Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Роль и значение микроэлементов в профилактике заболеваний сельскохозяйственных животных 14
1.2. Свойства и функции селена 18
1.2.1. Распространение селена в природе 18
1.2.2. Биологическая роль селена 22
1.2.3. Метаболизм селена 27
1.2.4. Токсичность селена 29
1.2.5. Химические формы селена 33
1.3. Применение препаратов селена в животноводстве и ветеринарии 36
1.3.1. Основные причины селенозов и вызываемых ими заболеваний .36
1.3.2. Применение препаратов селена в кормлении животных 38
1.3.3. Использование препаратов селена в профилактике и лечении заболеваний животных и птиц 49
1.3.4. Селенсодержащие препараты-иммуномодуляторы и антидоты .73
2. Собственные исследования 83
2.1. Материалы и методы исследований 83
2.2. Характеристика изучаемых препаратов селена 97
2.3. Токсикометрическая и фармакологическая оценка 4,4-диметил-[3(5-метилпиразолил)]селенида 101
2.3.1. Острая токсичность ДМДПС 101
2.3.2. Подострая токсичность ДМДПС 104
2.3.3. Гистологические изменения в органах экспериментальных животных после длительного введения дмдпе 111
2.3.4. Влияние ДМДПС на общекомпенсаторные реакции организма белых мышей 112
2.3.5. Влияние ДМДПС на функциональное состояние сердца 113
2.3.6. Кумулятивные свойства ДМДПС 114
2.3.7. Раздражающие свойства ДМДПС 115
2.3.10. Субхроническая токсичность ДМДПС для сельскохозяйственных животных 119
2.3.11. Канцерогенное действие ДМДПС 122
2.3.12. Влияние ДМДПС на качество мясопродуктов 122
2.3.13. Адаптогенная активность, стресс-корректорное действие и антиоксидантная активность ДИМЕТИЛдипиразолилселенида 124
2.3.13.1. Биологическая активность ДМДПС на разных фазах роста Paramecium caudatum 124
2.3.13.2. Определение стресс-корректорного действия и антиоксидантных свойств ДМДПС 125
2.4. Токсикометрическая и фармакологическая оценка селеданта 133
2.4.1. Острая токсичность селеданта 133
2.4.2. Подострая токсичность 134
2.4.3. Эмбриотоксическое и тератогенное действие селеданта 135
2.4.4. Действие селеданта на слизистые оболочки 137
2.4.5. Действие селеданта на кожные покровы 137
2.4.6. Кожно-резорбтивное действие селеданта 139
2.4.8. Субхроническая токсичность селеданта для сельскохозяйственных животных 140
2.4.8.1. Опыты на телятах 140
2.4.8.2. Опыты на поросятах 143
2.5. Токсикометрическая и фармакологическая оценка селемага 145
2.5.1. Острая токсичность 145
2.5.2. Хроническая токсичность селемага для белых крыс 146
2.5.3. Изучение субхронической токсичности селемага на поросятах.. 155
2.5.4. Раздражающие и аллергизирующие свойства селемага 161
2.5.5. Оценка антиоксидантных свойств селемага 169
2.5.6. Эмбриотоксическое и тератогенное действие селемага 171
2.6. Влияние препаратов селена на клинико-физиологические показатели и продуктивность крупного рогатого скота..." 173
2.6.1. Влияние препаратов селена на гомеостаз и систему ПОЛ-АОЗ коров, получавших однократно препараты селена в первую неделю сухостоя 173
2.6.2. Обмен веществ, репродуктивная функция и молочная продуктивность коров, биохимические показатели крови и рост телят от них при использовании препаратов селена в сухостойный период 178
2.6.2.1. Морфологические и биохимические показатели крови коров.. 178
2.6.2.2. Воспроизводительная способность, молочная продуктивность коров и качество молозива 180
2.6.2.3. Жизнеспособность телят при назначении препаратов селена сухостойным коровам 183
2.6.3. Гомеостаз, продуктивность, убойные и мясные качества телят на доращивании при использовании препаратов селена 190
2.6.3.1. Клиническое состояние и морфологический состав крови телят 191
2.6.3.3. Рост, убойные и мясные качества телят 197
2.6.3.5. Органолептическая оценка мяса 201
2.6.4. Продуктивность коров и качество молока при применении препаратов селена в период лактации 203
2.6.4.1. Влияние препаратов селена на молочную продуктивность коров 204
2.6.4.2. Качество молока при назначении препаратов селена 205
2.6.5. Сравнительная оценка эффективности селемага и селеданта для крупного рогатого скота 209
2.6.5.1. Влияние селемага и селеданта на метаболический статус и продуктивность первотелок 209
2.6.5.2. Влияние селемага и селеданта на биохимический статус, рост и развитие телят на откорме 213
2.7. Экономическая эффективность применения селеданта крупному рогатому скоту 217
2.7.1. Экономическая эффективность применения селеданта коровам в период лактации 218
2.7.2. Экономическая эффективность применения селеданта в сухостойный период 219
2.7.3. Эффективность применения препаратов селена телятам на доращивании 224
2.8. Влияние препаратов селена на клинико-физиологические показатели и продуктивность свиней 225
2.8.1. Влияние селеданта и селенита натрия на супоросных свиноматок и их потомство 225
2.8.1.1. Морфологические и биохимические показатели свиноматок... 226
2.8.1.2. Показатели ПОЛ-АОЗ свиноматок 228
2.8.1.3. Продуктивность свиноматок и влияние препаратов селена на репродуктивную функцию 230
2.8.1.4. Рост, развитие и морфо-биохимические показатели поросят от свиноматок, получавших препараты селена 233
2.8.2. Сравнительная оценка влияния селеданта и селемага на супоросных свиноматок и полученных от них поросят 236
2.8.2.1. Морфологические и биохимические показатели и продуктиивность свиноматок в связи с применением селемага и селеданта... 236
2.8.2.2. Продуктивность свиноматок при применении селеданта и селемага 240
2.8.2.3. Эффективность применения селеданта и селемага поросятам-сосунам 241
2.9. Эффективность применения препаратов селена поросятам на доращивании и откорме 247
2.9.1. Откормочные качества, рост и развитие молодняка 247
2.9.2. Мясные качества поросят на откорме 250
3. Обсуждение результатов исследований 259
4. Выводы 288
5. Практические предложения 291
6. Список использованной литературы 293
Приложение 328
- Использование препаратов селена в профилактике и лечении заболеваний животных и птиц
- Субхроническая токсичность ДМДПС для сельскохозяйственных животных
- Воспроизводительная способность, молочная продуктивность коров и качество молозива
- Продуктивность свиноматок и влияние препаратов селена на репродуктивную функцию
Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание широкой сети промышленных животноводческих комплексов поставило перед ветеринарной наукой ряд проблем, связанных с совершенствованием технологических систем сельскохозяйственных предприятий, обеспечивающих получение здорового приплода с высокой резистентностью и реактивностью, с одной стороны, разработкой более эффективных средств и способов общей неспецифической и специфической профилактики и терапии болезней животных, особенно молодняка, с другой (B.C. Шипилов с соавт., 1987; СМ. Сулейманов, 2000; А.Г. Шахов с соавт., 1997, 2000 и др.). Вместе с тем, очевидно, что применение лекарственных средств специфического этиопатогенного действия не может устранить основную причину патологического состояния, являющегося в большинстве случаев следствием нарушения метаболизма - высокоинтегри-ровашюго и целенаправленного процесса, обеспечивающего обмен веществ и энергии между клеткой и средой (Г.А. Востроилова, 2007; М.И. Рецкий с соавт., 2008).
Одной из причин замедления роста, дегенеративных изменений мышечной ткани и печени, кардиомиопатии, нарушений эмбриогенеза и репродуктивной функции может служить дефицит селена в рационе питания сельскохозяйственных животных (В.Т. Самохин, 2003).
Негативные изменения в функционировании органов, систем органов и организма как единого целого при низком содержании селена обусловлены тем, что на клеточном уровне данный микроэлемент играет ключевую роль в поддержании целостности мембран, формирует активные центры таких ферментов, как глутатионпероксидаза, глицинредуктаза, формиатдегидрогеназа препятствует накоплению внутриклеточного кальция, участвует в метаболизме аминокислот и кетокислот, а так же целого ряда энергопродуцирую-щих превращений (Тутельян В.А. с соавт., 2002; Барабой В. А. с соавт., 2004; В.В. Ермаков, 2004). Указанные свойства свидетельствуют об участии селена в первой и второй фазе биохимической адаптации: окисление чужеродных веществ с образованием органических окисей и перекисей, связывание и выведение активных метаболитов (О.Л. Обольский с соавт, 1998; В.И. Коржов с соавт., 2007).
В последние годы разработаны и предложены для практического применения комплексные препараты на основе селенита натрия (селерол, Е-селен, селевит, седимин и др.) и органические соединения селена: селенофилы, биоселен, дрожжевой селен, селенопиран, ДАФС-25. Вместе с тем, перечень селенсодержащих лекарственных средств не так велик, а некоторые из них обладают целым рядом недостатков, таких как, высокая токсичность, быстрый срок выведения из организма и некоторые др. В связи с чем, разработка новых комплексных селенсодержащих препаратов, проведение исследования по выяснению их фармакологических и токсикологических свойств, оценка эффективности органических и неорганических соединений селена является весьма перспективным для ветеринарии.
С учетом вышеизложенного, были определены общая направленность исследований, выбор методических подходов и объектов исследований, объем и разнообразие экспериментальных работ и клинической апробации • новых препаратов.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы было исследование токсических свойств и фармакологического действия новых селенсодержащих препаратов: селемаг (комплексный неорганический препарат селена), селеноорганического - селеданта и его субстанции - диметилдипиразолилсе-ленида, оценка профилактической и лечебной эффективности селеданта и се-лемага при акушерско-гинекологических болезнях коров и свиней, заболеваниях новорожденных телят и поросят, и их влияние на продуктивность и качество продукции.
Для достижения данной цели на разрешение были поставлены следующие задачи:
- изучить биологическую активность и токсикологические свойства комплексного неорганического препарата селена - селемага; - определить токсикологические параметры 4,4-ди-[3-(5-метилпиразо-лил)]селенид (ДМДПС) и препарата на его основе - селеданта;
- изучить биологическую активность ДМДПС;
- изучить фармакологическое действие селемага и селеданта на гомеостаз и репродуктивную функцию крупного рогатого скота и свиней;
- выявить влияние селеданта и селемага на рост, развитие, молочную и мясную продуктивность и качество молока и мяса крупного рогатого скота и свиней;
- изучить эффективность применения селеданта и селемага для профилактики болезней телят и поросят;
- разработать нормативную документацию и наставления по применению ДМДПС, селеданта и селемага.
Научная новизна. Впервые экспериментально разработаны и клинически оценены новые высокоэффективные препараты на основе неорганических и органических соединений селена для профилактики и лечения заболеваний продуктивных животных, улучшения роста и развития молодняка.
Изучены фармакологические свойства и определены параметры токсичности препаратов селена: селемага, селеданта и субстанции - диметилди-пиразолилселенида.
В опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных установлено, что данные препараты обладают выраженными адаптогенными и антиоксидантными свойствами; их применение нормализует гомеостаз, повышает продуктивность, качество молозива, молока и мяса, репродуктивные функции коров и свиноматок, рост и развитие телят и поросят.
Конкретизированы и систематизированы данные о механизме действия препаратов селена. Установлено, что направленность биологической активности селенсодержащих препаратов зависит от химической природы соединений, входящих в состав лекарственного средства (неорганическая и органическая формы). Показано, что применение селеданта, препарата органической природы, в большей степени способствует коррекции гомеостаза: снижению дисбаланса про- и антиоксидантных процессов, нормализации морфологических и биохимических показателей крови у крупного рогатого скота и свиней, чем использование селенита натрия и селемага. Установлено более выраженное положительное действие селеданта, чем селемага на рост и развитие телят и поросят, молочную И мясную продуктивность,, воспроизводительную способность животных, профилактику и лечение болезней коров» свиноматок, телят и поросят.
Результаты проведенных исследований? вносят определенный вклад в развитие теории рационального использованиям различных форм микроэлемента, селена для профилактики заболеваний, повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и качества получаемого молока и мяса;
Научная:: новизна1 исследований подтверждена двумя патентами РФ №2321414 и №230 535. .
Практическая; значимость. Полученные результаты послужили основанием для разработки технологии получения; контроля качества и инструкции; по применению субстанции ДМДПС для производства лекарственных средств для животных, которые вошли в разработанную и; утвержденную нормативную документацию: на 4,4-ди-[3-(5-метилпиразолил)]селенид (СТО 10590965-0008-2006) и инструкцию, утвержденную Россельхозназдо-ром РФ (ПВР-2-1.7/01907 от 03.04.2007).
Разработаны технология производства . контроль качества и инструкция по применению лекарственного средства селеданта для регуляции окислительно-восстановительных процессов, нормализации обмена веществ, регуляции-репродуктивной функции? и профилактики послеродовых патологий; повышения резистентности животных к заболеваниям,, которые- вошли- в нормативно-техническую документацию на препарат (СТО 10590965-0005-2007) и инструкцию, утвержденную Россельхозназдором РФ (ПВР-2-1.7/01895 от 03.04.2007). Разработаны технология производства, контроль качества и инструкция по применению лекарственного средства селемаг для профилактики и лечения заболеваний, развивающихся на фоне недостаточности витамина Е и селена, которые вошли в нормативную документацию на препарат селемаг (ТУ 9353-030-18009711-04 от 24.11.2005- г.) и инструкцию по применению, утвержденную Россельхознадзором РФ (ПВР -2-4.3/01388 от 06.12.2005).
Разработаны и научно обоснованы показания к применению селемага и селеданта для повышения воспроизводительных функций коров и свиноматок, профилактики послеродовых заболеваний коров, свиноматок и желудочно-кишечных болезней телят и поросят, повышения молочной и мясной продуктивности, качества молока и мяса, роста и развития телят и поросят.
Апробация результатов исследований. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчетных конференциях и заседаниях Ученого совета ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии (Воронеж, 2004-2008гг.); Российском ветеринарном конгрессе, XV Московском международном ветеринарном конгрессе (2007); Всероссийской научно-практической конференции «Молочное и мясное скотоводство: состояние и перспективы развития в южном федеральном округе» (г. Черкесск, 2007); X Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию образования кафедры крупного животноводства и переработки животноводческой продукции и кафедры свиноводства и мелкого животноводства Белорусской ГСХА «Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства» (Республика Беларусь, г.Горки, 2007); научно-практической конференции «Научное обеспечение ветеринарного обслуживания животноводства в условиях реформирования сельскохозяйственного производства» (г. Вологда, 2007); первом съезде ветеринарных фармакологов России (г. Воронеж, 2007); 16-й Всероссийской научно-методической конференции по патологической анатомии животных (г. Ставрополь, 2007); XIV Международной научно-практической конференции «Современные проблемы интенсификации производства свинины» (г. Ульяновск, 2007); Международной научно-практической конференции «Современ ные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного и продуктивного здоровья животных» (г. Воронеж, 27-29 мая 2009 г.).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликована 1 монография, 35 печатных работ, из них 12 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 352 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 217 отечественных и 117 иностранных авторов и приложения. Работа содержит 125 таблиц, иллюстрирована 13 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
- токсикометрические параметры ДМДПС, селеданта и селемага;
- фармакологические свойства ДМДПС, селеданта и селемага;
- состояние гомеостаза, продуктивность и качество продукции крупного рогатого скота и свиней при применении селеданта и неорганических препаратов селена;
- клиническая эффективность применения различных препаратов селена для профилактики послеродовых заболеваний коров, свиноматок и желудочно-кишечных болезней новорожденных телят и поросят.
Использование препаратов селена в профилактике и лечении заболеваний животных и птиц
В больших дозах селен токсичен. Селен до 60-х годов XX века считался самым опасным и токсичным препаратом для человека и животных. И хотя селеновые токсикозы наблюдались со времен Марко Поло, впервые заболевания лошадей, вызванные избыточным содержанием селена в кормах, было описано в 1856 г. под названием «щелочная болезнь» (штат Небраска, США). Заболевание сопровождалось выпадением волос со спины и хвоста и деформацией рогового башмака. Назвали его «щелочной болезнью», так как видели причину ее возникновения в щелочных водах, которыми пользовались животные. Несмотря на то, что потребление щелочной воды животными не приводит к возникновению этой болезни, название «щелочная болезнь» до сих пор сохранилось, хотя оно означает хроническое отравление животных селеном. Предположение, что токсическим началом этой «щелочной болезни» является селен, было подтверждено в 1933 г., когда было установлено, что у животных появляются признаки отравления пшеницей, в 1 кг которой содержится 5-12 мг селена. Тогда же было положено начало серии опытов и наблюдений, которые показали связь между наличием растений с высоким содержанием селена и случаями отравления ими в острой форме.
Селен, поступая в высокой концентрации в организм, вызывает в нем глубокие нарушения обменных процессов и приводит к появлению специфических реакций (острые и хронические формы отравлений, а иногда и смерть). При острой форме отравления скота на пастбище у животных нарушается координация движений, они стоят с опущенной головой и помутневшими глазами, у больных появляются понос, гематурия, слюнотечение. При вскрытии обнаруживаются геморрагические энтериты, острый токсический гепатит и нефрит. У отравившихся селеном появляются одышка, учащенный пульс, колики, цистит, цианоз. Смерть наступает из-за нарушения дыхания. «Щелочная болезнь» (хроническое отравление) поражает лошадей, крупный рогатый скот, овец. Клинические признаки - истощение, анемия, огрубение кожного покрова, потеря волос. Деформация и нарушение прочности рогового башмака -первый признак, указывающий на появление болезни. При содержании в растениях 5-10мг/кг селена у животных, содержащихся на пастбище, уже через месяц появляется хромота и выпадают волосы из гривы и хвоста.
Различают острую и хроническую формы отравления селеном, имеющие иногда общие признаки. В случае острого селенового отравления у животных чаще отмечается мышечная слабость, расстройство функций нервной системы, конвульсии. При летальном исходе наиболее характерными признаками являются геморрагии и переполнение сосудов легких кровью. При хронической форме селенового отравления у животных наблюдаются слюнотечение, функциональные нарушения центральной нервной системы, истощение с прогрессирующей анемией. Развивается хромота, связанная с поражением суставов и размягчением копыт вследствие поражения кератинового слоя. Кроме того, может наблюдаться водянка, огрубение кожи и выпадение волос, атрофия мышц, потеря зрения, нарушение функций сердца и печени (атрофический цирроз). У кур при хроническом токсикозе выпадают перья, снижается яйценоскость, цыплята из яиц таких кур вылупляются обычно слабыми, с недоразвитым клювом, часто без глаз и с ненормальной формой крыльев.
Механизм токсического действия селена на организм еще окончательно не выяснен. Известно лишь, что он значительно угнетает тканевое дыхание, понижая активность окислительно-восстановительных ферментов. Распад селенсодержащих соединений в организме человека и животных может приводить к выделению высокотоксичного диметилселена, имеющего чесночный запах.
Токсические дозы селена для молочного скота (мг/кг) - 5,0, мясного скота - 10-30, овец - 3-20, свиней - 5-10. С февраля 1974 года в США разрешено использование добавок селена в рационах свиней и кур в дозе 0,1 мг/кг, а индеек — 0,2 мг/кг. Терапевтической дозой селенита натрия для овец при подкожном введении считают 0,1 мг/кг живой массы, 0,25-0,30 мг/кг - субтоксической, а от 1,0 мг/кг и выше - токсической. Смерть животных наступает при подкожном ведении селенита натрия из расчета 3,5 мг/кг живой массы (V.C.Morris, et al., 1970). По другим данным, при введении овцам внутрь селенита натрия, лечебная доза препарата равна 150,0 мкг/кг, профилактическая - 25 мкг/кг живой массы, ЛДюо-4,32, ЛДбо- 3,20, ЛД16- 2,43, ЛД84- 4,185 мг/кг массы тела, а коэффициент кумуляции (Кк) = 5,39 (Е.Б. Прудеева, 2004).
При избыточном потреблении селена у животных, кроме указанных выше, наблюдаются следующие симптомы отравления: исхудание, анемия, нарушение сердечной деятельности и функции печени, ригидность и частичная деформация суставов, аномалии роста копыт, выпадение волос и понижение жизнеспособности. Установлено, что нижним пределом, при котором наступают явления селеноза, является 3-4 мг селена на 1 кг сухого вещества корма. Мнение о канцерогенных свойствах селена формируется с 1943 г. Однако, начиная с 1959 года канцерогенность селена подвергается сомнению и высказывается мнение о противоопухолевой активности этого микроэлемента.
Институтом физики и физиологии АН Азербайджана и институтом онкологии и рентгенологии, в течение ряда лет проводились совместные исследования по определению влияния различных соединений селена в сочетании с радиотерапией и действием других физических факторов на рост и развитие злокачественных новообразований у животных.
Установлено, что из неорганических соединений селена селенит натрия, а из органических селеноцистеин и селенсемикарбозид в значительной степени подавляют рост различных злокачественных опухолей и повышают выживаемость животных. Предполагают, что механизм противоопухолевого действия соединений селена заключается в подавлении им гликолитического процесса - основного источника энергии в раковых клетках с одновременным снижением концентрации свободных радикалов в опухолевой ткани как за счет подавления селеном активности гликолитических ферментов, так и проявления им антиокислительных функций.
Неоднократные исследования показали, что селенит натрия и витамин Е, вводимые подкожно, тормозят канцерогенное действие кротонового масла на мышей.
Селеновый токсикоз крайне редко развивается при коррекции дефицита селенсодержащими препаратами в превышающих необходимые дозировки. Однако, он повышается в ряду Se2+ Se4+»Se6+. Наиболее токсичны шестивалентные соединения селена, например натрия селенит, входящий в препараты первого поколения для коррекции дефицита селена и во многие вита-минно-минеральные комплексы и БАД.
Субхроническая токсичность ДМДПС для сельскохозяйственных животных
Для оценки антиоксидантиых свойств использовали модель интоксикации 5,6-диоксиурацилмоногидратом (ДОУМГ). Механизм.общетоксического воздействия ДОУМГ реализуется посредством образования перекиси водорода, активных форм кислорода, и запуском в клетке цепи свободноради-кальных реакций (Соколоверова И.М., 1948). Интоксикацию проводили с использованием ДОУМГ компании «Sigma» (коммерческое название вещества — аллоксан) в дозе 140,0 мг/кг однократно подкожно. Длительность эксперимента составляла 14 дней. Массу тела животных измеряли до введения ДОУМГ и на 14 сутки эксперимента. Оценку эффективности защитного действия ДМДПС проводили на основании сравнения выживаемости (в процентах) и динамики изменения массы тела животных опытных групп по отношению к контрольной-группе.
При проведении всех исследований животные в группах были подобраны по принципу парных аналогов по полу, возрасту и массе тела.
Токсические свойства препарата оценивали методом определения острой и хронической токсичности, а отдаленных последствий - изучением аллергенной, эмбриотоксической, тератогенной-и мутагенной активности в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», утвержденными ГУВ СССР (1991) и руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2000 г.). Исследование . острой токсичности препаратов проводили на белых мышах, белых крысах, морских свинках, кроликах, поросятах и телятах. Токсическое действие оценивали по общему состоянию животных, периферической крови, функции ЦНС, ССС, функции печени и почек, результатам патоморфологических исследований.
Для изучения влияния на функцию печени и почек проводили биохимическое исследование сывороток крови крыс на биохимическом анализаторе ФП-901, а также с помощью диагностических наборов Биолатест.
Исследование аллергизирующего действия препаратов проводили на белых крысах методом эпикутанных аппликаций. Перед опытом первично оценивали раздражающее действие при однократном нанесении (аппликации) на кожу препарата. Затем животных сенсибилизировали многократным нанесением препарата (10 раз) на один и тот же участок кожи. Дляотого у крыс выстригали волосы на спине, на поверхность наносили препарат в объеме 0,1 мл, выдерживали 4 ч и удаляли. Через 14-21 день на кожу спины наносили разрешающую дозу препарата в той же концентрации.
Изучение эмбриотоксической и тератогенной активности селеданта проведены на нелинейных белых крысах. Препарат вводили на 5-й и 10-й дни беременности, однократно, внутримышечно в дозе 100мкг/кг, что в 10 раз превышает установленную эффективную терапевтическую дозу. Самок массой 170-200 г в стадии проэструса и эструса подсаживали к самцам вечером. Утром следующего дня исследовали влагалищный мазок. День обнаружения спермиев.в мазке учитывали как 1 день, беременности. На 19-20 день беременности крыс декапетировали и обследовали. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, а в матке - мест имплантации, резорбций, количество живых и мертвых плодов. Все плоды были изучены макроскопически, определены их масса и краниокаудальный размер. После осмотра матки, плодных вод и плаценты и регистрации всех обнаруженных аномалий в помете от каждой самки половину плодов фиксировали жидкостью Буэна и использовали для изучения состояния внутренних органов, а другую половину плодов — в 96% спирте — для оценки развития скелета.
Для определения влияния препаратов на животных в зависимости от сроков беременности учитывали пред- и постимплантационную гибель плодов, а действие на постнатальное развитие изучали на рождавшихся белых крысятах.
Степень мутагенной активности препаратов исследовали в соответствии с «Методическими указаниями по оценке мутагенной активности препаратов, применяемых в животноводстве», утвержденными ГУВ РФ (1993).
Для решения вопроса о степени мутагенной активности препарата использовали метод цитогенетического анализа клеток костного мозга. При этом учитывали хромосомные аберрации клеток костного мозга мышей. Для цитогенетического анализа готовили препараты костного мозга животных по методу Форда и Хамертона (1956), позволяющему учитывать повреждения хромосом на стадии метафазы. Приготовление хромосомных препаратов производили по методике A.M. Малашенко (1977).
При приготовлении цитогенетического анализа отбора и регистрации аберраций хромосом руководствовались рекомендациями Проблемной комиссии АМН СССР по цитогенетике. Согласно этим рекомендациям для анализа отбирали не разрушенные клетки округлой формы с хорошим разбросом хромосом без наложений. В каждой метафазной пластинке регистрировали нарушение числа и структуры хромосом. Для этого подсчитывали число хромосом и систематизировали видимые нарушения непрерывности (пробелы и фрагменты) или перекомбинации участков (обмены). Для выявления мутагенного эффекта учитывали ахроматические повреждения хромосом - пробелы (гепы), нарушения целостности одной или обеих хроматид, не сопровождающиеся смещением фрагментов и структурные аберрации - фрагменты и обмены. Отдельно регистрировали гепы - пробелы. Статистическую значимость различий в опыте и контроле, по показателям процента клеток со структурными аберрациями хромосом, определяли с помощью критерия Стыодента.
Оценку мутагенного действия препаратов также проводили при помощи учета доминантных летальных мутаций (ДЛМ) в зародышевых клетках. Метод предусматривает выявление наследственных изменений в половых клетках родительских особей, приводящих к гибели потомков первого поколения во время эмбрионального развития. Большая часть ДЛМ представляет собой количественные и структурные аберрации хромосом, приводящие к утрате генетического материала. Мутагенный эффект проявляется в виде повышенной эмбриональной смертности до и после имплантации.
Для оценки общего действия на живой организм селеданта в крови определяли: количество эритроцитов и лейкоцитов на счетчике частиц Культер Каунтер, гемоглобина - гемоглобинцианидным методом и с помощью гемометра Сали, глюкозу ортотолуидиновым методом Гультмана в модификации Хиваринена-Никкила (О.Д. Кушманова, 1983); в сыворотке крови: общий белок - рефрактометрически, белковые фракции электрофорезом в агаровом геле (И.ІТ. Кондрахин,1985), содержание мочевины по цветной реакции Фирона в модификации В.Г. Колб (1976), общий кальций комплексометрическим способом по Уилкинсону (И.П. Кондрахин, 1985), неорганический фосфор; активность щелочной фосфотазы, активность АЛАТ и АСАТ - колориметрическим методом с использованием спектрометра Specol 211, содержание общих липидов по цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом (Кнайт с соавт., 1972), содержание холестерина с помощью наборов фирмы Лахема на спектрометре СФ-46, содержание меди, цинка, марганца, железа, магния, натрия на атомно-абсорбционном спектрофотометре -РЕ-703.
Воспроизводительная способность, молочная продуктивность коров и качество молозива
Однако интенсивность роста и развития белых крыс продолжалось незначительное время и к началу 6 периода (0,75 ЛД5о) отмечено снижение интенсивности роста подопытных животных, которое продолжалось до конца опыта. К исходу последнего периода отмечалось значительное уменьшение прироста массы тела белых крыс по сравнению с контролем. Суммарная доза, при которой было отмечено начало падежа животных, составила 26244 мг/кг массы тела. При дальнейшем введении препарата гибель белых крыс продолжалась до 23 дня от начала опыта. На 23 день погибли все подопытные животные, получавшие ДМДПС.
На основании результатов опыта по определению коэффициента кумуляции ДМДПС при внутрижелудочном введении белым крысам (Приложение, табл. 3) установлено, что по величине коэффициента кумуляции, рассчитанного методом пробит-анализа (Ккум = 5,42), ДМДПС может быть отнесен к слабо кумулирующим веществам (классификация Ю.С. Кагана). Об этом также свидетельствует и относительно большая продолжительность жизни животных при повторном введении препарата. Для оценки раздражающего действия ДМПСД проведено два опыта на кроликах.
В первом опыте использовали 4-х кроликов породы шиншилла с массой тела 2,0±0,2 кг. Первому кролику (контроль) под конъюнктиву правого глаза вводили 3 капли стерильного физиологического раствора. Опытным кроликам закапывали соответствующий раствор ДМДПС в концентрациях: 0,01 %; 0,1 %; 1,0 %. Введения проводили по 1 разу в день в течение 5 дней. При изучении раздражающего действия ДМДПС на конъюнктиву глаз кроликов визуальную оценку проводили в баллах согласно таблице 4 приложения.
Клиническое состояние организма кроликов, как в контроле, так и в опыте оставалось в пределах нормы, т.е. не выявлялись изменения в температуре тела, частоте пульса и количестве дыхательных движений (Приложение, таблица 5).
Закапывание в глаз контрольного кролика стерильного физиологического раствора вызывало незначительное беспокойство животного в первые минуты. Как острого, так и хронического раздражения слизистой физиологический раствор не вызывал (Приложение, таблица 6).
Раствор ДМДПС в концентрациях 0,01 % и 0,1 % не вызывал изменениє общего состояния животных и со стороны глаз по сравнению с контрольным кроликом. В концентрации 1,0 % закапывание раствора препарата в глаз кролика сопровождалось более выраженным, чем в контроле беспокойством, кратковременным (до 30 минут) слезотечением и слабым покраснением слизистой оболочки. Эти признаки наблюдаются только в течение первого получаса.
Во втором опыте изучено раздражающее действие ДМДПС на кожу. Опыты проведены на кроликах с массой тела 2,0-2,2 кг. По 6 особей разного пола в опытной и контрольной группах. За два дня до эксперимента тщательно выстригали шерсть на спине, избегая механических повреждений кожных покровов. Исследуемый препарат наносили в виде 0,1 и 1,0% водного рас-твора на площадь 80-82 см" (5% от общей поверхности тела животных), распределяя по поверхности участка в дозах от 0,02-0,12 мл/см". Экспозиция препарата составляла 4 часа, после чего кожу аккуратно протирали ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой. Реакцию кожи на воздействие препарата оценивали через 1 и 16 часов после однократного нанесения.
Учитывая, что функциональные нарушения кожи характеризуются появлением различной степени выраженности эритемы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры, оценку раздражающего действия препарата проводили по классификации, приведенной в таблице 7 приложения, степень эритемы визуально в баллах (Приложение, таблица 8), величину отека путем измерения толщины складки (в баллах, Приложение, таблица 9).
Результаты опыта по изучению раздражающего действия препарата на кожные покровы приведены в таблице 16, которые указывают, что при однократной аппликации на кожные покровы кроликам 0,1 и 1,0%-ного водного раствора ДМДПС при плотности нанесения от 0,020 до 0,12 мл/см ", препарат не вызывает повреждение кожи в виде эритемы или ее отеков. Опыты по изучению аллергенных свойств ДМДПС проведены на белых беспородных крысах массой 200-220 г. по 8 в опытной и контрольной группах. Животным опытных групп на выстриженные участки кожи боковой поверхности, ближе к середине туловища, наносили по 0,5 мл 5%-ного водного раствора ДМДПС на площадь 5 см", то есть плотность нанесения препа-рата составляла 0,1 мл/см".
Вещество наносили на протяжении трех недель по 6 раз в неделю. Пер вое тестирование путем нанесения раствора ДМДПС в дозе в 5- раз превышающую сенсибилизирующую проводили после 10 аппликаций, затем - через 14 и 20 суток от начала аппликации реакцию кожи учитывали по шкале оценки проб. Животным контрольной группы применяли только разрешающие дозы. В эксперименте установлено (табл. 17), что 20-кратная аппликация препарата не вызывает явлений сенсибилизации.
Выявление и количественная оценка потенциальной цитогенетической активности ДМДПС, его способности к индукции хромосомных аберраций, изучена на клетках костного мозга млекопитающих. В опытах использовали белых беспородных крыс массой 180-200 г. по 6 особей в контрольной и экспериментальной группах.
Продуктивность свиноматок и влияние препаратов селена на репродуктивную функцию
Определение параметров токсичности селеданта в остром опыте при однократном пероральном и внутрибрюшинном введении проведены на белых крысах и белых мышах. Одновременно же на этих животных изучили симптомы острого экспериментального отравления селедантом. Павших животных, перенесших отравление препаратом, подвергали патологоанатомиче-скому вскрытию.
Опыты выполняли в двух повторпостях. Группы животных формировали по принципу парных аналогов, учитывая массу тела, развитие и клиническое состояние. Для проведения экспериментов использовались белые мыши и белые крысы обоего пола с массой тела у мышей - 18-20 г., у крыс — 180-210 г. Перед началом опытов животных выдерживали на карантине в течение 12 дней, а перед введением препарата не кормили в течение 12 часов.
В первой серии опытов препарат вводили однократно внутрь в дозах от 5,0 до 30,0 мл/кг массы тела, в объеме 0,6 мл на мышь и 6,0 мл на крысу (дозы являются предельно допустимыми по объему для перорального введения). Объем вводимого животным селеданта доводили добавлением к препарату стерильной воды. Гибели животных при всех дозах за весь период опыта на протяжении 14 дней не было. (Приложение, таблица 10.) Патоморфологическое изучение по окончании эксперимента не выявило нарушений в структурной организации внутренних органов. Среднеле-тальную дозу - LD5o определить не удалось, так как при введении внутрь селеданта в максимально возможных объемах (0,6 мл - белым мышам и 6,0 мл - белым крысам) в дозе 30,0 г/кг массы тела не отмечалось гибели животных. Следовательно, препарат по степени токсичности относится к IV классу опасности — малоопасные вещества (ГОСТ 12.1.007-76). Во второй серии опытов острая токсичность селеданта испытана при внутрибрюшинном способе введения. Препарат вводили однократно внутри-брюшинно в дозах от 10,0 до 60,0 г/кг массы тела, объеме 1,0 мл на мышь и 6,0 мл на крысу (дозы являются предельно допустимыми по объему для внутрибрюшинного введения). Гибели животных при всех дозах за период опыта (14 дней) не было. Патоморфологическое изучение по окончании эксперимента не выявило нарушений в структурной организации внутренних органов. Среднелетальную дозу - LD50 определить не удалось, так как при внутрибрюшинном введении селеданта в дозе 50 и 30 мл/кг массы тела гибели животных не отмечалось. Изучение подострой токсичности селеданта проводили на 60 белых крысах-самцах с массой тела 180-200 г при внутримышечном введении препарата ежедневно в течение 7 дней. Установлено, что многократное введение селеданта в дозах 10 и 100 мкг/кг массы тела (терапевтическая и в 10 раз превышающая терапевтическую дозу) не вызывает существенных изменений в клиническом состоянии животных: поведение, груминг, аппетит, частота дыхания у всех животных опытных групп, как в период применения селеданта, так и в течение одного месяца после окончания применения препарата оставались в пределах нормы. У животных опытных групп, как и у контрольных, не было отмечено нарушений функций пищеварения и мочеотделения, они подвижными, не отмечалось нарушение аппетита, были сохранены рефлексы. Однако подопытные крысы в зависимости от дозы препарата отличались по интенсивности роста от контрольных (рис. 2). Динамика роста крыс под влиянием селеданта в дозе 10 мкг/кг на протяжении всего периода наблюдений существенно не отличалась от животных контрольной группы, а интенсивность была устойчиво, на 3,7-9,1% более высокой. Такое действие было еженедельным, равномерным и стабильным. Оно наблюдалось еще 30 дней после окончания введения селеданта. Применение селеданта в дозе 100 мкг/кг проявило такое же, но менее выраженное влияние на рост белых крыс. Коэффициенты массы внутренних органов крыс (морга„а/ мкрьісь, х 1000), которым применяли препарат, существенно не отличались от контроля. (Приложение, таблица 11) При исследовании крови животных, получавших селедант в дозе 10-и 100 мкг/кг массы тела, не отмечено достоверных изменений в морфологическом составе крови и биохимических показателях по сравнению с показателями в крови животных контрольной группы (Приложение, таблицы 12-13). 2.4.3. Эмбриотоксическое и тератогенное действие селеданта
Оценку эмбриотоксического и тератогенного действия препарата проводили по методике А.Г1. Шицковой с соавт. (1977) на самках белых крыс массой 220,0±20,0 г. Фазу полового цикла устанавливали путем исследования вагинального содержимого. Первым днем беременности считали день обнаружения спермиев после подсадки самцов к самкам. Животные были разделены на три группы: контрольную и две опытные. Крысам первой опытной группы на пятый день беременности (период имплантации) и второй опытной группы на 10 день беременности (период органогенеза) вводили селедант в дозе 100 мкг/кг массы тела внутримышечно. Для выявления повреждающего действия препарата на плод половину самок убивали на 19-20 день беременности. Проводили осмотр матки, плацент и плодов, подсчитывали количество желтых тел беременности, оценивали равномерность расположения плодов в рогах матки. Раннюю и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность, выживаемость подсчитывали по формулам, предложенным A.M. Малашенко и И.К. Егоровым (1977). В целях выявления патологии внутренних органов эмбрионов материал фиксировали в жидкости Боуэна и 70 спирте. Аномалии скелета выявляли по методу Даусона (1984). Критериями оценки эмбриотоксического и тератогенного действия препарата служили показатели гибели зародышей на пред- и постимплантационных стадиях развития (эмбриональный эффект), наличие аномалий развития внутренних органов и скелета (тератогенный эффект), уровень плодовитости, масса зародышей. Результаты изучения эмбриотоксического действия селеданта в дозе 100 мкг/кг массы тела представлены в таблице 33.
