Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время пектолитические ферментные препараты находят все более широкую сферу применения в различных отраслях промышленности , в сельском хозяйстве, в науке и медицине. Полигалактуроназа (К.Ф.3.2.І.15, поли(1,4-<х-D-галактуронид) - гликаногидролаза ), катализирующая гидролиз 1,4-ч-В-галактозидуронидных связей з галактуро-канах, продуцируется многими микроорганизмами .
В данный момент большинство пектолитических ферментных препаратов, выпускаемых как в России, так и зарубе-жом имеют грибное и реже бактериальное происхождение. При необходимости целенаправленного использования пектиназ, эти препараты вызывают ряд трудностей из-за того, что они содержат, помимо полигалактуроназы, пектинэстеразу, протеиназы, целлюлазы, гемицеллголазы и ряд других сопутствуюгщгх ферментов. Все отрасли, применяющие пектолитическне ферментные препараты, особенно при производстве соков и вин постоянно предъявляют повышенные требования к чистоте и составу используемых ферментных препаратов.' Именно эти требования создали необходимость разработать новый ферментный препарат полигалактуроназы зысокой степени чистоты, не содержащий пектинэстеразы т.к. присутствие этого фермента в препаратах неизбежно приводит к образованию в реакционной среде метилового спирта, что недопустимо в виноделии и особенно при производстве соков. Однако, выделение полигалактуроназы из сложного комплекса белков, содержащихся в технических препаратах, требует проведение трудоемкой, многоступенчатой очистки вплоть до использования хроматографических методов разделения и очистки. Использование такой многоступенчатой очистки приводит к резкому удорожанию препаратов и невозможности их промышленного производства и применения, т.к. это экономически не выгодно.
Известно, что количество синтезируемых гидролитических ферментов у дрожжевых культур значительно меньше,
чем у грибных культур и бактерий. Но в тоже время известно, что отличительной особенностью некоторых штаммов дрожжей рода Kluyveromyces является то, что они активно образуют пек-тиназы, содержание которых может достигать 80-90% от всей суммы белков клетки. Так установлено, что белок, обладающий эвдо-полигалактуроназной активностью составляет около 90% от общей суммы белков, секретируемых дрожжами в культураль-ную жидкость. Однако до настоящего времени, несмотря на очевидную перспективность применения, дрожжевые пектолитичес-кие ферменты изучены менее пектиназ других микроорганизмов. Поэтому представляется интересным, важным и актуальным исследование дрожжей с позиции поиска среди них продуцентов ферментов, предназначенных для соковой и винодельческой промышленности.
Цель и задачи работы. Целью работы являлся поиск активного продуцента полигалактуроназы среди дрожжевых культур, разработка условий его культивирования и последующего применения полученного ферментного препарата.
В соотвествии с этим необходимо было решить следующие задачи:
_ выделить активный продуцент полигалактуроназы среди дрожжей;
_ исследовать и оптимизировать условия биосинтеза
полигалактуроназы; -
_ исследовать влияние состава питательной среды на биосинтез полигалактуроназы, и провести оптимизацию состава питательной среды;
_ изучить свойства полученного препарата полигалактуроназы;
_ провести апробацию препарата дрожжевой полигалактуроназы в соковой и винодельческой промышленности.'
Научная новизна. Основываясь на данных литературы, было отобрано 27 дрожжевых культур, возможных продуцентов поли-
галактуроназы и не синтезирующих пектинэстеразы. При скрининге этих культур была выделена культура, обладающая способностью к сверхсинтезу внеклеточной полигалактуроназы без сопутствующей пектинэстеразы _ это штамм Zygofabospora marxiana ВКМ У-848.
Разработаны условия культивирования, обеспечивающие максимальный выход фермента. Установлена оптимальная питательная среда для глубшюго культивирования" этого микроорганизма. Получен ферментный препарат полигалактуроназы и впервые осуществлена апробация данного дрожжевого поли-галактуроназного препарата в производстве соков и вин.
Показана возможность создания мультиэнзимвой композиции (МЭК) на основе изучаемого фермента.
Практическая ценность. Проведенные исследования послужили основой для разработки технологии нового препарата дрожжевой полигалактуроназы.
В качестве основного компонента питательной среды для биосинтеза пслнгалактуроназы использована молочная сыворотка _ это очень.важно, т.к. создаются селективные условия для получения нового ферментного препарата с одновременным рациональным использованием трудно утилизируемого вторичного сырья молочной промышленности. Разработаны также условия получения и использования гидролизата крахмала, сравнительно дешевого компонента среды, который в тоже время позволяет значительно повысить биосинтез полигалактуроназы микроорганизмом. ,
Дроясжевой ферментный препарат был проверен в условиях опытно-производственной базы Института винограда и вина "Магарач". Испытания показали, что он не уступает по своим свойствам препарату пектиназы "Пектофоетидин ШОх", который в данный момент применяется в производстве соков и вин, а даже его превосходит, т.к. в нем отсутствует пектинзсгераза, что позволяет исключить. накопление в соках и винах метилового спирта.
Апробация работы и публикация. Работа дважды заслушивались. на межкафедральном коллоквиуме МГАПП (1993; 1994г.).
По теме диссертации опубликованы три статьи.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы , методической и экспериментальной частей, выводов, списка использованной литературы и приложений.
Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста, содержит 34 таблиц, 11 рисунков и 3 приложения. Список литературы включает 235 наименований отечественных и зарубежных авторов.
