания 11
2.3. Профилактика и лечение 15
2.4. Характеристика препаратов, используемых в настоящей работе:
2.4.1. Сульфаниламиды 18
2.4.2. Йодсодержащие 21
2.4.3. Пробиотики 23
3. Собственные исследования 33
3.1. Материалы и методы 33
3.2. Результаты исследований
3.2.1. Выделение и типирование микроорганизмов при аэромонозе ... 36
3.2.2. Определение токсичности изолированных культур аэромонад, различных видов для белых мышей и рыб 67
3.2.3. Определение острой и хронической токсичности препаратов: сультеприм, ПВЭНТИ и ветосубалин 69
3.2.4. Чувствительность изолированных микроорганизмов к испытуемым препаратам in vitro 74
3.2.5. Изучение терапевтической эффективности препаратов при аэромонозе в условиях садков 80
3.2.6. Изучение профилактической и терапевтической эффективности препаратов
3.2.6.1. Ветосубалин 84
3.2.6.2. Субтилис 91
3.2.6.3. ПВЭНТИ 93
3.2.6.4. Сультеприм
4. Обсуждение полученных результатов 101
5. Выводы 116
6. Практические предложения 118
7. Список использованной литературы
- Профилактика и лечение
- Йодсодержащие
- Выделение и типирование микроорганизмов при аэромонозе
- Изучение профилактической и терапевтической эффективности препаратов
Профилактика и лечение
Историческая справка. (Прежние названия: Краснуха карпов, Геморрагическая септицемия, Инфекционная брюшная водянка, Люблинская болезнь).
Аэромоноз карпов - болезнь, вызываемая патогенными штаммами бактерий, относящимися к роду Aeromonas в сочетании с неблагоприятными условиями содержания, такими как: температурный стресс, недостаток или избыток кислорода и азота в воде, плотные посадки рыбы, механические манипуляции и другие (7; 28; 25; 30; 4; 49; 127; 133).
Температура воды выше 14-16С способствует клиническому проявлению болезни и гибели рыб (81). Вспышки эпизоотии аэромоноза более активно проходят в прудах и садках, при высоких плотностях посадки карпа. При совместном содержании годовиков карпа и растительноядных рыб поражение аэромонозом в отдельных прудах увеличивается в 10-30 раз (15; 83). Таким образом, совпадение негативных внешних воздействий и наличие в организме рыб вирулентных аэромонад приводит к заболеванию.
Основным возбудителем признана A.hydrophila - грамотрицательная бактерия, в молодых культурах это короткая, с закругленными концами, кокковидная палочка, лежащая изолировано или парами, средние размеры ее 0,5-0,8 мкм в ширину и 0,8-2,0 мкм в длину, монотрих, спор и капсул не образует, хорошо размножается на обычных мясо-пептонных средах при температуре 17-37С и рН 7,2-7,4, аэроб и факультативный анаэроб (79; 101).
Особенность ультраструктуры данного микроорганизма состоит в наличии внутри жгутиков осмофильного канала и в ребристом строении поверхности клеток (126; 134). A.hydrophila обладает рибо- и дезоксирибонуклеазной активностью, ферметирует салицин и арабинозу, гидролизует эскулин, продуцирует два гемолизина (147; 143). Патогенные штаммы бактерии A.hydrophila представлены несколькими серотипами (136). При культивировании на питательных средах A.hydrophila образует экзотоксин, обладающий гемолитическим действием на эритроциты карпа, кролика, крупного рогатого скота, барана, цитотоксическим - в перевиваемой культуре почки поросенка (ПГ), летальным - при внутривенном введении карпам и белым мышам (77; 76; 2; 4; 117; 131; 136).
Имеется сообщение (47), что в фильтратах культур A.hydrophila обнаруживается фактор, вызывающий усиленный выпот жидкости в просвет лигированной тонкой кишки кролика. Этот энтеротоксин имеет антигенное родство с термолабильным энтеротоксином E.coli и холерогеном из фильтрата V.cholerae.
В разные годы и в разных странах под названием «Краснуха карпов» были описаны заболевания по клинико-анатомическим признакам сходные с аэромонозом карпов (93; 84; 11; 40).
Впервые это сделала М.Плен в 1904 году, которая в качестве возбудителя определила Bacterium cyprinicida, образующую при культивировании на искусственных питательных средах желто-зеленый пигмент (144, 81). В России заболевание рыб краснухой было официально зарегистрировано впервые в 1932 году в прудах рыбоводного хозяйства им. Андреева (130). Аэромонозом болеют все возрастные группы карпов. Данное заболевание было обнаружено у сазанов, карасей, белых амуров, толстолобиков, лещей, нильских тиляпий (20; 21; 114; 56; 70; 101; 84; 41; 46; 132; 144).
Наиболее сильно инфекция проявляется весной и летом, осенью эпизоотия затухает и принимает хроническое течение (97; 26; 105; 137; 59). Источником возбудителя аэромоноза являются: больные рыбы (в результате выделения больными рыбами патогенных A.hydrophila происходит накопление их в воде); рыбы, переболевшие аэромонозом (10-20% переболевших рыб остаются носителями вирулентных штаммов A.hydrophila); клинически здоровые бактерионосители, не болевшие аэромонозом. Носителями A.hydrophila могут быть клинически здоровые: карп, белый амур, толстолобик, плотва, красноперки и другие. Наиболее устойчив к аэромонозу большеротый буффало. Не только рыбы, но и другие гидробионты (лягушки, змеи, черви, личинки насекомых) обеспечивают необходимые условия для сохранения возбудителя аэромоноза в природе как вид (9; 8; 37; 41; 46).
В последние годы появились сообщения различных авторов, свидетельствующие о том, что не только A.hydrophila, но и другие представители рода Aeromonas могут быть возбудителями болезни, в частности A.sobria(132).
При заболеваниях у людей выделяли всех представителей рода кроме A.eucrenophila и A.salmonicida (106а).
К роду Аэромонас относятся виды (подвижных аэромонад) - A.hydrophila - типовой; A.caviae, A.media, A.veronii, A.sobria, A.trota, A.djandaei, A.eucrenophila, A.schubertii и подвижные аэромонады вида A.salmonicida -A.s.ss.Smitia(3; 143; 139; 116; 135).
Йодсодержащие
В основе механизма действия сульфаниламидных препаратов лежит антагонизм между сульфаниламидами и парааминобензойной кислотой. В силу структурного сходства молекулы парааминобензойной кислоты и сульфаниламидов последние способны вытеснять первую из ферментативных систем микроорганизма. Сульфаниламиды нарушают процесс получения микробами необходимых для их развития «ростовых факторов» - фолиевой кислоты и других веществ, в молекулу которых входит парааминобензойная кислота. Под действием препаратов в микробной клетке нарушается синтез метионина, пуриновых и пиримидиновых оснований, что в свою очередь приводит к нарушению синтеза нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (66).
Механизм антимикробного действия сульфаниламидных препаратов определяется тем, что сульфаниламиды препятствуют синтезу дигидрофолиевой кислоты в микроорганизме из глютаминовой и парааминобензойной кислот. Белковые вещества, содержащие большое количество парааминобензойной кислоты, также как и некоторые лекарственные препараты, в молекулу которых входит остаток парааминобензойной кислоты, являются ингибиторами активности сульфаниламидов. В то же время присутствие мочевины повышает их бактериостатическую активность.
В ветеринарной практике сульфаниламиды показаны для лечения инфекционных заболеваний дыхательных путей, желудочно-кишечных болезней различной этиологии, рожистого воспаления, мыта, послеродового сепсиса, пиелита, цистита, сальмонеллеза, колибактериоза, пастереллеза, раневых и других инфекций, вызванных микроорганизмами, чувствительными к этой лекарственной группе (138).
Для наиболее рациональной сульфаниламидотерапии целесообразно назначать одновременно смеси двух-трех сульфаниламидных препаратов с различной скоростью всасывания и выведения. Хорошие результаты дает комбинированное применение сульфаниламидных препаратов с антибиотиками, органическими красителями и другими химиотерапев-тическими средствами.
Сультеприм - комбинированный сульфаниламидный препарат усиленного действия, в состав которого входят: сульфафуразол, триметоприм, лактоза.
Входящий в состав препарата триметоприм - производное 2 -аминопирамидина - обладает высокой активностью в отношении многих микроорганизмов, оказывая бактериостатическое действие. По механизму антимикробного действия он стоит близко к сульфаниламидам, так как тоже нарушает синтез фолиевой кислоты в микробной клетке, тем самым, задерживая ее рост и развитие. При совместном действии сульфаниламидного препарата и триметоприма имеет место двойной блок синтеза фолиевой кислоты на разных стадиях метаболизма микробной клетки. В результате такого сочетания наблюдается синергизм, увеличивающий силу антимикробного действия в 4-8 раз по сравнению с исходными компонентами. Усиленное бактериостатическое действие перерастает в бактерицидное.
Сультеприм обладает антимикробным действием в отношении многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов - стрептококков, стафилококков, диплококков, энтерококков, кишечной палочки, сальмонелл, шигелл и некоторых актиномицет. При пероральном введении действующие компоненты сультеприма хорошо и быстро всасываются из желудочно-кишечного тракта и обеспечивают терапевтические концентрации в крови и тканях.
Данный препарат применяют при бронхопневманиях, гастроэнтеритах, септицепии молодняка, дизентерии и сальмонеллезе поросят, вторичных бактериальных инфекциях при вирусных заболеваниях (66).
К комбинированным сульфаниламидным препаратам, в состав которых входит триметоприм, относятся такие препараты как тримеразин, трибриссен, ориприм, триметосул, косумикс плюс. В состав данных лекарственных средств в разных пропорциях входят триметоприм и какой-либо сульфаниламид (сульфамеразин, сульфадиазин, сульфафуразол, сульфахлорипридазин-натрий) и в некоторые из препаратов - наполнитель.
Обладают они широким антибактериальным спектром действия в отношении грамположительных и многих грамотрицательных бактерий; эффективны против пневмококков, стрептококков, стафилококков, кишечной палочки, сальмонелл, пастерелл, микоплазм. Применяют при бронхопневмонии поросят, телят, ягнят, желудочно-кишечных заболеваниях различной этиологии, инфекциях мочеполовых органов (66; 109).
Выделение и типирование микроорганизмов при аэромонозе
При определении патогенности было установлено (табл. 14), что наиболее патогенными были штаммы A.hydrophila № 3 и № 27. После введения мышам культуры № 3 отмечали гибель всех пяти животных в первые сутки (через 14-16 часов); 4 карпа погибли на вторые сутки, один на третьи с проявлениями клинических признаков аэромоноза. Летальность составила 100% среди белых мышей и рыб. Такой же процент гибели подопытных животных отмечали после введения культуры A.hydrophila № 27. Мыши погибали на вторые (3 мыши) и третьи (2 мыши) сутки; один карп погиб в первые сутки, по две рыбы на второй и третий день. Культуры A.hydrophila № 42 и № 43 по патогенному действию были одинаковы, они вызывали 100%-ную гибель мышей и рыб (№ 42 - карасей, № 43 карпа - на вторые и третьи сутки).
Штамм № 71 был менее патогенен для животных, после введения которого остались живы 2 мыши и 1 карп; 3 мыши погибли (по одной) в течение трех дней; карпы погибли: три - на вторые сутки и один - на третьи. Процент гибели среди мышей составил 60%, среди рыб - 80%.
Исследования патогенности культур № 75 и № 41 A.caviae показали, что штамм № 75 обладал большей патогенностью для белых мышей, вызывая 100%-ную гибель, причем три мыши пали в первые сутки (через 16-18 ч.). Карпов погибло четыре: по два на второй и третий день, один остался жив.
Культуры № 78 и № 45 A.veronii менее патогенен для мышей и рыб, чем культуры A.hydrophila и A.caviae. Однако 78 штамм вызывал 100%-ную летальность карпов, причем три рыбы погибли в первые сутки, что характеризует культуру как высокопатогенную. Также в первый день погибли две мыши. Всего погибло четыре мыши, одна выжила. Таблица 14 Патогенность аэромонад, различных видов, для белых мышей и рыб
Следует отметить, что рыбы, погибшие через 48 часов после искусственного заражения, имели выраженные клинические признаки аэромоноза: воспаление брюшка, водянку брюшной полости, экзофтальмию, покраснение и воспаление кожи вокруг анального отверстия.
Высевы из внутренних органов погибших белых мышей и рыб производили на среду Эндо и дифференциальные питательные среды с последующим типированием изолированных культур. Во всех случаях были изолированы исходные штаммы A.hydrophila, A.caviae, A.veronii.
Таким образом, выделенные культуры аэромонад были токсичны для белых мышей и рыб. Особенно патогенными оказались штаммы № 27, 3, 75.
Результаты исследования патогенности различных видов аэромонад (A.hydrophila, A.caviae и A.veronii) свидетельствуют о прямой корреляции патогенности культур для белых мышей и рыб. Определение острой и хронической токсичности препаратов: ПВЭНТИ, сультеприм и ветосубалин. Прежде чем использовать препараты в качестве лечебных и профилактических средств, были проведены опыты по изучению их токсичности для рыб.
Определение острой токсичности препаратов проводили методом скользящих средних (147). В опытных и контрольных группах было использовано по 10 экз. рыб со средней штучной массой 35-40 г. Препараты вводили перорально через зонд, соединенный со шприцом, в дозах пересчитанных на живую массу рыб: ПВЭНТИ - 1x10; 1x10і; lxlO2 и lxlO3 м г/кг массы рыб; ветосубалин -25х107; 25х108; 25х109 и 25х1010 спор на кг массы рыбы; сультеприм - 25x10і; 25х102; 25х103 и 25х104 мг/кг массы рыбы.
Рыбам контрольных групп вводили разбавители, на которых готовили препараты: для ПВЭНТИ - поливинил; для ветосубалина - ФБР и для сультеприма - пропиленгликоль в тех же объемах - 0,5 см3.
При наблюдении за подопытными рыбами (изучение токсичности ПВЭНТИ) - отмечалась их бурная реакция после введения препарата - рыбы плавали на боку, упирались головой в стенки аквариума, из поверхностных слоев воды - выпрыгивали из аквариума. Гибель наступала в течение первого часа после введения лекарственного средства. На вскрытии отмечали: кровенаполнение и увеличение в объеме всех внутренних паренхиматозных органов; слизистая кишечника была набухшая, красного цвета; в просвете кишечника находилось большое количество слизи; сосуды бржейки -кровенаполнены.
В опытной группе - препарата Сультеприм - гибель рыб при максимальной дозе лекарственного средства наступала в течение 10-12 ч., рыбы плавали на боку, часто брюшком вверх, при этом движения были замедленные.
При осмотре и вскрытии рыб отмечали ослизнение кожного покрова, анемию жаборных лепестков; в брюшной полости отмечали скопление большого количества серозно-геморрагического экссудата; почки - дряблые; печень и селезенка увеличены в объеме, кровенаполнены; стенки кишечника истончены, отмечались точечные и полосчатые кровоизлияния в подслизистом слое.
Токсические свойства ветосубалина были менее выражены, чем в опытах с ПВЭНТИ и сультепримом. Гибель рыб наступала в течение 24-36 ч. с момента введения спор в организм рыб. На вскрытии павших рыб отмечали, что основные изменения были только в слизистой оболочке кишечника: катарральное воспаление слизистой по всей длине; точечные и полосчатые кровоизлияния в подслизистом слое; в просвете кишечника - большое количество слизи.
У рыб контрольных групп отклонений от физиологической нормы не отмечали (ни в поведенческих реакциях, ни на картине вскрытия). При определении хронической токсичности - лечебный корм с препаратами скармливали рыбам в течении 20 суток, один раз в день, в терапевтической дозе. При определении - формировали 2 группы рыб - опытную и контрольную, в каждой по 20 рыб, со средней штучной массой 35-40 г. Рыб содержали в непроточных аквариумах с работающими аэраторами и температурой воды 18-20С. Воду в аквариумах меняли каждые 3 суток. Лечебные корма готовили непосредственно перед кормлением в виде влажной мешанки. Рыбам контрольных групп скармливали обычный комбикорм.
Изучение профилактической и терапевтической эффективности препаратов
В АОЗТ «Бисеровский рыбокомбинат» на садковой линии (по выращиванию форели) при контрольном облове и осмотре рыб были обнаружены отдельные экземпляры сорной рыбы - плотвы с клиническими признаками аэромоноза: язвы на поверхности тела и плавников в различной стадии развития; у отдельных рыб вздутие брюшка и реже экзофтальмия. Из внутренних органов таких рыб бактериологическими исследованиями изолировали аэромонад различных видов, а также энтеробактерий, псевдомонад, плезиомонад.
Данное рыбоводческое хозяйство является неблагополучным по аэромонозу карпов с 1986 г. Наши исследования подтверждают сообщения о том, что в длительно неблагополучных хозяйствах аэромонад можно выделять от многих обитателей таких водоемов. Мы согласны с мнением Л.И. Юхименко и Г.С.Койдан о необходимости дифференциации, какой вид заболевания отмечается в каждом конкретном случае: первичный аэромоноз, осложнение аэромонадами другого заболевания или бессимптомное носительство аэромонад.
Жидкая лекарственная форма «Субтилис» является более эффективным препаратом, чем споры B.subtilis. Самое главное тем, что споры, внесенные в комбикорм легко смываются водой и рыбы не получают того количества препарата, которое необходимо для проявления терапевтического эффекта. Возникает необходимость значительно увеличивать количество спор B.subtilis для лечения.
В то же время, использование жидкой лекарственной формы -«Субтилис» позволяет пропитывать комбикорм питательной средой уже содержащей те активные бактерицидные вещества, которые выделяются сенной палочкой в процессе ее культивирования, и при попадании в кишечник рыб они непосредственно начинают оказывать свое антагонистическое действие.
Остается нерешенным вопрос о значении различных видов аэромонад в возникновении заболевания. В наших исследованиях были изолированы аэромонады различных видов: A.hydrophila, A.caviae, A.veronii, A.sobria, A.eucreniphola, A.schubertii, (кроме этого, в последующем - A.djandai, A.salm, ss.smitia). В современной литературе (47) имеются данные о том, что только в фильтратах культур A.hydrophila с большой частотой обнаруживается фактор, вызывающий усиленный выпот жидкости в просвет лигированной тонкой кишки кролика. Этот энтеротоксин в дозе 40 мкг вызывает столь же интенсивную реакцию в тесте на перевязанном участке кишечника кролика, как и 120 мкг холерогена из фильтрата V.cholerae.
Нативный энтеротоксинсодержащий фильтрат A.hydrophila образует полосу преципитации в опытах иммунодиффузии с антисывороткой к холерогену. Антигенное родство энтеротоксина из фильтрата A.hydrophila с термолабильным энтеротоксином E.coli и холерогеном выявлялось и в опытах перекрестной нейтрализации соответствующими сыворотками при титровании на изолированном участке тонкого кишечника. (47)
Цитотоксин (Дермонекротизин). Некоторые штаммы A.hydrophila синтезируют особый цитотоксин белковой природы, вызывающий дермонекротическую реакцию в коже кролика и оказывающий цитопатогенное действие на культуру диплоидных фибробластов человека. Указанный цитотоксин термолабилен и после 10 минутного прогревания при 56С полностью инактивируется.
Гемолизин (аэролизин). Способность к образованию зон гемолиза отмечают у многих штаммов аэромонад. При этом одни аэромонады выделяют гемолизины в питательную среду, а другие содержат гемолитические вещества в стенке клетки. Гемолизины, выделяемые в питательную среду, являются активными в отношении эритроцитов человека, кролика, лошади, быка, собаки, кошки, морской свинки и мыши.
Гемолизины высокотоксичны: при внутривенном введении мышам -DLM составляет 0,1 мкг. При введении внутрикожно кроликам - вызывает отчетливую дермонекротическую реакцию. (148)
В связи с этим возникает вопрос о проблеме вирулентности аэромонад. Известно, что при вспышке заболевания из организма выделяются как вирулентные, так и авирулентные бактерии. Но касаясь вирулентности, во всей доступной литературе по аэромонозу чаще всего описывается токсичность различных штаммов аэромонад. Постановка биопробы не полностью отражает положение по аэромонозу в различных хозяйствах.
Учитывая вышеизложенное (о наличии у аэромонад энтеротоксина, цитотоксина и гемолизина), следовало бы определять вирулентность штаммов по дермонекротической пробе на кроликах, ибо два вещества: цитотоксин и гемолизин вызывают дермонекротическую реакцию, или по внутрибрюшинному заражению белых мышей.
Оценка вирулентности по ДНКазной пробе недостоверна, т.к. фермент ДНКаза, как и желатиназа является признаком характерным для рода Aeromonas в целом. Поэтому штаммы аэромонад не имеющие ни гемолизинов, ни цитотоксина, но обладающие большим количеством фермента ДНКазы не позволят оценить ситуацию в каждом конкретном хозяйстве.
Анализ полученных результатов свидетельствует о выраженной терапевтической эффективности антибактериальных препаратов: ПВЭНТИ и сультеприм (используемых в животноводстве при бактериальных заболеваниях молодняка), при лечении бактериальных заболеваний рыб. Наибольшую эффективность показал йодсодержащий препарат ПВЭНТИ: при лечении карпов в подострой и хронической формах аэромоноза, выздоровление рыб наступало на 3-5 дней раньше, чем при лечении препаратом сультеприм.
Препарат-пробиотик «Ветосубалин» обладает антибактериальной активностью по отношению к A.hydrophila, приживается в организме рыб при температуре 15-21 С, стабилизует функции кишечника за счет заселения его микрофлорой, позволяющей улучшить резорбтивную деятельность и ферментативную активность; способствует восстановлению естественного баланса между нормальной и потенциально-патогенной микрофлорой; способствует заживлению кожного покрова; оказывает терапевтическое действие на организм рыбы, мобилизует его защитные функции, улучшает физиологический статус рыбы.
