Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 11
2.1.Использование природного сырья из каменноугольных смол для отечественных инсекто-акарицидов 11
2.2. Креолин как компонент отечественных инсекто-акарицидов 26
2.3. Динамика остатков пестицидов в рабочих эмульсиях, на шерсти, в тканях и органах животных 34
III. Собственные исследования 42
3.1. Материал и методы исследований 42
3.2. Физико-химические свойства креолина 65
3.3. Острая токсичность креолина 67
3.4. Аллергизирующие свойства креолина 69
3.5. Влияние креолина на слизистые оболочки глаз кроликов 71
3.6. Влияние креолина на антитоксическую функцию печени 71
3.7. Влияние креолина на гематологические показатели овец 72
3.8. Влияние креолина на некоторые биохимические показатели крови овец 73
3.9. Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса и других продуктов убоя овец, обработанных водными эмульсиями креолина 75
3.10.. Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств креолина 78
3.11. Изучение мутагенных свойств креолина 80
3.12. Разработка методики определения нафталина в бесфенольном креолине 85
3.13. Разработка методики определения остаточных количеств креолина (по нафталину) в биологических объектах 92
3.14. Определение остаточных количество креолина (по нафталину) в органах и тканях сельскохозяйственных животных.. 101
3.15. Опыты по сравнительному изучению инсекто-акарицидных свойств креолина -X (креохина), хинмикса и одного креолина 108
Обсуждение 112
Выводы 118
Литература 121
- Креолин как компонент отечественных инсекто-акарицидов
- Динамика остатков пестицидов в рабочих эмульсиях, на шерсти, в тканях и органах животных
- Влияние креолина на слизистые оболочки глаз кроликов
- Разработка методики определения остаточных количеств креолина (по нафталину) в биологических объектах
Введение к работе
Мир паразитических насекомых и клещей очень разнообразен. Ныне известно почти 900 тыс. видов. Истинное же их число на планете около 1,5 млн. Однако, из них паразитических членистоногих всего лишь 1%. Все они отличаются между собой образом жизни, развитием, вредоносностью и т.д. Это вызывает необходимость проведения практических мероприятий по борьбе с ними, которые строятся дифференцированно, с учётом своеобразия биоэкологии паразитов в условиях внешней среды (Т.Г. Аббасов и др. 1999).
Наиболее широко распространенными паразитическими членистоногими, нападающими на животных на пастбище, являются подкожные оводы крупного рогатого скота, полостные оводы лошадей и овец, подкожные и ноглоточные оводы северных оленей, кровососущие двукрылые насекомые: слепни, комары, мошки, мокрецы, мухи-жигалки, иксодовые клещи, овечьи кровососки и мухи-возбудители миазов. Со всеми этими паразитами необходимо вести решительную борьбу с тем, чтобы полностью освободить от них животных. Необходимо также учитывать и то, что эктопаразиты, нападая на животных, являются возможными переносчиками возбудителей различных инфекционных и паразитарных болезней.
Как известно, паразитические членистоногие наносят большой экономический ущерб народному хозяйству. В частности, кровососущие двукрылые насекомые, паразитируя на животных, снижают удои на 30-50%, прирост массы - на 15-20%», привесы молодняка снижаются на 25-40%. Для борьбы с вредоносными членистоногими используются пестициды. В их использовании, как сообщает К.В. Новожилов (1991), наблюдались следующие периоды: первый (до 1940 г.) характеризовался применением мышьякосодержащих инсектицидов, препаратов серы, никотина, каменноугольных масел, креолина (комплексного препарата на основе каменноугольных масел и эмульгаторов).
Второй период (1945-1959 гг.) характеризовался введением в практику хлор- и фосфорорганических соединений. Их высокая инсектицидная и акарицидная активность, способность проникать в ткани эктопаразитов в количестве, токсичных для них, быстрое проявление защитного эффекта, послужили основанием для их широкого применения в ветеринарной практике.
С 1960 г., по мнению Б.А. Тимофеева и др. (2003 г.), настал третий период, который характеризовался широким использованием в животноводстве и ветеринарии пиретроидов.
Предлагаемый зарубежными производителями широкий ассортимент пестицидов и созданных на их основе разнообразных форм инсекто-акарицидных препаратов обусловил возникновение существенных затруднений в реализации на российском рынке отечественной конкурентно-способной продукции, уступающей зарубежным аналогам, прежде всего, по качеству дизайна и упаковке.
В условиях постоянно нарастающей конкуренции на фоне переживаемых отечественной промышленностью известных трудностей периода реформирования организационно - правовых форм собственности, инфляции, неплатежей, острой недостаточности оборотных средств произошёл спад объёмов производства отечественной продукции, а в ряде случаев и фактическое прекращение производства инсекто-акарицидных средств. Установленные импортерами высокие цены на продукцию повлекло существенное снижение объёмов их закупки, необходимых для удовлетворения потребностей практической ветеринарии, сделали такие препараты малодоступными россиянам, вынуждая отказываться от их приобретения для использования не только на фермерском или подсобном хозяйстве, но даже в быту при уходе за мелкими домашними животными — собаками, кошками и др.
Вместе с тем, необходимо отметить, что в последние годы наука и практика широко стала использовать в комплексных инсекто-акарицидных препаратах креолин (гексалин, креопир, креолин-Х - Б.А. Тимофеев и др., 1992, 1994). Необходимым сырьём для получения креолина служит каменноугольная смола, из которой помимо вышеназванного креолина, получают лизол, поверхностно-активные вещества, фенол и т.д. (С.Н. Лазорин, Б.М. Пац, 1966).
Однако до последнего времени токсические свойства креолина (в полном объёме) его остаточные количества в органах и тканях животных были изучены явно недостаточно.
Цель и задачи исследований. В связи с вышеизложенным перед нами были поставлены следующие задачи:
1. Изучить токсические свойства креолина (острую, хроническую токсичность, влияние на функцию печени и т.д.).
2. Изучить мутагенные, эмбриотоксические и тератогенные свойства креолина.
3. Провести ветеринарно-санитарную экспертизу мяса овец, обработанных креолином. 4. Разработать методику определения остаточных количеств креолина в органах и тканях животных после их обработки указанным препаратом.
5. Изучить его остаточные количества в органах и тканях крупного рогатого скота и овец.
6. Провести сравнительное изучение инсекто-акарицидной активности композиции креолина и циперметрина (креолин -X), циперметрина (хинмикса) и одного креолина.
Креолин как компонент отечественных инсекто-акарицидов
В руководстве "О мероприятиях по борьбе с саркоптоидозами (чесоткой) сельскохозяйственных животных" приведены соотношения гамма - изомера гексахл орицикл огексана в зависимости от его процентного содержания с креолином.
Все гексахлоран — креолиновые препараты использовали в виде водных эмульсий с содержанием 0,025-0,03% гамма - изомера гексахлорана против эктопаразитов овец путём купания в ваннах. Для приготовления водных эмульсий из гексахлорана - креолиновых препаратов использовали воду с небольшим содержанием солей (мягкая вода). (С.Н. Никольский, 1953, 1971; С.Н. Никольский, А.А. Водянов, 1971, 1979.).
Большие исследования по изучению гексахлорана -креолиновых эмульсий были проведены В.М. Белоносовым (1970). Им, в частности, изучено содержание гамма — изомера на шерсти у овец после купки в указанной эмульсии; снижение концентрации гамма - изомера в ней; фармакокинетика ДВ в органах и тканях искупанных овец и т.д. Н.В. Цицин, Е.С. Черкасский (1957) предложили активированный креолин, содержащий гексахлор циклогексан или дихлордифенилтрихлорэтан (или оба соединения вместе), которые обладают универсальным действием: истребительным и профилактическим, контактным и фумигантным, инсектоакарицидным и бактерицидным. Высокая эффективность активированного креолина носит не только аддитивный характер. Напротив, препарат не только аккумулирует действие всех входящих в его состав компонентов, но и создаёт, вследствие их совокупности и образования новых химических соединений, новые качества, которыми не обладает ни один из его компонентов, взятый порознь.
Активированный креолин готовился непосредственно перед употреблением в виде смеси креолина с гексахлорциклогексаном (или ДДТ). Кроме того, этот препарат изготовляли промышленным путём по разработанной авторами технологической схеме получения активированного креолина на базе креолиновых масел, эмульгатора, «обогащенного» технического гексахлорциклогексана.
В 1955-1956 гг. Гусевским креолиновым заводом было изготовлено свыше 635 т стандартного активированного креолина, содержащего строго определенное количество действующего начала гамма - изомера гексахлорциклогексана, свободного от выпадающих в осадок и расслаивающих препарат альфа- и бета - изомеров гексахлорциклогексана, являющихся вредным балластом .
Креопир - это композиция из перметрина (20%-ного) и креолина в соотношении 1:9. В качестве перметрина используется сто мазан или чистый перметрин отечественного производства или зарубежных фирм. Содержание перметрина в креопире составляет 2% (Н.П. Кекух, 1992).
По внешнему виду креопир - однородная маслообразная жидкость с запахом каменноугольного масла от темно-коричневого до черно-бурого цвета. СК-50 креопира по креолину 0,02%, а по стомазану (перметрину) - 0,005%. ЛД-50 препарата для мышей 2700 мг/кг, что позволяет отнести его к IV классу опасности. Препарат в лечебной концентрации удовлетворительно переносится овцами. Не обладает гепатоксическим действием, не снижает у подопытных овец количество общего белка в сыворотке крови, не изменяет активности щелочной фосфатазы лактатмалатдегидрогеназы. Вместе с тем, необходимо отметить снижение в крови искупанных овец уровня глюкозы и аскорбиновой кислоты, что свидетельствует о гипоксических изменениях, происходящих в организме овец в первые часы после купки Препарат не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действиями. Остается на шерсти искупанных овец свыше 60 дней (400 мг/кт шерсти), с молоком не выделяется. Убивать животных на мясо после их обработки креопиром можно через 15 дней.
Препарат рекомендуется для купки овец, больных псороптозом в дозе 0,05% по ДВ. Содержание 3,4 -бенз(а)пирена в мясе овец, искупанных в креопире, было практически на уровне естественного фона (0,6-1,4 мкг/кг).
При газохроматографическом исследовании проб молока, полученных в течение 7 суток от подсосных овец, искупанных в лечебных концентрациях креопира, пиретроиды в нем не установлены. В органах и тканях ягнят-сосунов, убитых на 7-й день после ежедневного кормления молоком от овец, искупанных в креопире, пиретроидов не было.
Уровень перметрина в креопире, хранившихся при разных температурных условиях, изменялся неодинаково, в частности, концентрация перметрина в креопире через 137 суток снижалась. Токсичность указанной композиции (ЛД-50) также не изменялась.
Динамика остатков пестицидов в рабочих эмульсиях, на шерсти, в тканях и органах животных
Одним из важных показателей пестицидов является их остаточные количества в продуктах животноводства, а также их персистентность на кожном покрове и концентрация в рабочих эмульсиях при обработки животных. В данном обзоре дан ректроспективный анализ элиминации пиретроидов из органов и тканей сельскохозяйственных животных при различных формах применения указанных препаратов. По данным некоторых исследователей, остатки пиретроидов в организме животных не обнаруживаются уже на следующие сутки после обработки (MB. Хван, 1983, С. Babu, 1985, Л.П. Степанова и др., 1991). В других опытах было установлено отсутствие перметрина в органах и тканях животных после их обработки указанным препаратом (В.Н. Гандзюк, 1989, А.С. Селиванова и др., 1989). В дальнейших исследованиях было показано, что наибольшая часть введённого препарата на основе циперметрина выделяется с мочой (53,8%), фекалиями (48,5%) и 0,5% с молоком, из них 60-70% с молочным жиром (А.А. Непоклонов и др., 1983). Есть сведения об отсутствии остаточных количеств циперметрина в молоке через 7-144 ч после 3-кратной обработки 0,01%-ной эмульсией циперметрина (А.И. Бяздров, 1983).
По другим данным, выделение циперметрина отмечено в течение 3-7 дней после обработки и его наличие в мышцах, крови и мозге в количестве 0,005 мг/г, печени - 0,006 мг/г, почках 0,004 мг/г и в молоке (60-70% в молочном жире), период полу выведения циперметрина из жира составляет 11,7 суток (Г.М. Зубова, 1979).
В опытах A.Croacher et al. (1985) радиоактивные формы циперметрина скармливали с кормом в дозе 2,5 и 10 мг ципермертина дойным коровам. При поглощении циперметрина в дозе 10 мг/г корма остатки препарата в молоке составляли 0,03 мг/г, в жире - 0,1 мг/г. Концентрация остатков в тканях через 21 день была низкой и в такой последовательности: печень почки околопочечный жир подкожный жир кровь мышцы мозг.
При определении остатков фенвалерата (J.Geung, 1989) при его использовании в форме ушных бирок на крупном рогатом скоте показано его наличие на ушах животных в течение 80 дней. Анализ таблицы и других данных свидетельствует о неоднозначных результатах по изучению остатков пиретроидов, что объясняется, по нашему мнению, разными способами обработок (опрыскивание, купка), неодинаковыми концентрациями рабочих эмульсий и в самих препаративных формах препаратов. Что касается остатков дельтаметрина в органах и тканях животных, то в доступной нам литературе подобных сведений найти не удалось. Примечание: В числители — данные производственных испытаний, в знаменателе - лабораторного опыта. Рассматривая различные ДВ на шерсти у животных после обработки их биорексом, креохином необходимо отметить, что это обуславливается различными ПАВ. Если в креохине для этой цели используется креолин, то в биорексе и пирволе - ОП-7 или ОП-10, канифоль и живица сосновая. По всей вероятности, креолин повышает прилипаемость пиретроидов к шерсти и увеличивает проницаемость эпидермиса за счёт выщелачивающего действия препарата. Неодинаковое содержание ДВ на шерсти собак и кошек объясняется различными физико-химическими свойствами кожного покрова этих животных. Эффективность купки овец зависела от многих причин, в том числе от уменьшения концентрации ДВ в ваннах, от динамики её загрязнения и т.д.
Н.П. Кекух (1992) высказывает следующее объяснение этому: как известно шерсть имеет удельную поверхность 1 м2/г, причём на поверхности содержится больше отрицательно заряженных карбоксильных групп, чем положительно заряженных аминогрупп; об этом указывает её изоэлектрическая величина при рН, равном 3,5 (М.Ю, Плетнёв, 1990). Адсорбция препаратов из купочных эмульсий не всегда ограничивается поверхностью шерсти, но и зависит от её состояния, от предшествующей химической обработки, от содержания липидов и влаги и, наконец, от времени контакта с растворами ПАВ, поскольку волокна кератина набухают и представляют для адсорбции дополнительные центры (С. А. Рославцева и др., 1990).
По данным В.А. Кириловских (1998), в эмульсии из креопира с увеличением числа обработанных овец концентрация перметрина уменьшалась, в то время как в пирволе количество перметрина оставалось на исходном уровне. Неодинаковое истощение эмульсии объясняется в первую очередь характером ПАВ. Если в креопире использовали канифоль (в составе креолина), которая способствует диспергированию ДВ в водной среде, коллоидной стабилизации эмульсий, то в пирволе в качестве эмулытрующего компонента применяли неонол АФ-10.
Как сообщает Б.А. Тимофеев и др. (1994), большинство органических соединений, содержащих ароматические группы, к которым относятся пиретроиды, проявляются специфическое связывание с полиалкиленоксидами, оксиэтиленовыми цепями неионогенных активных веществ, в данном случае с неонолом (ПАВ) пирвола. Неонол АФ-10(12) является соединением того же класса, что и ОП-7 (ОП-10) и содержит не менее 95,7-98% основного вещества (в отличие от ОП-7, содержащего не менее 88% основного вещества). Он обладает высокой поверхностной активностью на границе раздела жидкость-жидкость, менее гигроскопичен, чем ОП-7, по степени биологической разлагаемости относится к промежуточному классу веществ со степенью биологического распада более 45%.
Приведённые материалы свидетельствуют, что в пирволе используется более качественный эмульгатор, хотя недостаточная степень его распада в окружающей среде уменьшает ценность ПАВ. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что пестициды должны соответствовать следующим требованиям: обладать персистирующей способностью и специфическим действием на членистоногих во всех стадиях развития, причём, при использовании минимальных доз; сохранять эффективность при различных метеорологических условиях; иметь хорошие экологические показатели. Следует также отметить, что представители одного и того же класса могут обладать разными активными и токсическими свойствами при сходном химическом строении. Каждое вещество имеет характерные особенности и отличается от родственных ему реже по направленности, чаще по силе инсекто-акарицидного действия- Несмотря на указанные различия у представителей одного и того же класса соединений, имеющие сходные свойства, весьма часто они обладают одними и теми же первичными механизмами воздействия.
Влияние креолина на слизистые оболочки глаз кроликов
5-ти кроликам на слизистую оболочку левого глаза было нанесено 2%-ная водная эмульсия креолина (по 5 капель); в правый - нанесли 0,9%-ный физиологический раствор NaCl. При дальнейшем наблюдении (через 30 минут) у 4-х кроликов из левого глаза имело место незначительное истечение серозного характера и небольшую гиперемию, через 1 час. Эти явления значительно уменьшались, а через 24 часа они исчезли. При дальнейшем наблюдении состояния обоих глаз у подопытных кроликов было идентичным. Таким образом, рабочие эмульсии креолина не оказывали неблагоприятного воздействия на слизистые оболочки.
Для проведения опытов в указанном направлении была использована гексеналовая проба. Для этой цели белым мышам 1-й группы алиментарным путём было введено 0,2 мл (2%-ная водная эмульсия креолина); 0,5 мл (2-я группа); 3-й - вода в дозе 0,5 мл.
Гексенал вводили в виде 2%-ного раствора внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг массы тела через 4 часа после дачи креолина. В результате было показано, что продолжительность сна у мышей 1-й группы составляет 3-15 минут (при 3-х не уснувших), во 2-й - 14-23 минуты; у животных 3-йц группы - 21-32 минуты. Указанные материалы дают основание полагать, что креолин не угнетает антитоксическую функцию печени.
С целью изучения влияния креолина на организм овец (3 головы) купали в 3%-ной водной эмульсии указанного препарата. Исследование гематологических показателей проводили через 30 минут, 3 и 48 часов после обработки овец. Контролем служили исследования, проведённые у тех же животных, до применения препарата. В результате анализа данных таблицы 15, можно сделать вывод о том, что количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов у животных, обработанных креолином, колеблется в пределах физиологической нормы (статистически достоверных различий не установлено).
Таким образом, приведённые выше данные свидетельствуют о том, что применение в терапевтических концентрациях креолин не вызывает у подопытных овец изменений гематологических показателей.
Правильное решение вопроса о воздействии того или иного препарата на организм животных и степени его опасности возможно только на основе комплексных исследований крови, включающих в себя как морфологические, так и биохимические тесты. Последние позволяют познать более глубокие, скрыто протекающие изменения в отдельных системах и органах животных. Без данных исследований трудно судить о степени возможности широкого практического применения того или иного акарицидного препарата. Поэтому для выяснения степени токсичности креолина нами были изучены некоторые биохимические показатели.
Как известно, на проникновение какого-либо химического соединения в живой организм в первую очередь реагируют ферменты, в связи, с чем мы изучили у подопытных овец активность холинэстеразы и щелочной фосфатазы.
О количестве фермента, точнее о его активности, которая при прочих равных условиях пропорциональна концентрации фермента, судят обычно по силе производимого им действия, т.е. по количеству субстрата, изменяющегося под влиянием фермента в единицу времени. Все методы количественного учёта ферментов дают представление не об абсолютном количестве, а об относительном его содержании.
Анализ приведённых в таблице 16 материалов свидетельствует о наличии определённых колебаний активности щелочной фосфатазы, однако, эти изменения статистически недостоверны. Активность холинэстеразы у подопытных животных через 30 минут и 3 часа после обработки достоверно снижалась по сравнению с контролем соответственно на 33,4% и 38,4%.. На 2-е сутки она вновь достигала значения, близкого к исходному.
По мнению И.М. Трахтенберга и др. (1978), активность холинэстеразы может колебаться более чем на 40% по сравнению с контролем, это как считают указанные авторы, объясняется лабильностью фермента.
Ветеринарно-санитарная оценка мяса животных проводится на основании органолептических показателей, а также результатов физико-химических, биохимических и бактериологических исследований. При органолептическом исследовании мясопродуктов овец, обработанных 3,0%-ной эмульсией креолина и контрольной группы, на поверхности туш установлена корочка подсыхания бледно-розового цвета, слегка влажные, плотные и упругие мышцы красного цвета, со свойственным баранине запахом, жир белого цвета без посторонних запахов. Бульон, полученный при варке мяса, - прозрачный, ароматный, посторонние запахи отсутствуют.
Для обнаружения в исследуемом материале фермента пероксидазы, наличие которого характерно для мяса здоровых животных, использовалась бензидиновая проба. Сущность реакции заключается в окислении бенздина перекисью водорода в присутствии фермента пероксидазы, в результате чего образуется парах инондимид, дающий с неокис ленным бензидином соединение голубовато-зелёного цвета. Бензидиновая реакция во всех исследуемых пробах была положительная, что согласовывается с показаниями рН и указывает на нормальное течение процессов созревания в мясе.
Реакция с медным купоросом в бульоне, заключающаяся в осаждении солями тяжелых металлов продуктов полураспада белка, во всех исследованных пробах была отрицательной (фильтрат бульона после добавления раствора сернокислой меди оставался прозрачным), что также является характерным признаком доброкачественного мяса, с нормально протекающими биохимическими процессами.
Содержание летучих жирных кислот (ЛЖК) во всех пробах колебалось в пределах, соответствующих доброкачественному мясу 2,27±0,01; 2,36-0,05 мг КОН, указывающих на нормальное течение белкового и липидного обмена.
Разработка методики определения остаточных количеств креолина (по нафталину) в биологических объектах
Подготовка к выполнению измерений. Подготовка хроматографической колонки. Хроматографическую колонку промывали, сушили н заполняли адсорбентом. Заполнение производили малыми дозами при легком постукивании по колонке. Для обеспечения плотной упаковки конец колонки присоединяли к вакуумному насосу. Концы заполненной колонки закрывали комочками стекловаты.
Колонку устанавливали в термостат хроматографа, продували газом-носителем (азотом) при температуре 230С в течение 6-8 часов. Затем колонку присоединяли к детектору. После окончания работы каждый день температура термостата колонки должна быть повышена до 230С и колонка должна быть откондиционирована в течение 1 часа при включенном детекторе. После 3-дневной работы рекомендуется заменить 3-4 см наполнителя с конца колонки, подсоединенного к испарителю. Приготовление растворов. Раствор нафталина с массовой концентрацией 0,50мг/50 см3. В мерную колбу емкостью 50 см3 взвешивали на микровесах 0,5 мг нафталина (точность взвешивания ± 0,002мг), добавляли 10 см3 ацетона, растворяли навеску полностью и доводили до метки ацетоном. Перемешивали. Полученный раствор (раствор А) использовали для приготовления раствора для построения градуировочного графика. Срок хранения раствора 2 месяца при условии хранения его в холодильнике. Раствор нафталина с массовой концентрацией 0,5 мкг/см . В мерную колбу ёмкостью 100 см3 вносили пипеткой 5 см3 раствора А, доводили до метки ацетоном. Перемешивали. Раствор (раствор В) использовали для построения градуировочного графика. Срок хранения раствора в течение месяца при условии хранения в холодильнике.
Построение градуировочного графика. Градуировочный график строили, откладывая на оси ординат высоту сигнала нафталина в мм, на оси абсцисс — массовую концентрацию нафталина в нг. Для получения данных для построения графика в хроматограф вводили 1,7 мкл, 2,7 мкл, 3,7 мкл, 5,7 мкл, 8,7 мкл раствора В. Каждый объём пробы вводили по 3 раза, относительное СКО результатов параллельных измерений сигналов нафталина для каждого вводимого объёма не должно превышать 5% (см. таблицу 23).
Образец биологических проб (печень, почки, селезенка, л легкое, сердце, мышечная или жировая ткань и т.п.) измельчали на мясорубке или микроизмельчителе ткани РТ-2, после измельчения пробу тщательно перемешивали, разравнивали и шпателем отбирали из разных мест навеску пробы массой 10-13 грамм (точность взвешивания 0,02 г). Навеску помещали в коническую колбу с притёртой пробкой ёмкостью 250 см3. Добавляли 20-25 см3 этилового эфира и проводили экстракцию нафталина путём перемешивания содержимого колбы на магнитной мешалке в течение 1 часа. Эфирный экстракт сливали декантацией в коническую колбу с притёртой пробкой ёмкостью 100 см , в которую предварительно помещали 25-55 грамм безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяли ещё дважды, добавляя к анализируемой пробе по 10-13 смЗ этилового эфира, перемешивали на магнитной мешалке содержимое колбы по 30 минут каждую экстракцию. Экстракты соединяли и концентрировали до объёма 10-12 см3, удаляя этиловый эфир с помощью водоструйного или масляного насоса при комнатной температуре с подсоединёнными 3 мя адсорбционными ловушками с силикагелем SEP-PAK фирмы Waters Associates. Затем помещали ёмкость в водяную баню, нагретую до 65С, и подключали вакуумный насос. Осторожно отгоняли остатки этилового эфира в течение 7-10 минут, при этом нафталин сублимируется и адсорбируется на силикагельных поглотителях. После охлаждения всей системы поглотители отсоединяли от колбы и промывали каждый поглотитель с помощью шприца (объёмом 500 мкл) 1-1,5 см этилового эфира для извлечения нафталина. Экстракт повторно отгоняли на водоструйном или масляном насосе до объёма 1,01-1,5 см3 при комнатной температуре и фиксировали объём этого экстракта (V2).
Из пробирки отбирали необходимый объём (VI) и вводили его в хроматограф. Объем вводимой в хроматограф пробы составлял 2-5 мкл в зависимости от содержания нафталина. Ввод каждой пробы повторяли дважды. При наличии нафталина в анализируемой пробе определяли с помощью линейки высоту сигнала нафталина в параллельных вводах (XI и Х2). За результат измерения принимают среднее арифметическое значение: Х= (Х1+Х2)/2.
Расхождение между измеренными высотами сигналов не должны отличатся более чем на 5%, т.е, (Х1-Х2)/2 0,05. В противном случае вод пробы повторяли.
Образцами для контроля являлись реальные пробы биологических объектов. Масса отобранной для контроля пробы должна соответствовать удвоенной массе, необходимой для проведения анализа по методике. Отобранную массу делили на две равные части и анализировали в точном соответствии с прописью методики в разное время, получая два результата (первичный - ml и повторный -т2) причём в этом случае максимально варьируют условия проведения анализа, если возможно — анализ выполняли разные операторы на разных приборах. Оперативный контроль погрешности (точности) методики. Оперативный контроль погрешности методики осуществляли с использованием образцов для контроля или методом добавок известного количества определяемого элемента в реальные пробы биологических объектов. Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности (точности) с использованием метода добавок. Масса отобранной для контроля рабочей пробы должна соответствовать удвоенной массе, необходимой для проведения анализа по методике. Отобранную массу пробы делили на две равные части, первую из которых анализировали в точном соответствии с прописью методики и получали средний из 2-х параллельных определений результата анализа исходной рабочей пробы - т, ко второй делали добавку нафталина (с использованием аттестованных граду ировочных растворов), причём величина добавки должна составлять 50-150% от содержания нафталина в пробе. Пробу с добавкой анализировали в точном соответствии с прописью методики, получая средний из 2-х параллельных определений результат анализа рабочей пробы с добавкой mg. Результат анализа пробы с введённой добавкой не должен выходить за верхнюю границу определяемых содержаний.
Сравнивали результат контрольной процедуры (Kg), равный разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (mg), пробы без добавки (т) и величиной добавки (g) с нормативом оперативного контроля погрешности (К0).
