Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Тканевые препараты в медицине и ветеринарии 12
1.2. Плацентарные препараты 30
1.3. Способы получения тканевых препаратов ; 45
1.4. Механизм действия тканевых препаратов 51
1.5. Заключение по обзору 61
2. Материал, объем и методы исследований 62
3. Результаты собственных исследований 75
3.1. Технологические параметры, физико-химические свойства и биологи
ческая активность продуктов криофракционированияплаценты свиной...75
3.1.1. Биологическая активность криопродуктов на основе плаценты свиной в зависимости от технологических параметров криофракцио-нирования 75
3.1.2. Общая характеристика лекарственных средств, полученных на основе криосублимационного фракционирования плаценты свиной 89
3.2. Токсикологическая характеристика препаратов криотон, липотон и аминотон 95
3.2.1. Острая токсичность 95
3.2.2. Хроническая токсичность 98
3.2.3. Субхроническая токсичность липотона и аминотона 110
3.2.3.1. Опыты на кроликах 110
3.2.3.2. Опыты на телятах 116
3.2.4. Эмбриотоксическое и тератогенное действие 120
3.2.5. Местнораздражающее действие 123
3.2.6. Аллергенные свойства 127
3.2.7. Мутагенное действие 133
3.2.8. Влияние липотона и аминотона на качество мясопродуктов 134
3.2.9. Заключение 137
3.3. Экспериментальная фармакология 138
3.3.1. Иммуномодулирующие свойства липотона и аминотона 138
3.3.2. Антиоксидантные свойства препаратов плаценты 143
3.3.2.1. Изучение антиокислительных свойств криотона, липотона и аминотона 143
3.3.2.2. Изучение антипероксидных свойств препаратов плаценты 146
3.3.2.3. Изучение антирадикальных свойств препаратов на основе плаценты свиной 147
3.3.2.4. Влияние препаратов плаценты на интенсивность ПОЛ при их применении здоровым животным 148
3.3.3. Противовоспалительное и репаративное действие препаратов плаценты 151
3.3.3.1. Противовоспалительное действие липотона и аминотона 151
3.3.3.2. Противоязвенное действие липотона и аминотона 156
3.3.3.3. Влияние липотона и аминотона на регенерацию кожи 158
3.3.3.4. Анальгетическое действие липотона и аминотона 167
3.3.4. Изучение гепатопротекторного действия криопрепаратов 169
3.3.4.1. Гепатопротекторное действие липотона 169
3.3.4.2. Гепатопротекторное действие аминотона 174
3.3.5. Стресс-протекторное действие липотона и аминотона 178
3.3.5.1. Исследования на инфузориях Paramecium caudatum 178
3.3.5.2. Эмоционально-физическая нагрузка 180
3.3.5.3. Адаптогенные свойства липотона и аминотона при иммобилизационном стрессе 183
3.3.5.4. Влияние криотона на кожу кроликов 194
3.4. Клиническая фармакология препаратов 200
3.4.1. Криотон 200
3.4.1.1. Опыт на норках 200
3.4.2. Липотон 202
3.4.2.1. Изучение терапевтической эффективности липотона при акушерско-гинекологической патологии укоров 202
3.4.2.2. Изучение терапевтической эффективности липотона 205
при гепатодистрофиях у крупного рогатого скота 205
3.4.2.3. Лечение липидоза (жировой дистрофии печени) у кошек 207
3.4.2.4. Применение липотона для профилактики отрицательных последствий отъемного стресса у поросят 209
3.4.3. Аминотон 215
3.4.3.1. Опыты на цыплятах-бройлерах 215
3.4.3.2. Применение аминотона в период снижения интенсивной яйцекладки кур-несушек 219
3.4.3.3. Применение аминотона для повышения резистентности и профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят 224
4. Обсуждение результатов 227
5. Выводы 255
6. Практические предложения 260
7. Список использованной литературы
- Плацентарные препараты
- Механизм действия тканевых препаратов
- Общая характеристика лекарственных средств, полученных на основе криосублимационного фракционирования плаценты свиной
- Влияние препаратов плаценты на интенсивность ПОЛ при их применении здоровым животным
Введение к работе
Актуальность темы. Создание широкой сети промышленных животноводческих комплексов поставило перед ветеринарной наукой ряд проблем, связанных с совершенствованием технологических систем на животноводческих комплексах и специализированных фермах, обеспечивающих получение здорового приплода с высокой резистентностью и реактивностью, с одной стороны, разработкой более эффективных средств и способов общей неспецифической и специфической профилактики и терапии болезней животных, особенно молодняка, с другой (СМ. Сулейманов, 2000; B.C. Шипилов с со-авт., 1987; А.Г. Шахов с соавт., 1997, 2000 и др.). Вместе с тем, очевидно, что применение лекарственных средств специфического этиопатогенного действия не может устранить основную причину патологического состояния, являющегося в большинстве случаев следствием нарушения метаболизма - вы-сокоинтегрированного и целенаправленного процесса, обеспечивающего обмен веществ и энергии между клеткой и средой. В свою очередь, общее нарушение обменных процессов зачастую сопровождается снижением иммунологической резистентности организма животных. Если принять во внимание то, что даже в простейшей бактериальной клетке может протекать одновременно более тысячи взаимосвязанных реакций, то нетрудно представить, насколько сложен метаболизм у высших организмов, и, соответственно, сложна проблема создания лекарственных средств для его коррекции (И.М. Ганджа с соавт., 1985; A.M. Земсков, 1994; А.Г. Шахов с соавт., 1999; B.C. Бузлама, 2000,2003; Д.А. Харкевич, 2000; W.K. Contrib et.al., 1984).
Прогрессирующий рост заболеваний животных, обусловленный экологическими и социальными факторами, выдвигает проблему создания лекарственных средств для коррекции метаболизма, в том числе иммунитета, в одну из важнейших в медицине и ветеринарии (В.Т. Самохин, 1988; Ю.А. Гри-невич, 1989; Г.Н. Дранник, 1994; Л.Х. Гаркави, 1990; СВ. Шабунин с соавт., 1996; А.Ф. Исмагилова, 1997; В.Д. Соколов, 1997; Г.Г. Шитов, 1999; В.И. Беляев, 2000; М.И. Рецкий с соавт., 2001).
В последние годы наметилась тенденция к созданию и использованию препаратов, изготовленных из природного сырья. При этом многие из них обладают разносторонней биологической активностью и в то же время безвредны для организма (К.К. Мовсум-Заде с соавт., 1972; Н.А. Пучковская с соавт., 1975; Т.В. Дегтяренко, 1995; В.Х. Хавинсон, 2001, с соавт., 2001; C.S. Loebet.al., 1992).
Препараты природного происхождения обладают специфическим и общим неспецифическим положительным действием на весь организм. Среди них широкое распространение получили вакцины, сыворотки, тканевые препараты, антибиотики, витамины, комплексы микроэлементов (В.Т. Само-хин с соавт., 1988; Е.Н. Романов с соавт., 2000; А.Е. Белов, 2001; Д.В. Пчельников с соавт., 2003; Т.Н. Вовк, 2005).
Тканевые препараты обеспечивают максимально возможную видовую специфичность исходного сырья, так как чем ближе природа белкового вещества к организму животного, тем выше возможность достижения цели. Оптимальным вариантом для получения лекарственного средства является использование органов и тканей человека и животных (Г.Г. Шитов, 1991; СМ. Грибко, 1998; А.Ф. Колчина, 2000; P.M. Полковников, 2000).
Практическое значение применения тканевых препаратов при болезнях молодняка, бесплодии и ряде заболеваний трудно поддающихся лечению исключительно велико (Б.И. Кузник с соавт., 1998; В.Г. Морозов с соавт., 2000; В.И. Беляев с соавт., 2001). Тканевые препараты, введенные в организм животных, способствуют восстановлению нарушенного обмена веществ, активизируют функциональную деятельность организма и повышают устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды.
Основу наиболее эффективных современных технологий переработки биологического сырья составляют такие методы, которые максимально сохраняют его нативную молекулярную структуру, витаминный, гормональный состав, тем самым, сохраняя его высокую биологическую активность. Наиболее полно этим требованиям удовлетворяют криогенные технологии, при
8 реализации которых перерабатываемое сырье находится при отрицательных температурах (А.Г. Подольский, А.И. Осецкий, 2001). При этом ингибируют-ся окислительные процессы в перерабатываемом сырье, денатурация и диссоциация наиболее важных молекулярных комплексов.
Новый технологический подход расширяет перечень лекарственных препаратов с использованием в качестве исходного сырья тканей плаценты сельскохозяйственных животных.
С учетом выше изложенного, были определены направленность исследований, их методическое и материальное обеспечение, объем, разнообразие, широта и глубина экспериментальных разработок и клинической апробации новых препаратов.
Цель н задачи исследований. Целью настоящего исследования была разработка, экспериментальная оценка, клинико-биохимическое изучение препаратов из свиной плаценты, и, с учетом полученных данных, сформулировать теоретические и методологические принципы получения ветеринарных фармакологических препаратов на основе криогенных технологий.
В соответствии с поставленной целью решены следующие задачи:
- разработать новые препараты из плаценты свиной на основе криоген
ных технологий;
дать фармако-токсикологическую характеристику разработанных препаратов;
изучить противовоспалительные, репаративные, иммуностимулирующие, гепатопротекторные, стресспротекторные свойства препаратов на основе свиной плаценты;
разработать показания к применению разработанных препаратов и провести их клинические испытания;
подготовить нормативно-техническую документацию на новые препараты.
Научная новизна. Впервые на основе новейших методов криофрак-ционирования биологических тканей разработаны її экспериментально изу-
9 чены препараты из свиной плаценты: липотон, аминотон и криотон. В результате выполнения работы научно аргументировано, экспериментально и клинически обоснована перспективность использования этих препаратов в ветеринарной медицине и животноводстве. Впервые изучены биохимические механизмы их адаптогенного, стресс-корректорного, иммуномодулирующе-го, противовоспалительного, гепатопротекторного действия.
Практическая значимость и реализация результатов исследований.
На основании результатов исследований разработаны технические условия и ТР, регламентирующие технологический процесс производства препаратов: криотон (ТУ У 24.4.31293151.033-03); аминотон (ТУ У 24.4.31293151.031:2005) и липотон (ТУ У 24.4.31293151.032:2005).
Департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины утверждены временное наставление по применению - криотона (протокол № 8 от 1.09.2003). Департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины зарегистрированы препараты - аминотон (№ 2034-02-720-06 от 06.10.2006.) и липотон (№ 2035-02-721-06 от 06.10.2006). Широкие производственные испытания криотона, липотона и аминотона разрешены Главным государственным ветеринарным инспектором Воронежской области (Временные наставления на криотон, липотон и аминотон от 11.01.2005).
Нормативно-техническая документация на препараты липотон и аминотон представлена на регистрацию в Федеральную службу ветеринарного и фи-тосанитарного надзора РФ.
Результаты проведенных исследований вошли в: Методическое пособие «Экспресс-биотест. Биологический мониторинг экологический систем», рассмотренное и одобренное секцией ветеринарной медицины Россельхозакаде-мии (протокол № 5 от 12.11.1996); Методическое пособие «Скрининг адапто-генов - стресс-корректоров», рассмотренное и одобренное секцией ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №1 от 30.03.2000); «Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субинволюции
10 матки у коров» и «Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субклинического мастита у свиноматок», рассмотренные и одобренные секцией «Патология, фармакология и терапия» Отделения ветеринарной медицины (протокол №1 от 24.03.2005).
Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований были представлены: на заседаниях Ученого Совета института криогенных технологий (Харьков, 2003-2004 г.г.); на заседании межведомственного научно-технического Совета Росветкормсоюза (Москва, 2004); на 2,3,4 съездах общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004, 2005, 2006); на заседаниях Ветфармсовета Украины (Львов, 2003, 2006); на Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); на 2 региональной конференции практикующих ветеринарных врачей (Воронеж, 2004); на Международном координационном совещании «Новые биотропные препараты и косметологические средства для лечения и ухода непродуктивных домашних животных» (Харьков, 2004); на XIII и XIV Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2005, 2006 ); на 1 научно-практической конференции «Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород» (Воронеж, 2005); на Ш-ей Международной конференции «Экстракция органических соединений» ЭОС-2005 (Воронеж, 2005); на Международной конференции «Актуальные проблемы и достижения криобиологии и криомедицины. Структурная и функциональная организация стволовых клеток в условиях действия низких температур» (Харьков, 2005); на 9-й региональной научЕю-практической конференции «Проблемы экологии и экологической безопасности Центрального Черноземья РФ» (Липецк, 2005); на 1 научно-практической конференции «Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород» (Воронеж, 2006); на Международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А. «Акту-
альные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных» (Воронеж, 2006).
Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 32 печатных работах, в том числе в 5 статях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Аграрная наука», «Птицеводство», «Ветеринарная патология»), 2 методических рекомендациях и 2 методических пособиях, 5 патентах.
Основные положения, выносимые на защиту.
о возможности создания на основе криогенных технологий активно действующих веществ, для получения лекарственных форм ветеринарных препаратов;
о взаимосвязи криотехнологий фракционирования плаценты свиной с биологической активностью получаемых продуктов;
о биохимических механизмах фармакологического действия препаратов, полученных из различных криофракций свиной плаценты;
о клинической эффективности применения ветеринарных фармакологических препаратов на основе криофракционирования плаценты свиной.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 319 страницах и включает введение, обзор литературы, материал, объем и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, предложения, список литературы и приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 86 таблицами и 46 рисунками. Список литературы включает 562 источника, в том числе 156 на иностранных языках.
Плацентарные препараты
Так, в цитоплазме клеток эпителия амниона содержатся липидные включения, количество которых составляет до 470 мг/100 г ткани. Их биохимические параметры определяются наличием триглицеридов, неполярных липидов, фосфолипидов, свободного холестерина, его эфиров, кефалина, диглицеридов. Эпителий амниона содержит много арахидоновых составляющих в триглицеридах, а также для него характерно наличие большого количества гликогена. Ткани стромы амниона богаты коллагеном.
В состав околоплодных вод, образующихся в результате секреции эпителия амниона, входят белки, жиры, углеводы, калий, кальций, натрий, микроэлементы, мочевина, гормоны, лизоцим, молочная и другие кислоты, ферменты, вещества, способствующие сокращению матки, действующие на свертываемость крови. При этом в амниотической жидкости отсутствуют белки с молекулярной массой более 20000 Да.
Народная медицина издавна считала плаценту чрезвычайно эффективным средством стимуляции защитных сил организма и омоложения, а также приписывала ей мощное энергетическое воздействие. Первые научные упоминания о плаценте содержатся в трудах Гиппократа и Авиценны. Начиная с 60-х годов прошлого века, изучение плаценты проводилось во многих странах мира, и были получены многочисленные научные подтверждения благотворного влияния плаценты на организм человека.
Особенно велика роль плаценты в восточной медицине. Восточные народы знали о целебных свойствах плаценты и успешно использовали изготовленный из нее порошок для лечения различных заболеваний еще много веков назад. Уже к 60-м годам XX века в Японии были проведены десятки тысяч клинических исследований, и плацента успешно применялась при лечении более 80 заболеваний. Были получены многочисленные научные подтверждения благотворного влияния плаценты на кожу, поэтому плацентарный экстракт стал широко использоваться и в косметологии для решения различных эстетических проблем. В частности, о пользе применения плаценты в косметологии (Patent JP10101545; Patent JP2001322943; Patent JP2002128682) говорит то, что она содержит все необходимые нашей коже компоненты (аминокислоты, ферменты, витамины, микроэлементы и т.д.) и природа не создала пока ничего лучшего для сохранения молодости.
При лечении трофических язв путем нанесения на раневую поверхность тонкого слоя сухого экстракта плаценты способствует началу эпители-зации ткани на 3-4-е сутки, а окончательное заживление язвы происходит через 20-25 дней в зависимости от ее размеров (СВ. Первушкин, 1998). Использование сухого экстракта плаценты человека позволяет быстро устранить воспалительное раздражение кожи, окружающей язву, что способствует росту эпителия и ее лучшему заживлению, сокращает сроки заживления язвы и время пребывания больного в стационаре.
Амнион, как и плацента, содержит большое количество белков, гормонов, других биологически активных веществ, поэтому может служить исходным материалом для получения тканевых препаратов - биогенных стимуляторов.
Метод лечения раневых инфекций, предложенный Н.И. Краузе (1949), путем подсадки под кожу околоплодной оболочки человеческого плода, предварительно обработанной хлором, обеспечивал полное выздоровление многих практически безнадежных больных. По мнению Н.И. Краузе (1944), подкожно введеная химически денатурированная ткань, способная легко растворяться под влиянием протеолитических ферментов организма, активизировать местно факторы протеолиза, и, как отражение этого местного процесса, является стимуляция генерализованных протеолитических реакций, способствующих проявлению лечебного эффекта.
Работы Н.С. Рейляну (А.с. СССР №948001) явились творческим развитием исследований Н.И. Краузе. Основная идея Н.С. Рейляну состояла в том, чтобы заменить трудоемкий метод лечения «подсадкой» - на инъекционный. Для этого предварительно измельчают обработанную околоплодную оболочку (амнион) до таких размеров, чтобы суспензия могла пройти через иглу шприца. Практическая реализация этой работы позволила получить препарат амниоцен (А.с. СССР №1392684), который разрешен к применению в медицине в 1989 году.
Имеются сведения о применении амниотическои ткани в офтальмологической практике, как шовного материала при операциях на роговице, в качестве временных повязок при лечении ожогов. Предполагается, что клетки амниона человека выделяют факторы, регулирующие липолитическую активность клеток других тканей, ускоряя тем самым их рост (Н.К. Горлина, И.Н. Головастиков, 1981). Известно применение препаратов из консервированной амнионической оболочки, например, при лечении язвы желудка и двеннадцатиперстной кишки, альвеолитов и других заболеваний (Н.И. Краузе, 1944; В.И. Квашин, А.И. Потеха, 1971; Н.М. Городнюк, 1980; Р. JP10139672). В 1999 году запатентован способ получения иммуноактивных веществ из околоплодных тканей человека (M.I. Борщевська, В.П. Георгієв-ський, 1999). Препарат для наружного применения, изготовленный из амниотическои оболочки, обработанный глицерином и замороженный, ускоряет заживление инфицированных ран у животных в 1,5-2 раза. При лечении маститов у коз и собак препаратом, полученным на основе амниотическои ткани, признаки заболевания исчезали через 2 дня (Ю.Е. Беляев, 2000).
Механизм действия тканевых препаратов
К настоящему времени накоплен довольно обширный материал о терапевтическом действии биогенных стимуляторов. Основной отличительной особенностью биогенных стимуляторов является то, что они, имея целый комплекс биологически активных веществ, принимают участие в индукции, репрессии, обратимой ингибиции и повышении активности различных фер ментов. Благодаря этому они могут оказывать воздействие на метаболизм не только больного, но и относительно здорового организма без выраженной патологии.
Механизм действия биогенных стимуляторов изучался В.В. Ковальским, А.В. Благовещенским, Л.И. Палладиной, В.Н. Кефер и др. Установлено, что при действии пониженных температур на ткани животных в отдельных реакциях обмена веществ происходят неодинаковые изменения температурного коэффициента скорости и глубины реакции. В охлажденных тканях окислительно-восстановительные процессы преобладают над гидролитическими. В результате окислительного дезаминирования аминокислот, образуется комплекс соединений с повышенным уровнем энергии (А.В. Благовещенский, 1948).
В первый период развития тканевой терапии некоторые ученые считали, что по аналогии с гистолизатами М.П. Тушнова активными веществами тканевых препаратов являются белки и полипептиды. В дальнешем исследованиями А.В. Благовещенского, В.В. Ковальского, Л.И. Палладиной, В.В. Гудиной, В.В. Скородинской было установлено, что белки не обуславливают биологической активности организма. Н.С. Харченко работая с плацентой, высказал мнение, что биогенные стимуляторы являются ферментами и гормонами. Однако работами В.П. Филатова, В.А. Бибера, Н.М. Чикало, А.Ф. Сысоева, И.М. Фарбман и М.В. Голубцовой было показано, что биологические стимуляторы не являются гормонами.
В консервированных тканях в результате изменения внутриклеточной реакции происходит накопление кислых продуктов, относящихся преимущественно к сложному комплексу веществ (с большим молекулярным весом), близких к дикарбоновым кислотам.
По исследованиям ряда ученых (А.В Благовещенский, Н.М. Чикало, В.В. Ковальский, В.А. Бибер, А.Ф. Сысоев и др., 1948,1956), химизм их происхождения отчасти можно объяснить тем, что в условиях пониженных температур происходит уменьшение дыхательного коэффициента и обогащение каней кислородом, который расходуется на образование продуктов неполного окисления, в частности, на образование органических кислот, стимулирующее действие которых связано с их двухосновностыо. Это дало основание В.П. Филатову и В.А. Биберу отнести биогенные стимуляторы по их строению к дикарбоновым кислотам, оксикислотам жирного ряда, к непредельным ароматическим кислотам и ароматическим кислотам с большим молекулярным весом.
Второе важнейшее направление в теории о природе биогенных стимуляторов состоит в том, что биогенные стимуляторы представляют собой продукты распада тканевых веществ, продукты расщепления белков типа нуклеопротеидов и мукоплисахаридов, широко распространенных в соединительной ткани животных, а также недоокисленные продукты обмена (Н.И. Краузе, А.Г. Бржозовский и др., 1960). Этими исследованиями большое значение отводится накоплению в тканях азотистых веществ, простетических групп ферментов, объясняющее высокую биологическую активность тканевых препаратов.
Установлено, что под влиянием тканевых препаратов нормализуется обмен веществ, повышается способность ферментов организма катализировать биохимические реакции при меньшей затрате энергии для этих реакций. Механизм действия изучаемых препаратов можно представить как активирование главным образом энергетического обеспечения специфических защитных реакций организма за счет регуляции скорости ключевых ферментных систем, а также стимуляции их биосинтеза.
Считается, что основные действующие начала ферментного происхождения и продукты расщепления белков действуют на рецепторные субстанции организма, а через них активизируют регулирующее влияние центральной нервной системы. В связи с этим И.П. Павлов писал: «Как ни много вообще фармакология занимается влиянием разных веществ на нервную систему, обычный анализ этого влияния оставляет еще много и много желать. Важнейшим недочетом надо считать крайне малое сравнительно с важно стью предмета изучение действия различных веществ на периферические окончания центростремительных нервов. Очевидно, что в жизни сложного организма рефлекс есть существеннейшее и наиболее частое нервное явление. При помощи его устанавливается постоянное, правильное и точное соотношение частей организма между собой и отношение целого организма к окружающим условиям. Исходный же пункт рефлекса составляет раздражение периферических окончаний центростремительных нервов. Этими окончаниями пронизаны все органы и все ткани их. Эти окончания необходимо представлять как крайне разнообразные, специфические, подобно окончаниям нервов органов чувств, приспособленные каждое к своему своеобразному раздражителю механического, физического или химического характера образования. Степенью их работы в каждый данный момент определяется размер и комбинация деятельностей организма. Отсюда понятно, что весьма многие вещества, введенные в организм, нарушают его равновесие вследствие тех или других отношений к периферическим окончаниям как по преимуществу чувствительным, легко реагирующим частям животного тела» (И.П. Павлов. Полное собрание сочинений, 1940, т.1, стр. 324).
Общая характеристика лекарственных средств, полученных на основе криосублимационного фракционирования плаценты свиной
В результате данного скрининга получены оптимальные значения температур хлодоновой экстракции, соответствующие максимальной биологической активности липофильной фракции (30-37ПС).
Принципиальная схема получения гидрофильной фракции включает в себя два основных блока - экстракции гидрофильных веществ физиологическим раствором (на основе классической схемы технологии экстракции), а также низкотемпературного концентрирования экстракта (рис. 8). Гидрофильная фракция - является третьим целевым продуктом. Диапазон рабочих температур может варьироваться от 10 до 40С. Процесс можно интенсифицировать при помощи кавитационного эффекта (струйного, пульсационного или ультразвукового).
В зависимости от изменения температурного режима экстракции, а также режима работы смешивающих устройств, получено 12 серий гидрофильной фракции плаценты свиной. Нагрузка в ВОДН1(ЇІОДГОТОВЛЄЇШОЄ экстрактор ) [_ сырье j Г Слив в гидрофильной фракции плаценты свиной
Критерием оценки качества препарата нами было выбрано содержание свободных аминокислот в его составе. Выявлена закономерность изменения физико-химического состава и биологической активности гидрофильной фракции от параметров технологического процесса (рис. 9). Из данных таблицы 7 видно, что оптимум экстракции находится в пределах 35-36С, что ведет к увеличению выживаемости инфузорий на 83%. Применение кавета-ционного эффекта увеличивает концентрацию действующих веществ, и соответственно биологическую активность препарата.
Установлено, что в зависимости от условий получения, физико-химического состава гидрофильная фракция обладает различной биологической активностью. В высоких концентрациях действие гидрофильной фракции можно назвать индифферентным. Разные серии гидрофильной фракции в разведении 1:1000 способствуют повышению сопротивляемости клеток на 14,8-83,0%. Дальнейшее разведение препарата ведет к снижению его активности, хотя у серии Р6 она остается на достаточно высоком уровне и в разведении 1:1000000 (табл. 7).
В результате опытов на P. caudatum для дальнейших исследований на организменном уровне было отобрано 3 препарата с наибольшим коэффициентом защиты (Р1, Р6, Р11). При испытании на лабораторных животных (модель эмоционально-физической нагрузки) установлено, что наиболее активной оказалась серия Р6. Препарат в дозе 0,1 мл/кг массы тела повышает выносливость белых мышей при плавании с грузом по сравнению с контролем на 65,1% (рис. 10). Таким образом, установлено, что наиболее активная гидрофильная фракция получается при проведении экстракции в температурном режиме 35-37С и применении кавитатора.
В целом, изучение зависимости биологической активности плацентарных препаратов от технологических параметров их получения с использованием трех биологических тестов (на культуре инфузорий P. caudatum, тест эмоционально-физической нагрузки на белых мышах, модель иммобилиза-ционного стресса на белых крысах) позволило определить оптимальные значения технологических режимов и получить препараты с максимальной биологической активностью и заранее прогнозируемыми свойствами.
В опытах на Paramecium caudatum установлено, что наибольшую биологическую активность низкомолекулярная фракция свиной плаценты имеет при следующих параметрах низкотемпературной сублимации: температура от -20С до 0С в течение 12 часов. Далее температура от 0С до 20С в течение 4 часов; от 20С до 40С в течение 4 часов. Из полученного продукта была изготовлена лекарственная форма ветеринарного препарата - крнотои.
Биотехнологическое моделирование липидной экстракции, при проведении скрининга на клеточном уровне, дало возможность выделить две фракции, близкие по биологической активности, но резко отличиющиеся по температурному режиму экстракции и фосфолипидному составу. В результате опытов на организменном уровне (тест плавания с нагрузкой и 18-ти часовая иммобилизация), был отобран продукт ТЗ, получаемый при хладоновой экстракции в температурном режиме 30-37 С. На его основе был получен ветеринарный лекарственный препарат - липотон.
Аналогичные испытания с гидрофильной фракцией свиной плаценты в разноуровневых скрининговых опытах позволили отобрать в качестве действующего вещества для препарата аминотон фракцию Р6, которая имела наибольшее содержание свободных аминокислот и получаемую экстракцией при 35-37С с применением кавитатора.
При криофракционировании свиной плаценты могут получаться субстанции, различающиеся по составу, процентному выходу действующих веществ, агрегатному состоянию, физико-химическим свойствам.
1. Криотон - препарат из низкомолекулярной фракции. Это однородная прозрачная жидкость (разрешается незначительная опалесценция), от бесцветного до светло-желтого цвета со специфическим запахом.
Физико-химический состав криотона приведен в таблицах 8 и 9. Основные действующие вещества криотона - это короткоцепочные пептиды, свободные аминокислоты, полисахариды и другие компоненты цитоплазмы клеток и межклеточной жидкости, которые испаряются с жидкой фазой и конденсируются в сублиматоре, а затем десублимируются.
Влияние препаратов плаценты на интенсивность ПОЛ при их применении здоровым животным
Субхроническая токсичность липотона и аминотона изучена на кроликах и телятах. Схема, кратность введения и кратность превышения условно терапевтической дозы препаратов приведены в таблице 23. Препараты вводили внутримышечно.
Для оценки субхронической токсичности препаратов были взяты следующие показатели: внешнее состояние, изменение массы тела в динамике, количество дыхательных движений и температура. Были изучены интегральные биохимические и морфологические показатели периферической крови. Кровь у кроликов отбирали из краевой вены уха, у телят - из яремной вены.
За все время наблюдения (60 дней) при внутримышечном введении липотона в дозах 25,0 и 125,0 мкг/кг массы тела (по ДВ) и аминотона - в дозах 0,5 и 2,5 мл/кг, т.е. в 5 и 25 раз превышающих условно терапевтическую дозу, не выявлено каких-либо изменений внешнего состояния и поведения кроликов.
Кожный покров, шерсть, слизистые оболочки, а также потребление пищи и воды у опытных кроликов не отличались от контрольной группы, которым в течение 60 дней вводили стерильное растительное масло (липотон) или стерильный физраствор (аминотон).
Динамика массы тела кроликов при применении липотона и аминотона, представленная в таблице 24, свидетельствует о статистически достоверном приросте массы как у кроликов при многократном введении липотона в дозах 25,0 и 125,0 мкг/кг массы тела (по ДВ), так и у животных контрольной группы. Однако среднесуточный привес кроликов в опытных группах за весь период наблюдения был выше чем у животных контрольной группы соответственно на 17,2% и 7,7% (липотон) и на 18,1% и 16,3%.
Изменения частоты дыхательных движений у кроликов в процессе изучения субхронической токсичности препаратов (табл. 25) по сравнению с контрольной группой не установлено.
Установлено, что у кроликов контрольной и опытных групп не отмечено существенных различий в морфологических показателях крови (табл. 27 и 28).
Необходимо отметить тенденцию увеличения количества ретикулоци-тов при введении как липотона, так и аминотона. По-видимому, это связано с проявлением биостимулирующего действия препарата. Этими же факторами обусловлено и увеличение процентного содержания в лейкоцитарной формуле лимфоцитов. Такое действие тканевых препаратов может быть объяснено стимулирующим влиянием на кроветворную систему.
Влияние липотона при длительном применении в дозах 25,0 и 125,0 мкг/кг массы тела (по ДВ) и аминотона в дозах 0,5 и 2,5 мл/кг на биохимические показатели крови кроликов представлено в таблице 29.
Из представленных данных видно, что липотон не оказывает негативного влияния на интегральные биохимические показатели периферической крови, а также не вызывает их изменения спустя две недели после последнего внутримышечного введения липотона.
Применение аминотона также не вызывает нарушений функции почек, печени, а также углеводного, белкового и липидного обменов.
Аналогичная картина наблюдается при применении и аминотона в изученных дозах (табл. 29).
Изучение субхронической токсичности препаратов проведено на 5-6 месячных телятах в условиях комплекса по доращиванию и откорму молодняка крупного рогатого скота. Телята массой тела 120±15 кг были разделены на группы по 20 животных в каждой. Животным первой и второй группы внутримышечно вводили аминотон в дозах 0,1 и 1,0 мл/кг, животным третьей и четвертой группы внутримышечно вводили липотон в дозах 5,0 и 50,0 мкг/кг (по ДВ) массы тела. Препараты вводили семь раз с интервалом 48 часов (опытные группы). В качестве базового препарата (пятая - базовая группа) использовали ПДЭ в соответствии с наставлением по применению. Телятам шестой группы (контроль) никакие препараты не применяли. Наблюдения за животными вели еще в течение 25 дней после последней инъекции препарата.
На протяжении всего опыта, телята характеризовались как энергичные, подвижные, без проявления каких-либо клинических признаков заболевания. Они имели хорошо развитое телосложение, без признаков исхудания. Восприятие внешних раздражителей и поведенческие реакции не изменялись.
Температура тела колебалась от 38,5 до 39,5 С, частота дыхания 47 -85 движений в минуту, частота сердечных сокращений ПО - 145 ударов в минуту. Телята хорошо переносили препараты, случаев осложнений не было.
При анализе полученных результатов (табл. 30) установлено, что у животных контрольной группы, за 40 дней опыта среднесуточный прирост массы тела составил 388±41,2 г. У телят, которым применяли ПДЭ в дозе мл/гол, среднесуточный прирост массы тела составил 435±50,4 г и был выше, чем в контрольной группе на 12,1%.
Аналогичный с базовым препаратом был результат в опытных группах, получавших аминотон и липотон в десятикратной терапевтической дозе (1,0 мл/кг и 50,0 мкг/кг соответственно). При этом, наивысший среднесуточный прирост массы тела (460,0 г) зафиксирован в опытной группе телят, которым применяли аминотон и липотон в терапевтической дозе (табл. 30).
Установлено (табл. 31), что у подопытных животных содержание гемоглобина повышается при применении аминотона на 11,3 % и 10,1%, липотона-13,3% и 7,7%, а ПДЭ - на 7,7% по сравнению с контролем. Одновременно увеличивается количество эритроцитов при использовании аминотона и липотона в среднем на 14,9 %, по сравнению с контролем, и в среднем на 7%, по сравнению с ПДЭ. Как видно из данных, представленных в таблице 32, многократное применение ПДЭ, липотона и аминотона не вызвало существенных изменений в биохимических показателях крови опытных животных.
