Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 6
2. Обзор литературы 12
2.1. Диоксины и экологическая опасность 12
2.2. Токсикологическая характеристика диоксинов 16
2.3. Подходы к разработке средств лечения и профилактики отравлений диоксинами 35
2.4. Токсикологическая характеристика наиболее опасных микотоксинов 39
2.5. Смешанные токсикозы 46
2.6. Лечение и профилактика токсикозов 48
3. Собственные исследования 58
3.1. Материалы и методики 58
3.2. Результаты исследований 64
3.2.1. Изучение острой токсичности диоксина 64
3.2.1.1. Биохимические показатели 64
3.2.1.2. Клинические признаки и патологоанатомические изменения . 71
3.2.1.3. Гистологические изменения внутренних органов при отравлении морских свинок диоксином в дозе ЛДюо 75
3.2.1.4 Гистологические изменения внутренних органов при - отравлении белых крыс диоксином в дозе ЛД5о 80
3.2.1.5. Гистологические изменения внутренних органов при отравлении кроликов диоксином в дозе ЛД5о ос
3.2.1.6. Гистологические изменения внутренних органов при отравлении овец диоксином в дозе ЛД5о 92
3.2.2. Изучение хронической токсичности диоксина 98
3.2.2.1. Биохимические показатели 99
3.2.2.2. Клинические признаки и патологоанатомические изменения.. 101
3.2.2.3. Гистологические изменения внутренних органов при отравлении кроликов диоксином в дозе 1/100 ЛД50 Ю2
3.2.2.4. Гистологические изменения внутренних органов при отравлении белых крыс диоксином в дозе 1/200 ЛД50 Ю5
3.2.2.5. Ультраструктурные изменения внутренних органов при отравлении белых крыс диоксином в дозе 1/200 ЛД50 1Ю
3.2.3. Морфологическое обоснование предельно допустимой концентрации диоксина в кормах для животных 123
3.2.4. Биохимические и патоморфологические исследования при остром отравлении животных диоксином на фоне применения лечебно-профилактического препарата
3.2.5. Патоморфологические исследования при хроническом отравлении животных диоксином в дозе 1/100 ЛД5о на фоне применения лечебно-профилактических препаратов * 40
3.2.6. Патоморфологические исследования при хроническом отравлении животных диоксином в дозе 1/200 ЛД5о на фоне применения лечебно-профилактических препаратов 14
3.2.7. Морфологическое обоснование биохимических изменений при сочетанном воздействии Т-2 токсина и афлатоксина В! в дозах 1/10 ЛД50 на организм животных ^"
3.2.7.1. Биохимические показатели 160
Клинические признаки и патологоанатомические изменения... 167
Гистологические изменения внутренних органов белых крыс 168
Гистологические изменения внутренних органов овец 177
Ультраструктурные изменения внутренних органов овец 181
Морфологическое обоснование применения лечебных и профилактических препаратов при микотоксикозах 186
Обсуждение полученных результатов 196
Выводы 219
Практические предложения 222
Список литературы
- Подходы к разработке средств лечения и профилактики отравлений диоксинами
- Биохимические показатели
- Гистологические изменения внутренних органов при отравлении кроликов диоксином в дозе 1/100 ЛД50
- Патоморфологические исследования при хроническом отравлении животных диоксином в дозе 1/200 ЛД5о на фоне применения лечебно-профилактических препаратов
Введение к работе
Актуальность темы. В современных условиях производства происходит интенсивное нарастание техногенной нагрузки на экосистему. Из большого разнообразия химических веществ приоритетными загрязнителями окружающей среды являются такие органические соединения, как полихлорированные дибензо-пара-диоксины (ПХДД) и микотоксины -вторичные метаболиты микроскопических грибов (Таланов Г.А., Тутельян В. А., Кравченко Л.В., 1985; Федоров Л. А., 1993; Куценко В. В. и др., 1997; Курляндский Б. А., Новиков С. А., 1998; Смирнов A.M. и др., 1999; Кузнецов А.Ф., 2001; Желтов В.А., 2005; Новиков В.А., 2006). Бесспорно доказана их реальная опасность для человека и животных, они чрезвычайно широко распространены в природе и наносят значительный ущерб экономике страны, входят в список опасных природных экотоксикантов (Саркисов А.Х., 1985; Смирнов A.M., 1999; Кузнецов А.Ф., 2001).
Попадая в организм животных по трофическим цепям токсиканты вызывают патологические изменения в организме животных, приводят к нарушению метаболизма, иммунологического статуса, что является причиной низкой продуктивности и повышенной чувствительности животных к инфекционным и незаразным заболеваниям.
Под термином «диоксин» подразумевают десятки семейств, включающих трициклические кислородосодержащие ксенобиотики и бифинилы, не содержащие атомы кислорода. Это 75 полихлорированных дибензодиоксинов, 135 полихлорированных днбензофуранов, 210 веществ из броморганических семейств и несколько тысяч смешанных хлорбромсодержащих соединений. Отличительной чертой этих соединений является чрезвычайно высокая устойчивость к химическому и биологическому разложению, способность сохраняться в окружающей среде, концентрироваться в биомассе и переноситься по пищевым цепям. Эти
вещества являются супертоксикантами, универсальными клеточными ядами, поражающими все живое.
В настоящее время известно более 250 видов микроскопических грибов, продуцирующих около 300 микотоксинов. Многие микотоксины обладают тератогенными, мутагенными, аллергенными и иммунодепрессивными свойствами. Из наиболее известных в настоящее время микроскопических грибов, интерес представляют грибы рода Fusarium и Aspergillus, в частности F. sporotrichiella и A. flavus, A. parasiticus, которые продуцируют опасные для человека и животных микотоксины: Т-2 токсин, афлатоксины Bi, В2, Gb G2, М,.
одновременном поступлении экотоксикантов, сопровождаю:
Имеются данные об увеличении токсического действия при
в организм нескольких и разных
ихся
массовой
заболеваемостью,
повышенным отходом животных, сложностью диагностики, лечения и профилактики в условиях сельскохозяйственных предприятий (Тремасов М.Я., Сметов П.К., 1995; Тремасов М.Я. и др., 2000; Мусин P.P., 2002; Семенов Э.И., 2006).
Специфических средств лечения при отравлении ксенобиотиками нет, поэтому назначают в основном симптоматическую терапию в зависимости от синдрома интоксикации. Однако симптоматическое лечение малоэффективно. Поиск эффективных средств защиты животных от воздействия экотоксикантов постоянно продолжается.
Исходя из вышеизложенного, изучение влияния диоксина и сочетанного поступления Т-2 токсина и афлатоксина В] на организм животных, морфологическое обоснование применения лечебных и профилактических средств при отравлении данными ксенобиотиками является актуальной задачей.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение
влияния диоксинов на содержание порфиринов в . моче и смешанных микотоксикозов (Т-2 токсин и афлатоксин В,) на состояние перекисного
окисления липидов (ПОЛ) животных, а также комплексный морфологический анализ изменений в органах и тканях животных с последующим обоснованием использования лечебных и профилактических средств при отравлении ксенобиотиками. Для реализации поставленной цели были определены следующие основные задачи:
изучить вопросы патогенеза отравлений животных при острой и хронической интоксикации диоксином;
изучить гистологические и ультраструктурные изменения в органах подопытных животных при однократном и многократном поступлении диоксина;
определить критерии ультраструктурного проявления при интоксикации животных пороговой дозой диоксина;
- провести морфологическую оценку лечебно-профилактических
препаратов при диоксиновых интоксикациях;
изучить влияние Т-2 токсина и афлатоксина В] при сочетанном их воздействии на организм животных;
морфологически обосновать действие лечебных и профилактических препаратов при смешанных микотоксикозах.
Научная новизна. Впервые проведен ультраструктурный анализ изменений внутренних органов животных при хроническом отравлении диоксином в разных дозах, а также сочетанном воздействии Т-2 токсина и афлатоксина В|. Установлено характерное для отравления диоксином дозозавнсимое нарастание энергетического дефицита клетки, вызванное деструкцией мембранных структур, матрикса митохондрий при отсутствии клинических и морфологических признаков (1/400 ЛД5о), что учтено при обосновании предельно допустимых концентраций (ПДК) яда в кормах для сельскохозяйственных животных, диагностике и разработке лечебно-профилактических средств. Выявлено нарушение структурированности крист при сохранении целостности наружной мембраны митохондрий, что предложено в качестве диагностического критерия при интоксикации
животных диоксином. Биохимическими и патоморфологическими исследованиями доказано синергетическое действие Т-2 токсина и афлатоксина В і при их сочетанием поступлении в организм животных. Морфологически обосновано использование лечебных и профилактических препаратов при отравлении животных диоксином, а также сочетанным поступлением Т-2 токсина и афлатоксина В]. Впервые установлены фунгицидные и фунгистатические свойства производных трехядерных трифенолов, рекомендуемых для проведения профилактических мероприятий при микотоксикозах. Новизна проведенных исследований по изучению обеззараживающей эффективности четвертичных аммониевых соединений подтверждена 3 патентами.
Практическая значимость работы. Для дифференциальной диагностики при отравлении животных диоксином рекомендуем использовать в комплексе с клиническими, биохимическими, физико-химическими и другими методами электронно-микроскопические исследования, особенно на ранних стадиях интоксикации. В качестве лечебно-профилактического средства при острой и хронической интоксикации животных диоксином рекомендуем препарат димефосфон, при сочетанном поступлении Т-2 токсина и афлатоксина Ві - аминазин и ксимедон .
На основании экспериментальных данных разработаны:
«Рекомендации по диагностике, профилактике и лечению токсикозов животных, вызванных диоксинами»;
«Временная инструкция по применению димефосфона и левамизола при отравлении животных диоксином»;
«Рекомендации по борьбе со смешанными микотоксикозами животных в республике Татарстан»;
«Методические рекомендации по экспериментальному обоснованию и расчету ПДК 2,3,7,8-ТХДД в объектах ветеринарного надзора», утвержденные в установленном порядке.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: ежегодных сессиях ученого совета ФГУ «ФГНУ-ВНИВИ» по рассмотрению отчетов (1996-2006); Республиканских научно-производственных конференциях по проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 1996,1997); Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и зооинженерные проблемы животноводства» (Витебск, 1996); 4-ом Международном конгрессе Ассоциации морфологов (Н. Новгород,1997); Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка,2000); Научно-производственной конференции (Уфа,2000); Международных научно-производственных конференциях (Казань,2003, 2004); Конгрессе по медицинской микологии (Москва,2005); Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань,2005).
Публикации результатов исследований. По результатам выполненных исследований опубликовано 26 работ, в том числе 8 статей в центральных изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в трудах Международных, Всероссийских, Республиканских конференций в Москве, Казани, Черноголовке, Витебске, Н. Новгороде, Уфе, Международных конгрессах Ассоциации морфологов и микологов, а также представлены в качестве 4 научно-методических документации.
Основные положения, выносимые на защиту.
- структурные изменения внутренних органов и тканей при
интоксикациях животных диоксином, а также при сочетанном воздействии Т-
2 токсина и афлатоксина Вг,
- ультраструктурное обоснование пороговых доз диоксина на организм
животных для расчета ПДК в кормах для сельскохозяйственных животных;
- морфологическое обоснование использования лечебно-профилак
тического препарата димефосфона при диоксиновых интоксикациях;
- морфологическое обоснование использования аминазина и ксимедона с целью снижения изменений в органах и тканях животных при сочетанном поступлении Т-2 токсина и афлатоксина В].
Объем и структура работы'. Диссертационная работа изложена на 270
Подходы к разработке средств лечения и профилактики отравлений диоксинами
Опасность общепланетарного отравления среды обитания диоксинами и родственными им соединениями (Moore Y.A., 1973; Cattbeni A., Cavallaro G, Galli N.Y., 1978; Ramel С, 1978; Nicholson W.Y, Moore Y.A., 1979; Фокин A.B, Коломец А.Ф, 1985; Высочин В.И, 1989; Цырлов И.Б, 1990; Уэр Д, 1993) осознана сейчас не только экологами, биологами и химиками, исследующими биосферу, но и правительствами стран. Эта проблема, включающая в себя многие аспекты охраны окружающей среды и ставшая междисциплинарной, является актуальной, и ее рассмотрение представляет интерес для широкой общественности.
Под термином «диоксин» подразумевают десятки семейств химических соединений, включающих трициклические кислородосодержащие ксенобиотики (вещества, являющиеся чужеродными естественной среде и человеку) и бифенилы, не содержащие атомы кислорода. Это 75 полихлорированных дибензодиоксинов, 135 полихлорированных дибензофуранов, 210 веществ из бром органических семейств и несколько тысяч смешанных хлорбромсодержащих соединений.
Отличительной чертой представителей этих соединений является чрезвычайно высокая устойчивость к химическому и биологическому разложению; они способны сохраняться в окружающей среде, концентрироваться в биомассе и переноситься по пищевым цепям. Эти вещества являются супертоксикантами, универсальными клеточными ядами, поражающими все живое.
Классический диоксин - 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-п-диоксин (ТХДД) имеет 22 изомера и является самым токсичным веществом из всех синтетических ядов известных человечеству (Exposito М. et al, 1980; Mcriney j. et al, 1982; Федоров Л.А, Мясоедов Б.Ф, 1990; Будников Г.К, 1997; Горячев Б. и др., 1997). За высокую токсичность их относят к особому классу загрязняющих веществ - так называемым экотоксикантам. Для образования диоксинов необходимо сочетание трех условий: органика, хлор и высокая температура. Серьезной проблемой являются практически все термические процессы, так как термическое разложение технических продуктов, сжигание осадков сточных вод, муниципальных и других небезопасных при сгорании промышленных и бытовых отходов (например, ПХБ и изделия из ПВХ, целлюлозно-бумажная продукция и пластические массы) сопровождаются образованием экологически опасных количеств диоксинов (Sholz В., Engler М., 1987; Christman C.N.et al., 1988; Новиков Ю.В. и др., 1994; 1995; Трегер Ю.А., Розанов В.Н., 1997;). В особенности это касается аварийной обстановки, в частности, при пожарах на производстве. В результате термодеструкции синтетических материалов при пожарах возможны массовые острые и хронические отравления людей различными выделяющимися ксенобиотиками (Майстренко В.Н. и др., 1996; Трегер Ю.А., Розанов В.Н., 1997; Шишлова А., 1999). При хлорировании воды, содержащей фенольные вещества и лигнины, также образуются диоксины (Трегер Ю.А., Розанов В.Н., 1997).
Существует также классификация способов поступления диоксинов в биосферу. Согласно ей, выделяют три основных группы способов:
1. функционирование несовершенных, экологически небезопасных технологий производства продукции химической, целлюлозно-бумажной, металлургической промышленности. Для них всех характерны диоксинсодержащие отходы и сточные воды в период регулярной деятельности, а также большие дополнительные выбросы в случае аварийной обстановки;
2. использование химической или иной продукции, содержащей примеси (диоксинов или их предшественников) и/или продуцирующей их в процессе использования или аварии; 3. несовершенство и небезопасность технологии уничтожения, захоронения и преобразования отходов.
Перенос диоксинов от источников в объекты окружающей среды осуществляется, как правило, воздухом и водой, после чего они прочно адсорбируются почвой, концентрируясь в основном в верхних 15 см слоях почвы, мигрируя в литосфере (McCarthy Y.E. et. al., 1985). В РФ наиболее угрожаемыми по загрязнению диоксинами являются следующие территории: Центральный, Уральский и Северо-Западный регионы, Среднее Поволжье, Приморский край, Центральный черноземный район (Порядин А.Ф., 1997).
В бывшем СССР толчком к снятию секретности с исследований по диоксинам послужила экологическая катастрофа в г. Уфе, когда с территории ПО «Химпром» в ноябре 1989 г. в окружающую среду было сброшено несколько сотен тонн диоксинсодержащего фенола, что привело к заражению системы питьевого водоснабжения и массовым отравлениям населения (Вакар Н.Г. и др., 1998; Малышев В., 1999).
В городе Чапаевске Самарской области до 1987 г. на Средне-Волжском заводе химикатов производили гексахлорциклогексан (линдан) и его производные. Данное предприятие отличается высокими выбросами в окружающую среду диоксинов (в период действия завода приблизительно 740 г/год). Средняя концентрация диоксинов в атмосферном воздухе в городе составляет 0,116 пг/м (ПДК - 0,5 пг/м ). В почвах города отмечается значительное количество диоксинов. В двухкилометровой зоне от химического завода среднее содержание диоксинов составляет 141,3 нг/кг.
У взрослого населения города среди прочих заболеваний достоверно выше число спонтанных выкидышей у беременных женщин - на 27,4%, чаще отмечается рождение детей с врожденными морфогенетическими нарушениями - энцефалопатия, анемии, врожденные аномалии развития. Данные сравнивали с соответствующими показателями по Самарской области и в целом по России (Ревич Б. и др., 1998; Revich В. et al.,2001).
Биохимические показатели
Индуцирование цитогенетических изменений in vivo и in vitro в сложном и комплексном действии диоксинов на процессы наследственности побудило исследователей рассмотреть проявления не только мутагенного, но и гонадотропного воздействия. Поражение наследственного аппарата половых клеток выявлялось как во время внутриутробного формирования, так и (более часто) у половозрелого организма в результате опасной в отношении профессиональных вредностей деятельности, проживания в экологически небезопасной обстановке и др. У людей, наиболее часто встречающимися формами патологии, развивающимися при контакте с диоксинами, являются угнетение сперматогенеза, рак текстикул и эндометриоз (Wissing М., 1998).
Гонадотоксическое действие химических соединений (экзотоксикантов) существенно влияет на частоту возникновения различных дефектов у новорожденных. При этом кроме опосредованного влияния диоксинов на репродуктивную функцию человека (нарушение нейрогуморальной регуляции размножения, заболевания других органов и систем), характерно и непосредственное специфическое действие токсиканта на половую систему, вызывающее развитие патологии в виде ее структурно-функциональных изменений на различных этапах онтогенеза.
Гонадотоксические эффекты диоксиновой интоксикации могут проявляться как снижением функциональной способности женской половой системы в ходе оплодотворения, так и существенными изменениями морфологии и качества половых клеток. Клинически это проявляется в нарушении процессов оплодотворения (воздействие на гормональный фон), а также в различных сдвигах последующего развития оплодотворенной яйцеклетки, вплоть до внутриутробной гибели плода. В мужских половых железах отмечаются различной выраженности дегенеративные процессы, вплоть до полного прекращения сперматогенеза, наблюдающегося при сочетанном воздействии ксенобиотических факторов (Shopp G.M. et al., 1987; Skakebaeck H. et al., 1992; Fagi A. et al., 1997,1998; Wissing M., 1998). Взаимосвязь между патологией процессов имплантации и внутриутробного развития плода с одной стороны и влиянием токсикантов на материнский организм с другой была подробно изучена во многих исследовательских работах (Giavini Е. et al., 1982; 1983; Alonso К. et al., 1998).
У крыс обнаружены и другие нарушения репродуктивной функции, вызванные действием диоксина. Первоначальные исследования эмбриотоксического действия ТХДД у крыс были проведены на линиях Charles River CD (Courtney К., Moore J., 1979), Sprague Dawley и Wistar. Токсическое действие на организм матери отмечено при дозах более 0,5 (Sparschu G. et al., 1971) или 1 мкг/кг массы тела в день (Khera К., Ruddick J., 1973). Снижение продолжительности беременности, массы плода и выживаемости в постнатальный период описано при воздействии ТХДД в дозах 0,125-0,5 мкг/кг массы тела в день на 6-15-й или 5-14-й день беременности.
Воздействие диоксина в постнатальный период развития, по мнению ряда авторов, объясняется тем, что в процессе лактации происходит очищение организма матери от полихлорированных ксенобиотиков и их накопление в организме потомства (Abraham К. et al., 1998).
В их ходе были получены новые данные о патогенезе поражений, вызываемых ТХДД в отношении развивающегося организма. Выяснилось, что ТХДД и родственная ему группа соединений имеет непосредственное влияние на состояние рецепторов эпидермального фактора роста (ЭФР). В частности, известно, что попадание ТХДД с материнским молоком имитирует у животных-сосунков эффекты экзогенного ЭФР: раннее открывание глаз и прорезывание зубов. Предварительное введение мышам ТХДД (115 мкг/кг внутрибрюшинно) тормозило связывание ЭФР с соответствующими рецепторами изолированных плазматических мембран с гепатоцитами. Эти факты позволили предположить, что аномалии развития эмбрионов, гипотрофия новорожденных под воздействием ТХДД обусловлены его влиянием на функционирование рецепторов ЭФР. Подтверждением того явились и наблюдаемые случаи рождения детей с повышенной частотой врожденных дефектов: имеющими неврологические патологии, более позднее созревание, сниженный иммунитет у родителей. подверженный диоксиновой интоксикации (King T.G. et al., 1971; Hay A.W., 1982).
Прицельно изучая медико-биологические последствия воздействия диоксина, исследователи утверждают, что нет такого органа или системы, которые не были бы подвержены пагубному влиянию этого суперэкотоксиканта. Он нейротоксичен, поражает эндокринные железы: из-за разрушительных действий в щитовидной, поджелудочной, половых и других железах, диоксины по праву относят к гормональноподобным экотоксикантам. Согласно новым представлениям, токсикологическая агрессия токсиканта в отношении эндокринной системы во многом объясняется молекулярным сходством ТХДД и стероидных гормонов, что позволяет ему вмешиваться в функционирование системы внутриклеточной сигнализации, осуществляемое этими гормонами. В соответствии с этим, ТХДД вызывает преждевременное старение и ускоряет приближение программированной гибели клеток эндокринных желез.
Гистологические изменения внутренних органов при отравлении кроликов диоксином в дозе 1/100 ЛД50
Для экспериментальной контаминации животных использовали кристаллический Т-2 токсин и афлатоксин В синтезированные в лаборатории природных экотоксикантов ВНИВИ с.н.с. Сергейчевым А.И., отвечающие требованиям ГОСТ 10-07-301-86 и не отличающихся по физико-химическим параметрам и токсическим свойствам от существующих стандартов. В качестве продуцентов использовали грибы Fusarium sporotrichiella шт. 2m-15 предоставленный Котиком Л.П. Aspergillus flavus из коллекции ВНИВИ.
Острую и хроническую интоксикацию подопытных животных Т-2 токсином и афлатоксином В і производили в виде 5%-ного водно-спиртового раствора путем орального введения токсинов в дозе 1/10 ЛД5о- Препараты вводили внутрь с использованием резиновой бутылки, болюсов, шприца, иглы с оливой.
Изучение бактерицидных, фунгицидных и фунгистатических свойств химических соединений проводили по общепринятым методикам (Ведьмина Е.А., Фурер Н.М, 1964; Перший Г.Н., 1973).
Для электронной микроскопии смывы микроорганизмов E.coli, St.aureus плотностью 2 млрд. микробных тел, взвесь спор A.niger с концентрацией 200 тыс. микробных тел в 1 мл физиологического раствора смешивали с исследуемым раствором в соотношении 1:1. Экспозиция препарата с микробами продолжалась от 15 секунд до 10 минут, спорами Asp. niger - от 5 до 120 минут. После окончания срока экспозиции проводили нейтрализацию препарата общепринятыми методами (Поляков А.А., 1975); материалы подвергались центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 минут. После чего надосад очную жидкость сливали, осадок подвергали промыванию физиологическим раствором с последующим повтором центрифугирования для удаления остаточного количества препарата. Полученную бактериальную массу подвергали электронно-микроскопическому исследованию. В качестве контроля использовали культуры микроорганизмов, обработанных физиологическим раствором.
Для негативного контрастирования микроорганизмов использовали 2%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты. Полученные препараты оценивали с использованием электронного микроскопа просвечивающего типа с минилинзами ПЭМ-100 при инструментальном увеличении 15-45 тыс.
Цифровой материал подвергался статистической обработке с вычислением критерия Стъюдента на персональном компьютере с использованием стандартной программы вариационной статистики Microsoft Excel.
На отдельных этапах работа проводилась совместно с доцентом В.В. Титовым, проф. Ю.А. Зимаковым, проф. В.А. Новиковым, проф. И.Н. Заляловым, н.с. Д.Х. Нигматовым, Э.А. Галиевым, Р.З. Гибадуллиным, А.А. Ивановым, А.И. Сергейчевым. 3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для изучения влияния диоксина в абсолютно смертельной дозе при однократных интоксикациях морские свинки, отобранные по принципу аналогов, были разделены на 2 группы по 6 животных в каждой группе. Первая группа служила контролем, которым в корм добавляли соответствующую дозу растительного масла, используемого в качестве растворителя диоксина. Животным второй группы однократно, внутрижелудочно вводили масляный раствор диоксина в дозе 2 мкг/кг массы тела.
Острая токсичность диоксина в дозе ЛД50 изучалась на 96 белых крысах обоего пола массой 190-230г, 18 кроликах- самцах, живой массой 3-3,5 кг, 4 овцах. Животные были разделены на группы. Первой группе, служившей биологическим контролем, в корм добавляли соответствующую дозу растительного масла, используемого в качестве растворителя диоксина. Животным второй группы внутрижелудочно, однократно вводили масляный раствор диоксина в дозе ЛД5о, равной 61 мкг/кг массы тела для белых крыс, 30 мкг/кг - для кроликов и 200 мкг/кг - для овец.
Биохимические показатели По литературным данным (Горденина Т.И., 1982; Временная инструкция по лечению отравлений диоксином, 1986; Kocibi RJ.,1986; Ahlborg U.G., Wazh F., Hakanson E, 1987; Hakansson H., Elert A., Ahlborg U.G., 1987; Hakanson H., Johansson L., Manzoor E., 1987; Отчет о НИР, 1996) одним из наиболее постоянных положительных клинико-лабораторных тестов при отравлении диоксином является количественное изменение порфиринов в моче, и исходя из этих соображений нами совместно с сотрудниками отдела токсикологии, было проведено исследование мочи на содержание уропорфирина и копропорфирина.
Исследования мочи при введении диоксина морским свинкам в абсолютно смертельной дозе (табл. 1) показали статистически достоверное увеличение содержание уропорфирина на 5 сутки эксперимента, которое составило 8,1 ± 2,1 мкг/г креатинина. В ходе дальнейших исследований происходило прогрессирующее статистически достоверное увеличение содержания уропорфирина в моче подопытных животных и к концу опыта составило 20,8 ± 2,2 мкг/г креатинина, что выше в 8,5 раз по сравнению с контрольным показателем.
В содержании копропорфинина в моче исследуемых животных также отмечалась статистически достоверная тенденция к увеличению с 5 суток от момента введения диоксина, и это увеличение продолжалось вплоть до конца эксперимента, которое статистически достоверно составило на 20 сутки опыта 67,4 ± 4,5 мкг/г креатинина, что в 5 раз превышало контрольное значение.
Существенных изменений в содержании уропорфирина и копропорфирина в моче контрольных морских свинок на всем протяжении опыта отмечено не было.
Таким образом, проведенные исследования показали, что при остром отравлении диоксином морских свинок в абсолютно смертельной дозе происходит статистически достоверное увеличение уропорфирина и копропорфирина в моче подопытных животных на всем протяжении эксперимента.
Патоморфологические исследования при хроническом отравлении животных диоксином в дозе 1/200 ЛД5о на фоне применения лечебно-профилактических препаратов
Электронное микроскопирование позволяет констатировать следующее: гепатоциты печени контрольных крыс имели полигональную форму размером 20-30 мкм (рис. 46). Цитоплазма была богата различными видами органелл и включений. Особенно многочисленными были митохондрии, что связано с их разнообразными по характеру метаболическими функциями. В центральной части гепатоцита расположено ядро, содержимое которого представляло тонкую зернистую массу равномерной электронной плотности. Ядрышко обладало большей электронной плотностью и находилось в центре (эксцентрично). Митохондрии были окружены двойной мембраной, от внутреннего слоя которой отходили перегородки (кристы), не достигающие противоположной стороны. Матрикс митохондрий представлял собой вещество равномерной электронной плотности. Хорошо был развит как гранулярный, так и гладкий эндоплазматический ретикулум. Гранулярный эндоплазматический ретикулум чаще локализовался вокруг митохондрий и оболочки ядра, гладкий - вблизи клеточной мембраны и в богатых гликогеном областях цитоплазмы. Пластинчатый комплекс, между ядром и той частью клеточной представленный группой мембран и канальцев располагался оболочки, где имелся желчный капилляр.
Через 10 суток после введения диоксина на уровне 1/200 ЛД50 в печени подопытных животных наблюдали выраженную мелкокапельную жировую инфильтрацию цитоплазмы гепатоцитов, полиморфизм их ядер. Повсеместно в органе обнаруживали очаги некробиоза. Как проявление нарушения транскапиллярного обмена отмечали значительные расширения перисинусоидальных пространств и выраженное полнокровие сосудов портальной системы. Ультраструктурные изменения характеризовались постепенным просветлением матрикса ядра в сочетании с нарастающей гетерохроматизацией. Массивные глыбки хроматина располагались в краевых зонах, прилегающих к кариолемме. В митохондриях наблюдали фрагментацию крист с частичным разрушением мембран, в то же время обнаруживали гепатоциты с четкими контурами крист. Количество рибосом на мембранах канальцев гранулярной эндоплазматической сети заметно уменьшалось (рис.47).
После 20-суточной затравки жировая инфильтрация в печени достигла максимальной выраженности. Большинство гепатоцитов приобрели перстневидную форму. Вместе с тем в паренхиме органа появились более обширные участки с явлениями вакуольной дистрофии и некроза, пограничная зона которых была обильно инфильтрирована гистиоцитами. Изменения в ультраструктуре гепатоцитов характеризовались зигзагообразной (извилистой) формой кариолеммы, которая местами была лизирована. Хроматин ядерного вещества был резко уплотнен и располагался по периферии, что отражало подавление синтеза нуклеопротеидов. В цитоплазме этих клеток обнаруживались многочисленные лизосомы. Митохондрии имели различные размеры, одновременно с их гипертрофией отмечали деструктивные явления в виде лизиса, расслоения мембран и просветления матрикса. Профили цистерн гранулярной и агранулярной 112 эндоплазматической сети становились резко расширенными, а их мембраны местами были разрушены. В цитоплазме малочисленных звездчатых ретикулоэндотелиоцитов отмечали явления эритрофагии (рис.48,49). Через 30 суток патоморфологические изменения в печени, отмеченные в предыдущие сроки исследования, продолжали прогрессировать. Ультраструктурные изменения характеризовались резким уменьшением содержания гранул гликогена в цитоплазме гепатоцитов по сравнению с животными, подвергнутыми 10 и 20-суточному воздействию диоксина. Наблюдали полное разрушение структуры печеночных клеток, что свидетельствовало о возникновении тотального некроза в органе. В сохранившихся клетках отмечали дальнейшее нарастание процесса вакуолизации эндоплазматической сети, пластинчатого комплекса и митохондрий (рис.50).
Через 10 суток после 30-суточной затравки у большинства животных вышеотмеченные дистрофически-некробиотические изменения сохранялись. Регенераторные процессы в органе выявлялись только на уровне ультраструктурных изменений. В ядрах сохранившихся гепатоцитов нарастал процесс эухроматизации. Постепенно исчезала вакуолизация матрикса и появлялись внутренние перегородки митохондрий. Несмотря на расширенное состояние канальцев эндоплазматической сети на их поверхности появлялись рибосомы (рис.51).
Ультраструктура клеток селезенки подопытных животных по сравнению с контрольными (рис. 52), показывала также выраженные деструкции органоидов. Так, после 10-дневной затравки диоксином в лимфоцитах обнаружено смещение ядрышка к периферии ядра, конденсирование хроматина, который находился по внутренней поверхности ядерной мембраны, набухание и вакуолизация митохондрий (рис. 53), прогрессирующая вакуолизация канальцев цистерн аппарата Гольджи, что особенно характерно для плазмоидов после 20-ти и 30-ти дневной затравки 113 (рис. 54). Через 10 дней после окончания затравки наблюдали постепенное восстановление ультраструктур клеток. На рис. 55 видно, что мембраны ЭПС локализованы в основном около митохондрий и ядра, полости ее местами еще несколько расширены, рибосомы хорошо определялись не только на ее мембранах, но и свободно в цитоплазме в виде мелких гранул. В митохондриях перегородки были восстановлены не полностью, наружные оболочки выражены отчетливо. В почках подопытных животных на 10 сутки эксперимента наблюдали аналогичные ультраструктурные изменения клеток. Наиболее характерными были резко выраженная вакуолизация митохондрий уже после 10-дневной затравки (рис. 56), цитоплазма содержала множество крупных и мелких вакуолей, ЭПС почти полностью подвергалась вакуолизации (рис. 57), содержимое ядра несколько просветлилось, двойная оболочка просматривалась отчетливо. После 30 дневной затравки изменения органоидов клеток, отмеченные в ранних сроках продолжали прогрессировать. Нарастали изменения митохондрий, ЭПС и других органоидов, а также увеличивалось количество измененных клеток. В дальнейшем, через 10 дней после окончания затравки начинали появляться отчетливые признаки восстановления ультраструктур клеток почек. Так, размеры митохондрий приближались к нормальным, но они все же еще оставались набухшими, перегородки в них восстанавливались не полностью, матрикс был равномерно распределен по митохондриям, наружные оболочки хорошо выражены (рис. 58). В значительной степени восстанавливалась ЭПС. Однако все еще была заметна вакуолизация цитоплазмы некоторых клеток. Канальцы ретикулума расширены. Полости и цистерны пластинчатого комплекса также несколько расширены. В некоторых клетках отмечали особенно интенсивное развитие ЭПС, на мембранах которых располагалось большое количество рибосом.
