Введение к работе
Актуальность проблемы. С интенсификацией животноводства усложняется и сфера его ветеринарного обслуживания. Увеличивается количество и разнообразие фармакологического обеспечения. Так, если 50-лет назад для ветеринарного благополучия на фоне удовлетворительной санитарии было достаточно классических вакцин (сибирская язва, ящур, чума, бешенство, рожа и др.), сывороток, антибиотиков, сульфаниламидов и нитрофуранов, то сегодня этот арсенал оказался очень узок (Смирнов П.Н.,1997; Анудориев А.М. и др., 1999; Бузлама В.С., 2003; Шахов А.Г., 2004), но и его расширение, особенно за последнюю четверть века не привело к желаемым результатам. Болезни, особенно продуктивных животных, стали разнообразнее и сложнее. Они трудно поддаются профилактике и терапии классическими путями (Донченко А.С., 1997; Воронин и др., 1999; Шахов А.Г. и др., 2001). Оказалось, что это обусловлено рядом объективных причин. Прежде всего, это противоречие между нарастающим уровнем продуктивности и генетически обусловленными защитно-приспособительными возможностями организма. Здесь традиционные лекарства и биологически активные препараты не могут восстановить постоянно нарушающийся баланс.
Коровы, свиноматки во время критического процесса воспроизводства (роды) с трудом переносят эту физиологическую нагрузку. В результате - задержание последа, метриты, маститы, агалактия. Кроме этого нарождающийся молодняк мало жизнеспособен, в течение первых двух месяцев плохо растёт, у него возникают массовые заболевания так называемыми факторными инфекциями и как следствие – или гибель, достигающая 30%, или достаточно большие затраты на лечение и реабилитацию (Слободяник В.И., 1994; Париков В.А., 2000; Шахов А.Г. и др., 2000; Мисайлов В.Д. и др., 2004; Нежданов А.Г. и др., 2007).
Одним из главных решений этой проблемы является ослабление или, по-возможности, ликвидация противоречия между эволюционно обусловленными защитно-приспособительными возможностями и искусственно созданной высокой продуктивностью. Новые перспективы в этом направлении открывает создание фармакологических препаратов для поддержания продуктивного здоровья крупного рогатого скота, свиней, птиц - адаптогенов или средства повышения резистентности, или стресс-корректоров. На сегодня известен ряд препаратов подобного действия, среди которых наиболее известны препараты природного происхождения типа элеутерококка и модифицированные природные производные гуминовых веществ (Брехман И.И., 1957; 1968; Дардымов И.В., 1976; Беркович А.М. и др., 2003; Бузлама В.С., 2000-2005; Попов А.И., 2004;).
За последние 20-25 лет экспериментальных и клинических фармакологов заинтересовали вначале природные, выделенные из тканей животных, а затем ресинтезированные и модифицированные олигопептиды, обладающие широким спектром биологической активности в плане повышения и восстановления защитно-приспособительных возможностей организма. Наиболее широко известным и первым вошедшим в ветеринарную практику стал тимоген. Активность синтетического дипептида, идентичного природному, не укладывается в рамки иммуномодулятора тимусного просхождения и проявляется при более широком спектре патологий (Андреева Н.Л, 1990; Хавинсон В.Х. и др., 1991; Золотарёв Д.В., 2001; Malkahanov V.B. et al., 1991; Shustval D., 1992; Lukash et al.,1998).
Возникла проблема фармакологического изучения ряда синтетических аналогов природных олигопептидов с новых позиций: анализ её состояния, необходимость разработки новых, практически не токсичных и экологически безопасных лекарств для поддержания здоровья продуктивных животных, комплексной профилактики, терапии болезней и реабилитации, что обусловило направление данного исследования, их методическое обеспечение и клинические испытания (Чазов Е.И. и др., 1984; Бахаров В.Д., 1989; Гомазов О.А., 1992; Дейгин В.И. и др., 2001; Флейшман М.Ю. и др., 2004; Alvares A.A. et al., 1994; Morozov V.G. et al., 1997; Paukovits W.R. et al., 1998; Kvetney J. еt al., 2002).
Цель и задачи работы. Цель исследований – изучить фармако-токсические свойства синтетических олигопептидов (тимогена, неогена и седатина), их влияние на метаболический статус и защитно-приспособительные возможности организма и разработать показания к их применению в ветеринарной медицине.
Для достижения этой цели и решения проблемы поставили следующие основные задачи:
1. Дать фармако-токсикологическую характеристику синтетических олигопептидов;
2. Изучить влияние тимогена, неогена и седатина на защитно-приспо-собительные возможности животных;
3. Изучить действие синтетических олигопептидов на метаболический статус животных:
- резорбтивное действие;
- система пероксидации липидов и состояние антиоксидантной защиты;
- гомеостаз глюкозы (интактное состояние, нагрузки).
4. Разработать показания к применению синтетических аналогов природных олигопептидов для повышения резистентности и улучшения продуктивного здоровья животных.
Научная новизна. Впервые в ветеринарной фармакологии поставлена и решена проблема комплексного многостороннего изучения синтетических олигопептидов для повышения резистентности и улучшения продуктивного здоровья животных. Показано, что тимоген, неоген, седатин на фоне низкой токсичности и относительно низкой органо-системной специфичности проявляют высокую защитную активность при изменяющихся условиях и неблагоприятных воздействиях внешней среды. Установлено, что препараты проявляют стресс-корректорное, актопротекторное, антигипоксическое и антитоксическое действие, стимулируют гемопоэз и клеточный иммунитет при их угнетении, что связано с нормализацией процессов пероксидации липидов, активизацией антиоксидантной защиты, сохраняют гомеостаза глюкозы в экстремальных условиях. Новизна исследований подтверждена патентом РФ и дипломом Президиума Россельхозакадемии «За лучшую завершенную научную разработку 2005 года».
Практическая значимость и реализация результатов. Показания к применению изученных синтетических олигопептидов для повышения резистентности и улучшения продуктивного здоровья крупного рогатого скота, свиней, пушных зверей, птиц использованы при разработке Наставления по применению седатина в ветеринарии (№ 13-5-2/1142 от 14.01.98). Полученные результаты вошли в методические рекомендации «Скрининг биостимулирующих и биоцидных веществ (адаптогены, бактерициды и другие препараты)» одобренных секцией патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (протокол №2 от 14.07.2006 г.) и «Синтетические аналоги природных олигопептидов и их использование в ветеринарии», одобренных секцией патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (протокол №2 от 15.05.2008 г.).
Апробация работы. Данные экспериментальных и клинических исследований, которые легли в основу диссертации, доложены и представлены на ежегодных отчётных сессиях института в 1995-2005 годах, заседаниях Ветфармбиосовета в 1995, 2001 годах, на международной научно-практичес-кой конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Авророва А.А. (Воронеж, 2006), международной научной конференции «Токсикозы животных и актуальные проблемы болезней молодняка» (Казань, 2006), Юбилейной научно-практической конференции ветеринарных терапевтов и диагностов, посвященной 90-летию со дня рождения засл. деят. науки РСФСР, академика РАЕ, д. вет. н. Кабыша А.А. (Троицк, 2007), Первом съезде ветеринарных фармакологов России (Воронеж, 2007), Международной научно-практи-ческой конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской области (Курск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 31 научная работа, в том числе 12 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, 2 Методические рекомендации, 1 монография и 1 патент.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
- о низкой токсичности и относительной органо-системной индифферентности синтетических олигопептидов;
- об адаптогенном, стресс-корректорном действии препаратов;
- о защитном действии тимогена, неогена и седатина при эмоционально-физических и химических нагрузках, гипоксиях и интоксикациях;
- о регулирующем влиянии препаратов на систему пероксидация липидов - антиоксидантная защита (ПОЛ-АОЗ) и гомеостаз глюкозы при изменяющихся условиях и неблагоприятных воздействиях внешней среды.
- об эффективности применения синтетических олигопептидов для повышения резистентности и улучшения продуктивного здоровья сельскохозяйственных животных.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 338 страницах и включает введение, обзор литературы, материал, объем и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, предложения, список литературы и приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 120 таблицами и 37 рисунками. Список литературы включает 626 источников, в том числе 235 на иностранных языках.
2. МАТЕРИАЛ, ОБЪЁМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проведены в 1994-2008 годах в отделе клинической биохимии по планам НИР ГНУ Всероссийского научно-исследователь-ского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии в рамках Государственной Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ по заданиям: «Разработать и внедрить промышленную систему мероприятий по повышению естественной резистентности у крупного рогатого скота, свиней, овец и птиц»
(№ гос. рег. 01860113278); «Изучить роль нарушений обменных процессов и снижения резистентности в возникновении патологии высокопродуктивных животных. Разработать методы и средства их прогнозирования и профилактики, диагностики и терапии» (№ гос. рег. 01940007587); «Разработать общую теорию патологии животных и на её основе создать экологически чистую систему ветеринарной защиты»(№ гос. рег. 01.9.90.0001257), «Разработать новые высокоэффективные средства и методы повышения общей резистентности и иммунного статуса крупного рогатого скота, свиней и птиц» (№ гос. рег. 150070.3666026906, 06.8.003.04).
В проведении ряда исследований принимали участие сотрудники ГНУ ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии Долгополов В.Н., Ермакова Т.И., Федорова Н.М., Аргунов М.Н., Сулейманов С.М., Шушлебин В.И., Мещеряков Н.П., Бузлама С.В., Бузлама А.В., Максимова Л.И., которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.
Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствие с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных в период проведения работы и учёта результатов.
Клинические испытания препаратов, их производственная апробация и внедрение осуществлены на животноводческих предприятиях Воронежской, Белгородской, Липецкой и других областей Российской Федерации, а также Харьковской области Украины.
Скрининговые исследования выполнены в соответствии с Методическими рекомендациями «Скрининг биостимулирующих и биоцидных веществ (адаптогены, бактерициды и другие препараты)», 2006, авторским свидетельством на изобретение (1982) и патентом RU (2125261).
Токсикологическую оценку и органо-системное действие изучали в соответствии с «Руководством по доклиническому изучению новых лекарственных средств» (Москва, 2000).
Оценка адаптогенного спектра препаратов выполнена с использованием трёх групп экстремальных воздействий (физическая перегрузка, кислородная недостаточность и химическая интоксикация) на 14 моделях. Состояние «оксидативного стресса» моделировали путем введения 5,6-диоксиура-цил моногидрата (ДОУМГ, аллоксана), который восстанавливается в диалуровую кислоту, при аутоокислении которой образуется H2O2 и активные формы кислорода, которые запускают в клетке цепь свободнорадикальных реакций (Николаева М. И. с соавт.,1986). ДОУМГ вводили после 24-часового голодания однократно подкожно в дозе 130-150 мг/кг массы тела.
Критериями интегральной оценки активности препаратов при стрессе служили выживаемость животных, их выносливость при функциональных нагрузках, заболеваемость, сохранение здоровья и продуктивности в критических ситуациях.
С целью характеристики общего состояния животных при применении изучаемых олигопептидов определяли количество в крови эритроцитов, гемоглобина, СОЭ, лейкоцитов и тромбоцитов общепринятыми методами (Предтеченский В.Г., 1964; Кондрахин И.П. с соавт., 1983; Карпуть И.М., 1986); содержание в сыворотке крови общего белка (г/л) рефрактометрически (Филиппович Ю.В. с соавт., 1975); активности АлАТ, АсАТ и щелочной фосфатазы (мМ/лч) (Меньшиков В.В., 1973).
Оценку влияния олигопептидов на углеводный обмен проводили по показателям крови: гликоген, г/кг (Мильман Л.С. с соавт., 1974); глюкоза, мМ/л (Меньшиков В.В., 1971); лактат, мМ/л (Прохорова М.И. с соавт., 1965); пируват, мкМ/л (Бабаскин П.М, 1976); активность глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназы, мкМ/лмин (Вульфсон П.В. с соавт., 1979); лактатдегидрогеназы, мкМ/минмг белка (Пырков Я.Н. с соавт., 1970).
Состояние системы ПОЛ-АОЗ у животных определяли по показателям: содержание в крови конъюгированных диенов (ДК) в ед.опт.пл./мг липидов или в мкМ/л крови (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977); малонового диальдегида (МДА) в мкМ/л крови (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. 1977); содержание в сыворотке крови флуоресцирующих оснований Шиффа (ОШ) в усл.ед./мл сыворотки (Bidlack W.R., Tappel A.L., 1973; Malshet V.G., Tappel A.L., 1973); содержание в крови общих и небелковых SH-групп в мМ/л (Рубина Х.М., Романчук Л.А., 1961); содержание в сыворотке крови витамина Е в мкМ/л (Кисилевич Р.Ш., Скварко С.И., 1972), ферроксидазную активность церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови в мкМ бензохинона/лмин (Антонов М.П. с соавт., 1985); активность супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах в отн.ед./мг гемоглобина (Чумаков В.Н., Осинская Л.Ф., 1977), каталазы (КАТ) в крови в мМ Н2О2/лмин (Королюк М.А. с соавт., 1988), пероксидазы (ПО) в усл.ед./л крови (Плешков Б.П., 1976), глутатионпероксидазы (ГПО2) в крови в мМ восстановленного глутатиона/лмин (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976), глутатионредуктазы (ГР) в крови в мМ окисленного глутатиона/лмин (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976); содержание НЭЖК в сыворотке крови в мкМ/л (Прохоров М.Ю. с соавт., 1977), в-липо-протеидов в мг% (Ледвина М., 1960), холестерина в мМ/л (Меньшиков В.В. с соавт., 1987).
Для характеристики состояния гуморального звена неспецифической иммунологической резистентности организма определяли: бактерицидную активность (%) сыворотки крови (Смирнова О.В., Кузьмина Т.А., 1966); лизоцимную (мкг/мл) (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974), комплементарную (% гемолиза) активности сыворотки крови (Вагнер Г.Ф., 1966); содержание пропердина (г/л) с сыворотке крови (Томилка В.С., Старостин И.С., 1984).
В проведении экспериментальных и научно-производственных исследований использовали: инфузории Paramecium caudatum (36 опытов, с оценкой 3-х препаратов); мышей - белых беспородных самцов и самок с массой тела 20,0±2,0 г (n=1659); белых крыс беспородных и линии Wistar самцов и самок с массой тела 150,0±20,0 г (n=1780); кроликов обоего пола породы шиншилла с массой тела 1,1-2,0 кг (n=44); собак (n=6); коров, откормочных быков и телят чёрно-пёстрой породы (n=286); свиней крупной белой, украинской пород и помесей разного возраста и пола (n=463); кур и цыплят породы леггорн, линии хайсекс и др. (n=3450); норок, песцов и хорьков (n=12045).
Опыты на продуктивных животных проводили в производственных условиях содержания и кормления. При заболеваниях диагнозы ставили в соответствии с утверждёнными инструкциями и методическими указаниями с привлечением соответствующих специалистов и данных лабораторных исследований.
Кровь для исследований получали из хвоста, ярёмной, ушной вен, при декапитации, а внутренние органы или их фрагменты - при вскрытии животных.
Полученный цифровой материал обработан методами математической статистики принятыми в биологии и медицине (М.Л. Беленький, 1963; Г.Ф. Лакин, 1973; Е.В. Гублер, 1978 и др.) с использованием прикладной статистической программы “Statistica 5.0” (Stat Soft Inc., 1998) и электронных таблиц “Microsoft Excel” на РС «Pentium IV».
