Введение к работе
1 1 Актуальность исследований За последние годы исследователи большинства развитых стран проявляют огромный интерес к изучению уникального семейства ретровнрусов Вызываемые ими заболевания являются объектом как медицинской, так и ветеринарной вирусологии, патологии, онкологии, молекулярной биологии
На сегодняшний день особое значение имеют два ретровируса крупного рогатого скота вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) и иммунодефицитподобный вирус крупного рогатого скота (B1V)
ВЛКРС идентифицирован как этнологический агент лейкоза крупного рогатого скота, являющегося хроническим инфекционным заболеванием опухолевой природы (Miller J М et al, 1969, Шишков В П , 1979 ) Заболевание наносит значительный экономический ущерб вследствие гибели и вынужденной выбраковки животных, утилизации органов и туш при убое, нарушения племенной работы, расходов, связанных с ограничительными мероприятиями.
Лентивирус крупного рогатого скота, BIV, менее известен. Клиническое проявление болезни описано только при первичной изоляции (Van Der Maaten М J et al, 1972) Главная причина, побуждающая ученых на более глубокое исследование особенностей данного вируса - его сходство с другим лентивирусом - вирусом иммунодефицита человека В последние годы появи-лись предположения, что BIV выступает кофактором при инфекции ВЛКРС (Gonda М et al, 1989, Храмцов В В , 1995) Поэтому нам представляется целесообразным изучение распространения BIV среди поголовья крупного рогатого скота в России, особенно в контексте проявления двойной инфекции Так при серологическом исследовании отдельных стад в США, Канаде, Европе, Австралии обнаружен 4 - 16% уровень инфицирования (Forman A J. et al, 1992, McNab WB. et al, 1994) Однако при приготовлении диагностических средств исследователи столкнулись с проблемой - неудовлетворительное накопление гликопротеи-дов вируса в культурах клеток млекопитающих Для решения этой задачи мы взяли экспериментальную модель - рекомбинантный ба-куловирус, имеющий клонированные иммунодоминантные участки B1V и. реплицирующийся в культуре клеток насекомых.
За последние два десятилетия гораздо больше внимания было уделено изучению ВЛКРС, однако проблема инфицированное им поголовья крупного рогатого скота остается актуальной для многих стран мира. Так как заболевание имеет хронический, часто латентный характер, а проведение экспериментов на группах телят или коров в настоящее время ограничено по экономическим причинам, то необходимо разработать новую экспериментальную модель для инфекции ВЛКРС В частности, большая работа проведена по экспериментальному воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота на овцах и ягнятах (Olson С et al, 1972, Шишков В.П с соавт., 1985, Бу-зераиб А., 1986).. Кроме овец в экспериментах различных авторов были использованы другие животные Наиболее интересные результаты были получены на кроликах (Стасенко В С, 1983, Wyatt С R et al, 1989). Полученные данные указывали еще на одну характерную деталь патогенеза ВЛКРС - его иммуно-депрессивное воздействие, которое у кроликов проявляется сильнее, чем у крупного рогатого скота (Шишков В П., Гевондян В.С , 1985). Таким образом, на данный момент показаны возможность заражения кроликов ВЛКРС и иммунодепрессивное воздействие вируса на организм кролика В нашей работе мы развиваем эти вопросы и исследуем критерии, позволяющие использовать кроликов как биологическую модель для изучения особенностей инфекции ВЛКРС материал и доза заражения, степень чувствительности животных и возможность использования их для тестирования химиотерапевтических препаратов
1 2 Цель и задачи исследования Целями нашей работы была разработка кроличьей биологической модели онкорнавирусной инфекции с помощью комплексного изучения процессов, протекающих у кроликов, экспериментально зараженных ВЛКРС, наблюдение репликации лентивируса крупного рогатого скота в клеточных культурах и характеристика рекомбинантного бакуловируса, содержащего клонированные участки генов BIV как источник получения иммуно-реактивных белков
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи
1. Проследить по гематологическим, серологическим и иммунологическим данным развитие онкорнавирусной инфекции у кроликов, зараженным различным материалом, содержащим ВЛКРС;
-
Изучить по гематологическим, серологическим и иммунологическим показателям возможность тестирования препаратов, обладающих воздействием на инфекцию ВЛКРС;
-
Изучить морфологию клеток и особенности морфогенеза BIV в культурах клеток млекопитающих;
-
Клонировать участки генома BIV, кодирующие иммунодо-минантные белки в рекомбинантиый бакуловирус и охарактеризовать их экспрессию.
1.3 Научная новизна. Проведено комплексное изучение экспериментально индуцированной онкорнавирусной инфекции у кроликов с точки зрения использования этих животных в качестве биологической модели в опытах с вирусом лейкоза крупного рогатого скота.
Впервые кроличья модель инфекции ВЛКРС была использована для изучения возможности применения химиотерапевтических препаратов для искоренения инфекции. Показано иммунодепрессив-ное действие ВЛКРС на кроличьей биологической модели.
Комплексно изучены особенности морфогенеза BIV в клеточных культурах. Впервые экспрессированы иммунодоминантные участки генома BIV (gag-3, env-8) в бакуловнрусном векторе с целью выработки антигенов для диагностакума.
Научно-практическая ценность. Результаты исследований по воспроизводству инфекции ВЛКРС на кроликах могут быть использованы для тестирования химиотерапевтических и вакцинных препаратов
Полученные данные вносят свой вклад в подтверждение виру-со-иммуно-генетической концепции возникновения и развития лейкоза крупного рогатого скота (нммунодепрессивное воздействие ВЛКРС на организм кроликов).
Схема клонирования в бакуловирусный вектор (ПЦР - ТА вектор - бакулоплазмнда - трансфекция с бакуловирусной ДНК) может быть использована специалистами в области биотехнологии для разработок современных диагностикумов и вакцин.
Полученные рекомбинантные белки будут использоваться для создания диагностических средств и проведения серологического обследования рогатого скота в России, а также тестирования импортного скота.
r>
1.5 Научные положения, выносимые на защиту
-
Кролики являются чувствительными к вирусу лейкоза крупного рогатого скота; наиболее предпочтительный метод воспроизведения инфекции ВЛКРС - внутривенное сведение нативных лейкоцитов от коровы с персистентным лимфоцитозом;
-
Возможно использование кроликов как биологической модели для тестирования противовирусных препаратов;
-
Метод заражения BIV клеточных культур млекопитающих не позволяет получать необходимое количество полноценного антигена для диагностических исследований;
-
Экспериментальная система (рекомбинантный бакуловирус -клетки насекомых) может использоваться для получения иммуноре-активных белков; данный метод является более приемлемым для выработки антигена, чем экспрессия в E.coli или пассирование BIV в культурах клеток млекопитающих.
1.6 Объем и структура работы. Диссертация состоит из введе
ния, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения ре
зультатов и выводов. Работа содержит 187 страниц машинописного
текста, иллюстрирована 9 таблицами и 43 фотографиями. Список ли
тературы включает 218 источников, из них 165 зарубежных.
