Содержание к диссертации
Введение
1 .Обзор литературы 9
1.1. Характеристика болезни 9
1.2.Этиология и патогенез 13
1.2.1. Половой цикл собак 13
1.2.2.. Влияние ,половых гормонов и различной микрофлоры на этиология и патогенез эндометрита у сук 16
1.2.3. Кисты яичников и их влияние на половые циклы сук 20
1.2.4. Влияние иммунологических факторов на этиологию и патогенез послеродовых эндометритов у сук 24
1.2.5. Клинические признаки эндометрита 30
1.2.6. Диагностика эндометрита и кисты яичников у сук 35
1.2.7. Лечение 41
2. Собственные исследования 49
2.1. Материалы и методы 49
2.1.1. Клинические, морфологические и биохимические методы исследования 53
2.1.2. Микробиологические исследования цервикальной слизи 57
2.1.3. Методы гормональных исследований 58
2.1.3.1. Радиоиммунологическое определение прогестерона в сыворотке крови 58
2.1.3.2. Радиоиммунологическое определение эстрадиола- 17В 61
2.1.4. Методы исследования неспецифической резистентности 66
2.1.4.1. Методы исследования активности лизоцима в сыворотке крови 66
2.1.4.2. Методы исследования фагоцитарной активности нейтрофилов крови 69
2.1.5. Методы исследования иммунитета 71
2.1.5.1. Методика исследования лейкоцитов, лимфоцитов в крови в описании Е.С.Воронина, A.M. Петрова, М.М.Серых и др (2002г.) 71
2.1.5.2. Методика определения Т-лимфоцитов в крови 73
2.1.5.3. Методика определения В-лимфоцитов в крови 77
2.2. Результаты собственных исследований 79
2.2.1.Распространение хронического эндометрита и кисты яичников у сук...79
2.2.2. Влияние половых гормонов на развитие хронического эндометрита и кисты яичников у сук 83
2.2.3. Динамика показателей иммунитета и неспецифической (естественной) резистентности при хроническом эндометрите и кистах яичников у сук 88
3. Обсуждение результатов исследований 99
Выводы 109
Практическое использование полученных научных результатов 111
Рекомендации по использованию научных выводов... 113
Список литературы 114
- Влияние ,половых гормонов и различной микрофлоры на этиология и патогенез эндометрита у сук
- Клинические признаки эндометрита
- Клинические, морфологические и биохимические методы исследования
- Методика исследования лейкоцитов, лимфоцитов в крови в описании Е.С.Воронина, A.M. Петрова, М.М.Серых и др (2002г.)
Введение к работе
Актуальность темы. По данным ряда актов: В.А.Карпова, 1984., В.А. Лукьяновского, Ю.И. Филиппова, 1988., Э.Б. Мордашевой, 2002., Г.П. Дюльгера, 2002., Н.С.Саженевой, 2004., Г.Б. Чулковой, 2007., Н.С. Емельяновой, 2007., А.В. Шориной, 2007 болезни репродуктивной системы у мелких домашних животных составляют до 20% от общего числа различных заболеваний.
Одним из наиболее часто встречающихся акушерско-гинекологических заболеваний у сук является эндометрит. Восстановление слизистой оболочки матки чаще всего проявляется в виде симптомокомплекса : эндометрит, метрит, пиометра. В зарубежной литературе наряду с указанным симптомокомплексом был предложен термин метропатия, который указывает на тот факт, что данная патология имея различную этиологию, объединяется сходностью клинических признаков, методов диагностики, лечения и профилактики.
Данное заболевание чаще всего рассматривают как системное заболевание, так как оно затрагивает функцию иммунной системы, центральной нервной системы и эндокринной систем, матки яичников, молочных желез и приводит к нарушению обмена веществ в организме животных.
Следует отметить тот факт, что при развитии эндометрита, острая стадия заболевания, занимает небольшой период времени и даже может не проявляться клинически, поэтому в диссертационной работе мы рассматриваем только хроническую стадию заболевания. При проникновении микрофлоры в полость матки, развивается воспалительный процесс, в который, в первую очередь, вовлекается базальный слой эндометрия с последующим нарушением регенерации клеток с задержкой эпителизации слизистой оболочки. После поражения базального слоя воспалительный процесс распространяется в миометрии. Воспаление может захватывать слизистую и мышечную (эндометрит) или же все оболочки
матки (гангренозный; некротический метрит) и даже распространяться за её пределы (септический метрит) Э.Б. Мордашева, 2002., Г.П.Дюльгер, 2002.
По данным Н.С. Емельяновой (2007) у 21,7% собак встречается сочетанная патология - эндометрия и киста яичников.
Фолликулярные кисты яичников были обнаружены при проведении плановой овариоэктомии, а в остальных случаях при проведении овариогистероэктомии у сук с диагнозом хронический эндометрит и при проведении кесарева сечения у животных с патологическими родами, связанными с атонией и гипотонией матки.
Данная патология чаще всего приводит к полной потере репродуктивной функции у сук.
В настоящее время, несмотря на явную актуальность данного вопроса, как у нас в России, так и за рубежом до сих пор не разработан эффективный комплексный метод лечения животных при данной патологии.
Данная проблема также актуальна для специалистов, содержащих сук, активно использующихся в племенном разведении и, содержащихся в питомниках.
Поэтому наиболее остро стоит вопрос о ранней диагностике эндометрита и кисты яичников у сук и выборе рационального и эффективного метода лечения, позволяющего сохранить репродуктивную функцию животного. Содержание собак в квартирах, отсутствия активного моциона, влияние стрессовых и экологических факторов, режима жизни животного от хозяина, провоцируют возникновения ряда акушерско-гинекологических заболеваний у сук и в частности эндометрит и серьезно затрудняют процесс лечения животных.
Цель и задачи исследований.
Целью наших исследований является изучение хронического эндометрита у сук осложненного кистой яичников и разработка эффективного метода лечения при данной патологии. Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:
Изучить этиологию данного заболевания .основываясь на анамнезах, а также на особенностях гормональных и иммунологических показателей крови.
Выделить и идентифицировать микрофлору из вагинальной слизи у сук больных хроническим эндометритом.
Изучить концентрацию половых гормонов(прогестерона и эстрадиола) в крови здоровых сук и у больных хроническим эндометритом с кистой яичников.
Изучить параметры иммунитета и неспецифической защиты(резистентности) у здоровых сук и у больных хроническим эндометритом с кистой яичников.
Разработать эффективный комплексный метод лечения данного заболевания у сук с использованием гормональных, антимикробных, противогрибковых препаратов и иммуномодулятора «Баксин-вст».
6. Рассмотреть возможность принятия мер профилактики данного
заболевания.
Научная новизна.
Изучено распространение хронического эндометрита и кисты яичников у сук в условиях Московской области. Определены основные микроорганизмы и их ассоциации, вызывающие хронический эндометрит у сук. Впервые проведено_определение основных параметров иммунитета и неспецифической защиты (резистентности) организма сук при использовании иммуномодулятора «Баксин-вет».
Определена концентрация половьгх гормонов (эстрадиол и прогестерон) в крови у сук в процессе болезни и после их выздоровления.
Теоретическая и практическая значимость.
Изучены гормональные и иммунологические показатели крови у сук при хроническом эндометрите осложненном кистой яичников. Разработана и
внедрена схема комплексного лечения хронического эндометрита с учетом дисфункции яичников с использованием иммуномодулятора «Баксин-вет».
При гиповолемии, детоксикации и для восстановления коллоидно-осматического состояния рекомендована многократная гидротационная терапия.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.
Результаты диагностики хронического эндометрита у сук с учетом дисфункции яичников.
Результаты исследования бактериальной Контаминации матки у сук при хроническом воспалении эндометрия.
Результаты определения эстрадиола и прогестерона в крови животных в процессе лечения и после их выздоровления.
Показатели основных параметров иммунитета и неспецифической защиты (резистентности) организма животных при хроническом эндометрите с использованием для лечения иммуномодулятора «Баксин-вет».
Результаты внедрения комплексного метода лечения хронического эндометрита и кисты яичников у сук с использованием антибиотиков, сульфаниламидных, антигрибковых препаратов, метронидазола , гормональных препаратов и иммуномодулятора «баксин-вет».
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы доложены обсуждены и одобрены на конференциях профессорско-преподавательского состава , научных сотрудников и аспирантов Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (2006-2008); Международной научно-практической конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения» ГНУ
«Всероссийский научно исследовательский институт животноводства (ВНИИЖ) , Дубровицы, 2008; Международной научной конференции посвященного 200-летию высшего ветеринарного образования и основания Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины на тему: « Новые аспекты биотехнологии репродукции животных» . Санкт-Петербург, 2008; На XVI Московском международном конгрессе по болезням мелких домашних животных (2008).
Публикации
По результатам собственных исследований с 2005-2008 гг. опубликовано 4 статьи , в том числе 4 статьи в изданиях рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных, обсуждение выводов, практических предложений и списка используемой литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 5 рисунками.
Влияние ,половых гормонов и различной микрофлоры на этиология и патогенез эндометрита у сук
Ряд исследований Э.Б. Мордашева, 2002., Г.Б. Чулкова, 2007., Н.с. Емельянова, 2007 считают, что одной из основных причин возникновения хронического эндометрита у сук является эндокринные расстройства. По их мнению состояние гиперэстрогенемии провоцирует возникновение гиперплазии эндометрия и его желез. Это приводит к изменению структуры стенок сосудов, они истончаются и повышается их проницаемость, что приводит к маточным кровотечениям.
Для патологии, возникающей в период метэструса, решающей причиной, вероятно, является повышение выработки прогестерона (гиперпрогестеронемия). Под его влиянием происходит быстрый переход желез эндометрия из фазы пролиферации в фазу секреции. Этот процесс напоминает, по мнению авторов, гормональную подготовку стенки матки для имплантации зародыша. Однако при отсутствии плодотворной вязки этот процесс приводит к снижению активности миоэметрия, при этом канал шейки матки сильно суживается или полностью закрывается и происходит постепенное накопление секрета маточных желез в полости тем самым, создавая благоприятные условия для развития там микрофлоры.
Далее Н.С. Емельянова (2007) ссылаясь на результаты собственных исследований и на результаты исследований Е.Е.Емарова (2004) и А.А. Федина (2005) отмечает, что возрастающая секреция прогестерона существенно снилсает резистентность слизистой оболочки матки к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, проникающим через какал шейки матки во время эструса, в результате чего микроорганизмы активно размножаются, а их токсины вызывают в эндометрии усиленную секрецию и экссудацию. По данным В.Е. Вингфилда (2000) и А.А. Федина (2005), эстрогены также значительно усиливают тялсесть болезни, засчет повышения количества рецепторов, чувствительных к прогестерону в эндометрии матки, а при затяжной течке сук способствуют возникновению железисто-кистозной гиперплазии их эндометрия.
А.И.Даниленко (1989), под влиянием избытка эстрогенов происходят типичные для иммунодифицитных состояний изменения лимфоидных органов, угнетение Т-клеточного звена иммунного ответа. При эндометритах бактериальной природы имеют место нарушения клеточного и гуморального иммунитета, уменьшение содержания IgA, увеличение числа IgG-продуцируемых клеток, циркулирующих иммунных комплексов, подавление макрофагальной активности, уменьшение количества естественных киллеров и хелперов на фоне значительного увеличения количества Т-супрессоров (Батырова А.К. с соавт., 1991; Mutwiri G.K., Corbeil L.B., 1998; Медведев Б.И. с соавт., 2000).
Хронический эндометрит часто сопровождает гиперпластические процессы эндометрия, полипы, миому матки, дисфункциональные маточные кровотечения вследствие сопутствующего снижения барьера функции нижних отделов генитального тракта ( Когп А.Р. et. al., 1995; Patterson-Keels L.M. et. al., 1994; Вартазарян Н.Д. с соавт., 2005). По данным В.И. Федюка (2000), пиометра при длительном течении провоцирует возникновение новообразований. J.W. Barrington et.al. (1994), B.J. Smith, S.D. Holladay (1997) объясняют частоту диагностики хронического эндометрита у пациентов в возрасте тем, что в слизистых оболочках полового тракта в связи с дефицитом эстрогенов помимо преобладания эффектов иммуносупрессии происходит угнетение продукции IgA.
В.А. Карпов (1990), В.П. Гончаров, Д.А. Черепахин (2004), В.В. Храмцов, Т.Е. Григорьева, В.Я. Никитин (2007), A.M. Белобороденко, М.А. Белобороденко, Т.А. Белобороденко (2007) считают, что послеродовой эндометрит возникает в результате травмирования эндометрия и внедрения различных микроорганизмов через родовые пути в матку при патологических родах , задержании последа, субинволюции матки. Нередко воспаление матки возникает как осложнение гнойного вагинита. Немаловажное значение имеют предрасполагающие факторы, снижающие резистентность организма: неполноценное кормление, антисанитарные условия содержания.
Послеродовой острый эндометрит вначале протекает в виде катарального, но вскоре переходит в гнойно-катаральную или гнойную форму. При этом в слизистой оболочке матки возникают гиперемия, отек, кровоизлияния, небольшие изъявления, в полости матки скапливается экссудат. Тонус и сократительная способность матки понижаются. Развивается интоксикация организма.
При запоздалом или бессистемном лечении острый эндометрит принимает хроническое течение, сопровождающееся атрофией и кистозным перерождением маточных желез, разрастанием соединительной ткани в слизистой и мышечной оболочках матки и другими изменениями, обусловливающими бесплодие самки. Иногда воспалительный процесс распространяется на яйцепроводы и яичники, возникают сальпингит и оофорит. В основе этиологии данного заболевания, по мнению большинства исследователей (Duder С, Dow С. (1958); Карпов В.А. (1990); Birger М., (1996); Ниманд Х.Г., Сутер П.Ф. (1998); Forbes N. (1999), Е.В. Саженева (2004) являются нарушения гормональной функции яичников и инфицирование матки патогенной микрофлорой. Berthold с соавторами (1986) считают, что бактериальное заражение при пиометре происходит чаще всего восходящим путем, т.е. из мочевы водящей системы в ранней лютеальной фазе полового цикла, когда шейка матки ещё открыта. Более редким, но возможным, является лимфогематогенный путь заражения. Также некоторые авторы (Dow С. (1975); Gonsalis G. (1994); Wadas В. (1996); Beutin L. и др.) не отрицают и бактериального обсеменения полости матки микроорганизмами, являющимися нормальной микрофлорой желудочно-кишечного тракта животных. Белов А.Д. (1994), Dhaliwal G.K., Wray С. (1998) и др. считают, что первоначальное эндокринное расстройство характеризуется повышением уровня эстрогенов в крови, а следовательно повышенной выработкой прогестерона. При этом эстрогены усиливают действие прогестерона, что в свою очередь ведет к повышению риска развития данного синдрома, т.к. под влиянием прогестерона происходит резкая перестройка эндометрия из фазы пролиферации в секретную фазу, уменьшается моторика матки, идет ослабление локального лейкоцитарного барьера, т.е. изменяется резистентность тканей эндометрия к бактериальным инфекциям. Количество бактерий в матке возрастает и возникает эндометрит с гиперсекрецией маточных желез. Постепенно матка наполняется гнойным секретом.
Клинические признаки эндометрита
Э.Б. Мордашева (2002) отмечает, что первым признаком, на который обращает внимание владельцы животного, является частичная или полноценная анорексия и жажда, отмечается дрожь, слабость конечностей, рвота. Из вульвы появляются выделения в виде темной слизи с примесью крови. Как правило, в начальный период болезни температура остается в границах физиологической нормы или была субфебрильной, частота пульса и количество дыхательных движений так же оставались в пределах нормы или слегка повышались. Постепенно у животного увеличивается объем живота, брюшная стенка становится напряженной, проявлялась болезненность в разной степени. Начальная стадия метропатии характеризовалась гиперемией и набуханием оболочки матки, скоплением в ней различного по своему составу экссудата. На этой стадии у животного, при пальпации через брюшную стенку, отмечалась сильная болезненность, иногда слабо выраженная флюктуация, этот процесс сопровождался снижением или отсутствием сократительной способности матки.
При достаточно длительном сроке течения болезни пальпацией определялось увеличение объема рогов матки, их уплотнение эндометрия или напротив истончение, в сочетании с выраженной флюю-уацией, как правило, в обоих рогах матки. При этом болезненность может быть снижена или полностью отсутствовать.
В.А. Лукьяновский, Ю.И. Филиппов, Е.П. Копёнкин и др. (1988) указывают, что послеродовой метрит и септицемия наблюдаются чаще всего на 3-5-й день от начала родов. Метрит в легких случаях проявляется признаками послеродовой интоксикации в виде общего недомогания, снижения или отсутствия аппетита, повышенного приема воды, гипогалактии, небольшого подъема температуры тела, учащения пульса и др. В тяжелых случаях развивается септицемия. Для нее характерны: сильный подъем температуры тела до 40,0-41,5С, тяжелое общее состояние -слабость, сонливость, безучастность к окружающему, шаткость походки, дрожь, отказ от корма, жажда, рвота, агалактия. Пульс частый, слабый. Слизистые оболочки покрасневшие. Застой крови в поверхностных венах, похолодание кожи и снижение её эластичности.
Выделения из половой щели скудные или обильные, жидкие, грязно-бурого цвета с ихорозным запахом. Через брюшные стенки пальпируются увеличенные дряблые рога матки или обнаружить их не удается из-за повышенного напряжения брюшных стенок ( при перитоните). Иногда в матке находят задержавшийся мертвый плод или послед (диагноз уточняют рентгенологическим исследованием). Щенки могут подвергаться интоксикации через молоко матери, при этом они быстро слабеют и нередко погибают.
В.А. Карпов (1990) отмечает, что послеродовой эндометрит вначале протекает в виде катарального, но вскоре переходит в гнойно-катаральную или гнойную форму. При этом в слизистой оболочке матки возникают, гиперемия, отек, кровоизлияния, небольшие изъязвления, в полости матки скапливается экссудат. Тонус и сократительная способность матки понижается. Развивается интоксикация организма. При интенсивном развитии воспалительного процесса отмечают угнетение животного, повышения температуры тела на 0,5-1,ОС, уменьшение или отсутствие аппетита, снижение секреции молока. Из наружных половых органов выделяется слизисто-гнойный или жидкий мутный экссудат серого цвета, нередко с примесью или с неприятным запахом. Иногда он бывает желто-бурого цвета с хлопьями фибрина (фибринозный эндометрит). При эндометрите, в отличие от вагинита, истечения из вульвы более обильные, усиливаются при лежании животного.
При пониженной резистентности организма, особенно при наличии ранений стенки матки, нередко в воспалительный процесс вовлекается её мышечный слой (развивается миометрит) или её серозная оболочка (периметрит). Прогноз в этих случаях осторожный, животное может погибнуть от сепсиса. При запоздалом или бессистемном лечении острый эндометрит принимает хроническое течение, сопровождающееся атрофией и кистозным перерождением маточных желез, разрастанием соединительной ткани в слизистой и мышечной оболочках матки и другими изменениями, обусловливающими бесплодие самки. Иногда воспалительный процесс распространяется на яйцепроводы и яичники, возникают соответственно сальпингит и оофорит.
Г.Б. Чулкова (2007) ссылаясь на результаты исследования А.В. Шафиковой (2005), в Ростовской области отмечает, что хронический эндометрит был выявлен у 6% собак поступивших на лечения в ветеринарные клиники. При этом хронический эндометрит у сук проявляется в основном выделениями из половых органов экссудата и полиурией.
Полиурией, как отмечает далее автор принято называть увеличение суточного диуреза. Длительно протекающая полиурия приводит к нарушениям водно-солевого обмена, что нарушает соотношение электролитов и белков в организме животного.
В.А. Карпов (1990) описывая кисты у сук отмечает, что симптомы зависят от гормональной активности кист. При кистах, вырабатывающих эстрогены. Может удлиняться период проэструса - эструса ( см. «Затяжная пустовка у собак») или наблюдается нимфомания. При нимфомании вульва набухшая, выделения из нее могут иметь красноватый цвет или быть светлыми, часто вообще отсутствуют. Отмечается половое возбуждение и охота, но при спаривании оплодотворение не наступает. Результаты вагинально-цитологического исследования указывают на насыщение организма эстрогенами (в мазке все клетки или большинство из них ороговевшие, лейкоциты отсутствуют). Признаки гиперэстрогении остаются без изменений на протяжении многих недель. При кистах, вырабатывающих прогестерон или не вырабатывающих никаких гормонов, наблюдается пролонгированный анэструс (анафродизия). Кисты, продуцирующие прогестерон, иногда вызывающие развитие железисто-кистозной гиперплазии эндометрия. Пальпацией через брюшные стенки удается обнаружить только достаточно крупные фолликулярные кисты яичников.
Клинические, морфологические и биохимические методы исследования
Основным критерием при клинических методах исследования является сбор анамнеза. Было отмечено, что заболевание сук хроническим эндометритом имеет определенную тенденцию. Так , с 5 до 10 летнего возраста животные наиболее подвержены данному заболеванию. Тогда как с 14 летнего возраста сук количество сук, больных хроническим эндометритом резко сокращается и к 16 летнему возрасту составляет 11,6% , тогда как в 10 летнем возрасте сук количество больных животных было 24,4 %. Предполагаем, что это связано со снижением репродуктивных способностей у сук в связи с их возрастом и снижением контактов с производителями. При сборе анамнеза учитывали: возраст животных; характер питания; условия содержания; наличие активного моциона; отношение владельцев к животным; характер половых циклов; наличие или отсутствие родов; течение послеродового периода; сезонность заболевания; особенности клинической картины заболевания; течение болезни и особенности медикаментозной терапии; биохимические показатели крови больных сук; структуру влагалищных мазков; гормональные показатели (прогестерон и эстрадиол); параметры специфического иммунитета и неспецифической защиты(естественной резистентности), на момент обращения в ветеринарную клинику. Для определения эффективности комплексного метода терапии при хроническом эндометрите у сук осложненного кистой яичников находилось 60 сук, из которых по мере поступления в клинику были сформированы три подопытных группы. 1. Контрольная группа, здоровые суки - 20 гол. Лекарственные препараты животным данной группы не применялись. 2. II Опытная группа. 20 сук, больные хроническим эндометритом, осложненным кистой яичников. Для их лечения использовали: -Рокситромицин ( антибиотик макролид), который назначали в дозе по 150мг ( 1 таблетка) 2раза в сутки внутрь с кормом. -Ципрофлоксацин(антибиотик широкого спектра действия из группы фторхинолов, обладающий наименьшим иммунодепрессивным действием) вводили внутривенно но 0,3г в 25-30 мл 0,9% р-ра натрия хлорида 2раза в сутки. Одновременно с антибиотиками внутрь назначали метронидазол (трихопол) по 0,2г 2раза в сутки, сульфаниламидный препарат- 10% р-р этазола натрия по 5мл 2раза в сутки внутривенно.
Для устранения грибковой микрофлоры применяли микомакс по 100мг внутрь с кормом один раз в течение 5-7 суток. Из гормональных препаратов при фолликулярных кистах внутримышечно однократно вводили 5мкг Сурфагона, а при лютеиновых кистах яичников - магэстрофан также однократно внутримышечно в дозе по 0,2мл. Для устранения гиповолемии, интоксикации и коррекции нарушений коллоидно осмотического или водно - солевого баланса проводили гидратационную терапию. Для этого ежедневно внутривенно вводили до 150мл раствора реополиглюкина, 50 мл плазмы, 50 мл 10%ного раствора глюкозы, 50мл раствора Рингера. Общий объем инфузии за сутки составлял 250-300 мл. Соотношение между коллоидными и кристаллоидными растворами равно 1:1. Для усиления кровообращения матки и ускорения эвакуации экссудата назначали внутримышечно окситоцин 3-5 ЕД один раз в сутки в течение 5-7 суток. На фоне медикаментозной терапии собакам назначали диету и ежедневно организовывали активный длительный моцион на свежем воздухе в течение 3-4 часов. Курс комплексной терапии составлял 10-14 суток. Животное считались клинически здоровым, если у него не было выявлено клинических и лабораторных признаков заболевания в течение 12-18 месяцев после выздоровления. 3. III Опытная группа. 20 сук, больные хроническим эндометритом, осложненным кистой яичников. Для их лечения, кроме вышеуказанных препаратов, применяемых во второй опытной группе, дополнительно использовали иммуномодулятор - «Баксин-вет». «Баксин-вет» задавали с кормом внутрь 1 раз в день по 2 капсулы в течение двух недель.
Контроль за состоянием репродуктивных органов у сук осуществляли методом узи-диагностики. Эффективность лечения животных оценивали по клиническим признакам животных, данным лабораторных исследований, узи- и по результативным вязкам сук в первую охоту после выздоровления.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel , 2000. Критерий достоверности определяли с помощью таблицы t-распределения Стьюдента с учетом рекомендаций Г.Ф. Лакина(1990) и в В.А.Середина (2001). При этом определяли среднюю величину каждого показателя, ошибку средней величины и достоверность различий средних величин.
Клинический осмотр больных животных проводили по традиционной общепринятой методике. При этом исследовали состояние кожных покровов, цвет слизистых оболочек, тургор кожи, мышечный тонус, наличие рефлексов, состояние языка, форму и размер живота, состояние наружных половых органов и выделений из них. При пальпации живота выявляли наличие болезненных участков в области кишечника и матки. С помощью влагалищного зеркала исследовали состояние слизистой оболочки влагалища и шейки матки. Температуру тела у сук измеряли термометром ректально. Пульс прощупывали с внутренней стороны бедра по бедренной артерии, при этом учитывали частоту пульса и степень наполнения. Частоту сердечных сокращений определяли по пульсу. Кровь для морфологических исследований брали у сук утром до их кормления из подкожной вены предплечья или из яремной вены. Подсчет форменных элементов крови производили с использованием готовых тест-систем «UNOPET-NET». Данные наборы разработаны для определения количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.
Методика исследования лейкоцитов, лимфоцитов в крови в описании Е.С.Воронина, A.M. Петрова, М.М.Серых и др (2002г.)
В качестве показателей иммунитета исследуют в цельной крови общее количество лейкоцитов, и в том числе лимфоцитов. Идентифицируют среди них Т- и В-лимфоциты, а в сыворотке крови определяют содержание иммуноглобулинов различных классов. Кровь для исследования берут из яремной вены. Для получения цельной крови предварительно в пробирки вносят антикоагулянт— 100—200 ед. гепарина на 10 мл крови. Для получения сыворотки, пробирки с кровью помещают в термостат (37 С) на 30 мин. после чего сгусток отделяют с помощью спицы из нержавеющей стали. После этого пробирки с сывороткой крови устанавливают в штатив и помещают в холодильник (4 С) на (6-8 часов) в дальнейшем сыворотку переливают в пеницеллиновые флаконы, закрывают пробками, хранят при температуре -20-40 С до её использования.
Визуальный метод подсчета лейкоцитов и определения леіікограммьі. Количество лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева. Для этого в пробирку вносят 0,4 мл (0,38 мл) разводящей жидкости и 0,02 мл исследуемой крови. Получают разведение 1: 20. В качестве разводящей жидкости используют 3%-ый раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим (уксусная кислот лизирует эритроциты, метиленовый синий окрашивает ядра лейкоцитов). Перед заполнением камеры Горяева пробирку с разведенной кровью тщательно встряхивают. Чистое сухое покровное стекло притирают к камере до появления радужных колец. Каплю крови наносят к краю шлифовального стекла камеры. Поскольку лейкоцитов гораздо меньше , чем эритроцитов, и на большой квадрат их приходится 1-2, то для точности подсчет производится и 100 больших квадратов (1600 малых).
Практически (при условии соблюдения указанных правил разведения и подсчета) для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл достаточно полученную при подсчете сумму разделить пополам и умножить на 100. Лейкоформулу определяют посредством дифференциального подсчета форменных элементов белой крови на мазках. Мазки готовят общепринятым способом. После высушивания при комнатной температуре их по краю подписывают мягким простым карандашом и фиксируют. 5 мин в метаноле или 20 мин в этаноле. Мазки окрашивают в течение 20-40 мин. свеже приготовленным раствором красителя по Романоскому-Гимзе (2-3 капли основного раствора красителя на 1 мл воды), затем их промывают водой, сушат и исследуют под микроскопом ( масляная или глицериновая иммерсия , объектив Х90 окуляр Х7-10.
Принцип метода, Тнмусзависимые Т-лпмфоциты имеют рецепторы для эритроцитов барана, которые вхлслупают, таким образом, специфическим маркером для их распознавания (Е-РОК: ЕгуПігосуЧе-розеткообразующие клетки).
Оборудование н аппаратура: центрифуга ЦЛК-1; холодильник бытовой; термосі а г; микроскоп люминесцентный (МЛ-2 или другие типы): камера Горяева; счетчик клеток; автоматические пипетки или микропипетки: пробирки силшеопированные или пластиковые; штатив для пробирок. Реактивы: среда 199. раствор Хеикса; гепарин (готовят раствор из расчета 25 БД/мл крови); фосфатный б_уфер (рН 7,4); 0,0!%-ный раствор ак ридинового оранжевого; 0,1%-ный раствор эозина; 0,1%-ный раствор три-панового синего на дистиллированной воде; гипак (изопак, верографин, уро траст); фиколл-400 (полисахарид с молекулярной массой 400 000 Д); эритроциты барана.
Ход определения. Вносят 10 мл крови в пластиковую пробирку с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно перемешивают. Гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером (рН 7,4) в соотношении 1 : 2. 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фи кол л-гипак плотностью 1,077 г/мл (12 частей 9%-ного фиколла и 5 частей 33,9%-ного гипака плотностью 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин
Приготовление эритроцитов барана. Используют эритроциты одного животного или смесь, полученную от нескольких. Эритроциты можно хранить в течение 2 нед при 4 С в растворе Олсвера (глюкоза — 2,05 г, цитрат натрия — 0,8 , хлорид натрия — 0,42 г, дистиллированная вода— 100мл), рН этого раствора устанавливают равным 6,1 с помощью 10%-ного раствора лимонной кислоты. Перед употреблением эритроциты барана 3-4 раза отмывают фосфатным буфером и готовят 0,5%-ную (по объему) взвесь клеток.
Подготовка и учет реакции розеткообрзоваиия. Реакцию проводят по методу, описанному Jondal и соавт. в 1972 г. В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5%-ной взвеси эритроцитов и лимфоцитов барана. Соотношение эритроциты : лимфоциты не должно превышать 50 . 1. Инкубируют смесь в термостате 37 С . в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) и оставляют на ночь в холодильнике при температуре 4 С. Подсчет клеток мы проводят в камере горяева.
Приготовление мазков для подсчета Т-лимфоцитов. Предметные стекла необходимо пронумеровать на каждое исследуемое животное. Из приготовленной суспензии па предметном стекле делают мазки (3 размазанные капли). Всушивают мазки на воздухе. Фиксируют на мостике метанолом в течение 7-10 мин, промывают дистиллированной водой, высушивают и окрашивают краской Романовского — Гимзы, через 30 мин промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, Абсолютное количество Т-лимфоцитов можно рассчитать, зная количество лейкоцитов в 1 л крови (а), процент лимфоцитов в крови (б) и процент розет кообразующих Т-лимфоцитов (в) по формуле абв/10000.пример: в крови собаки содержание лейкоцитов составляет 8,7 109)/л, в лейкограмме процент лимфоцитов — 70; процент розеткообразующих Т-лимфоцитов-52 а значит, абсолютное содержание Т-лимфоцитов у животных будет равно 3.1668 109 или 3.2 109 /л. Для подсчета клеток в камере Горяева осадок клеток в извлеченных из холодильника пробирках осторожно ресуспендируют пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл 0,01%-ного раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2—3 мин заполняют камеру Горяева и определяют процент Е-РОК путем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет процедуру подсчета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розонатыми эритроцитами.
Определение активных Т-лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана (ЕА-РОК). Все подготовительные; операции выполняют так, как это описано для Е-РОК, за исключением сыворотки которую при определении ЕА-РОК не добавляют в инкубационную среду и длительной холодильной инкубации. После термостатирования 10 мин при 37С и последующего центрифугирования при 1000 об/мин (для ПЛК-1) в течение 5 мин проводят подсчет активных лимфоцитов способом, описанным выше для общих Т-клеток. Кроме определения численности Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций важно значение необходимо придавать хелперно-супрессорному отношению. Определение соотношения лимфоцитов с хелперной и супрессерной функциями проводят в теофиллиновом тесте. Принцип метода состоит в том, что в присутствии теофиллина Т-лимфоциты с супрессорной функцией теряют способность к Е-розеткообразовапию.
