Введение к работе
Постановка проблемы, ее актуальность. Большой интерес, проявляемый к биопрепаратам, обладающим антипаразитарным действием, связан с возможностью замены ими химических пестицидов, загрязняющих окружающую среду и к которым наблюдается выработка резистентности паразитов.
Среди продуктов микробиологического синтеза, открытых в последнее время, особое место занимают макроцикличе-ские соединения-авермектины. Эти соединения синтезируются микроорганизмом Streptomyces avermitilis, отличаются широким спектром паразитоциднои активности и исследуются в качестве основы соответствующих препаратов для растениеводства и ветеринарии.
Однако, несмотря на очевидную перспективность и огромные потребности в экологически чистых антипаразитарных биопрепаратах, в нашей стране до настоящего времени не налажено крупномасштабное производство их. В этой связи актуальной задачей биотехнологии является поиск высокопродуктивных продуцентов авермектинов и создание управляемого биосинтеза целевых продуктов-
Традиционно используемые в биотехнологии приемы управления метаболизмом продуцентов на основе контроля рН, Eli, газообмена, концентрации компонентов среды и биомассы и т.д., в последнее время дополнены рядом новых оригинальных подходов. Разработаны аппаратура и методы регистрации подвижности, электрооптических и электрофоретических свойств клеток, позволяющие контролировать не только популяцию, но и влияние на нее факторов среды. При этом, несмотря на значительные успехи в изучении отдельных вопросов управляемого культивирования микроорганизмов, конкретные промышленные процессы до сих пор оптимизируются эмпирическим путем проб и ошибок (Работнова, 1986). Сложившаяся ситуация в определенной мере связана со слабой разработанностью теории адаптации микроорганизмов (Печуркин, Брильков, 1986) и недостатком
знаний в области физиологии биосинтеза вторичных метаболитов.
Как известно, периодическая культура является основой подавляющего большинства биотехнологических процессов, а биосинтез целевых продуктов начинается во второй фазе роста в связи с изменением условий среды и имеет приспособительное значение для популяции (Егоров, 1965; Работнова, 1986; Нава-шин, Сазыкин, 1984). Поэтому для направленного действия на биосинтез вторичных метаболитов необходимо иметь информацию о динамике развития продуцентов, начиная от лаг-фазы и до завершения ферментации. Но исследования поведенческих реакций микроорганизмов-продуцентов на популяционном уровне не нашли широкого развития в связи с тем, что в периодической культуре одновременно изменяется большое количество параметров, а соответствующие методы интегрального контроля до сих пор не разработаны.
Из анализа литературной информации следует, что наиболее перспективной для разработки методов контроля культивируемых популяций микроорганизмов, не нарушая их целостность, представляется электрометрия, которая позволяет получать информацию как о культуральной жидкости в целом, так и ее компонентах. Теоретической базой при этом служат данные, свидетельствующие о наличии связей между такими показателями растворов и суспензий, как тангенс угла диэлектрических потерь tgfc,, удельная электропроводность g, импеданс Z и природой компонентов, содержащихся в жидкой фазе (Брезгунов, Жуков, Зудин, 1979; Мирошников, Фомченков, Иванов, 1986; Седых, 1986 и др.)
В связи с изложенным, большое значение и актуальность приобретает установление корреляции между физиолого-биохимическими и биофизическими показателями культивируемых популяций, разработка на этой основе соответствующих инструментальных методов контроля биотехнологических про-
цессов и создание на этой основе управляемого биосинтеза антипаразитарных препаратов широкого спектра действия
Для решения указанных задач могут быть использованы следующие принципы: 1) рассмотрение микробной популяции микроорганизма-продуцента как целостной системы типа организм-среда; 2) интегральный биофизический контроль систем, не нарушая их целостности
Такой подход, хотя и является достаточно общим, имеет определенные преимущества перед традиционными аналитическими методами-теряя в точности и специфичности, удаляется получить выигрыш в целостности, выявить поведенческие адаптивные реакции популяции, что особенно важно при разработке новых технологий микробиологического синтеза.
Цель работы - создание промышленной технологии получения противопаразитарного препарата НИАЦИД на основе обобщения теоретических и практических исследований по особенностям приспособительного развития микроорганизмов-продуцентов в изменяющихся условиях среды и разработке соответствующих методов интегрального биофизического контроля процессов биосинтеза, а также получение исходных данных для внедрения препарата в ветеринарную практику.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
экспериментальное обоснование характера развития микроорганизмов в изменяющихся условиях периодической культуры как целостных адаптивных систем типа организм-среда;
установление возможной корреляции физиологического состояния клеток популяции с интегральными электрофизическими показателями культуральной жидкости в целом и на основе этого разработка экспресс-метода интегрального контроля процессов микробиосинтеза;
испытание метода контроля при культивировании промышленных микроорганизмов-продуцентов (тилозина, хлортетрацик-лина, лизина, энтомофторина, авермектинов и др.);
получение высокопродуктивного продуцента авермектинов и разработка технологии культивирования его с применением интегрального электрофизического метода контроля динамики развития;
изучение процесса выделения авермектинового комплекса из биомассы продуцента и определение антипаразитарной активности его на биотестах;
разработка оптимальной композиции лекарственной формы препарата, изучение безвредности препарата для теплокровных, проведение лабораторных и производственных испытаний препарата против эндо- и экзопаразитов животных;
разработка и утверждение НТД для внедрения препарата НИАЦИД в производство.
Научная новизна. Экспериментально подтверждена концепция непрерывности физиологической адаптации микроорганизмов в периодической культуре - показано, что на каждой фазе развития имеются свои характерные субпопуляции, обладающие соответствующими физиолого-биохимическими показателями (термоустойчивость, содержание липидов и свободных аминокислот, антиокислительная активность липидов клеток) и приспособление к конкретным условиям среды.
Разработан и теоретически обоснован новый методический подход управляемого биосинтеза на основе регистрации интегральных электрофизических (ЭФ) показателей культураль-ной жидкости (КЖ) продуцентов, впервые установлено, что в определенных областях электромагнитного поля (ЭПМ) кинетика ЭФ показателей коррелирует с сигмоидной кривой роста микро-организмові
Выделены и изучены новые штаммы микроорганизмов-продуцентов: Str.avermitilis 198; 56 - продуценты авермектинов; B.bassiana 476-4С - продуценты боверина.
Разработаны новые методы экспресс-оценки биологической ценности микробиологического сырья (мелассы, кукурузного экстракта, кормовых дрожжей), определения биосинтетиче-
ской активности продуцентов авермектинов, тилозина, гидролитических ферментов
На основе комплексных исследований разработаны условия регулируемого культивирования продуцентов авермектинов с целью получения целевого продукта, выделения и очистки авер-мектинового комплекса, создана композиция антипаразитарного препарата, обладающая высокой антгельминтной и акарицидной активностью.
Практическая ценность работы. Разработанный метод электрометрического контроля динамики развития микроорганизмов-продуцентов по интегральным ЭФ показателям КЖ в целом позволяет своевременно вмешиваться в ход биосинтеза (вносить дробные добавки, регулировать аэрацию, определять время завершения технологического цикла и др.), что способствует улучшению экономических показателей процесса, а также ускорению отработки новых технологий микробиосинтеза.
Выявлено, что направленное регулирование физиологической адаптации микроорганизмов путем изменения условий культивирования может быть использовано для интенсификации биосинтеза. Например, фотостимуляция метаболизма некоторых промышленных микроорганизмов в установленных режимах облучения (а.с. 1124472) повышает выход энтомопатогенных препаратов в несколько раз, по сравнению с аналогами.
Экспресс-методы контроля биосинтеза тилозина (а.с. 1592771), авермектинов (патент 1806351), качества микробиологического сырья (а.с. 1459245) и физиологического состояния популяции по электрофизическим показателям дают многократный выигрыш во времени и средствах при отработке технологических регламентов и проведении процесса микробиосинтеза. Это было продемонстрировано в промышленных условиях при производстве лизина, тилозина, биовита (хлоргетрациклина).
Разработана и запатентована технология получения нового антипаразитарного ветеринарного препарата НИАЦИД. Препарат прошел широкие производственные испытания в различ-
ных регионах страны и показал высокую лечебно-профилактическую активность. Фармкомитетом МСХиП РФ утверждены ТУ на препарат, проводятся работы по организации промышленного выпуска его.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на IV Всесоюзном симпозиуме "Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве" (Москва, 1971), на Конференции "Московский университет сельскому хозяйству" (Москва, 1971), Конференции молодых ученых МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 1971), Всесоюзной конференции "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности" (Львов, 1984), Всесоюзной конференции "Контроль и управление биотехнологическими процессами" (Горький, 1985), Всесоюзной конференции "Автоматизация микробиологических производств" (Иваново, 1986), Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов (Пущино, 1986), Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск, 1987), Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино, 1989), Всесоюзной конференции "Микроорганизмы стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных" (Ташкент, 1989), Конференции "100 лет Курской биофабрике" (Курск, 1996), Всероссийской конференции "Инфекционные болезни молодняка с/х животных" (Москва, 1996).
По материалам диссертации опубликовано 44 работы, получено 12 авторских свидетельств и патентов.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Объем диссертации - 312 страниц. Из них 234 страницы текста, 32 рисунка и 46 таблиц. Приложения даны на 11 страницах отдельно. Список литературы включает 555 ссылок, в том числе 171 иностранных.
