Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1 .Технологии жидких дрожжей 12
1.1.1. Технологии приготовления жидких дрожжей на хлебопекарных предприятиях 12
1.1.2. Способы улучшения биотехнологических свойств жидких дрожжей 20
1.1.2.1. Применение высокоактивных штаммов дрожжей и молочнокислых бактерий 20
1.1.2.2. Улучшение составов питательных сред для выращивания дрожжей и молочнокислых бактерий 21
1.1.3. Способы повышения микробиологической чистоты жидких дрожжей 29
1.1.3.1. Применение неорганических и органических кислот для повышения микробиологической чистоты питательных сред 29
1.1.3.2. Применение хмелепродуктов 30
1.2.Методы регулирования процессов созревания полуфабрикатов в условиях работы хлебопекарных предприятий с перерывами 49
1.3.Применение жидких дрожжей при производстве хлеба 50
1.4. Использование пропионовокислых бактерий в хлебопечении 51
Заключение по обзору литературы 55
2. Экспериментальная часть 57
2.1. Сырье и материалы, применявшиеся при проведении исследований 57
2.2.Методы исследований, применявшиеся в работе 58
2.2.1. Методы исследования свойств сырья 58
2.2.2. Методы культивирования чистых культур хлебопекарных штаммов дрожжей, молочнокислых, пропионовокислых, спорообразующих бактерий и способы приготовления жидких дрожжей и пропионовокислой закваски 59
2.2.3. Методы исследования чистых культур микроорганизмов, жидких дрожжей и пропионовокислой закваски 62
2.2.4. Способы приготовления теста и хлеба 64
2.2.5. Методы оценки качества готовых изделий
2.2.6. Методы математической обработки результатов исследований 67
2.3.Характеристика сырья, применявшегося в исследованиях 67
2.4.Результаты исследований и их анализ 71
2.4.1. Разработка дифференциальной технологии приготовления жидких дрожжей 72
2.4.1.1. Оптимизация составов питательных сред и разработка режимов приготовления жидких дрожжей 72
2.4.1.2. Разработка режимов приготовления заквашенной заварки 87
2.4.1.3. Разработка математической модели процесса приготовления жидких дрожжей 89
2.4.1.4. Исследование влияния жидких дрожжей, приготовленных по дифференциальной технологии, на качество пшеничного хлеба 100
Заключение по разделу 2.4.1 105
2.4.2. Разработка технологии приготовления жидких дрожжей с пропионовокислыми бактериями (ПКБ) 107
2.4.2.1. Исследование влияния пропионовокислых бактерий на дрожжи S. cerevisiae 107
2.4.2.2. Исследование влияния пропионовокислых бактерий на спорообразующие бактерии Bacillus subtilis и В. cereus 112
2.4.2.3. Оптимизация состава питательной среды для выращивания пропионовокислых бактерий 115
2.4.2.4. Оптимизация состава питательной среды и разработка режима приготовления жидких дрожжей с пропионовокислыми бактериями 120
2.4.2.5. Исследование влияния жидких дрожжей с пропионовокислыми бактериями на качество пшеничного хлеба 121
Заключение по разделу 2.4.2 129
2.4.3. Разработка технологии приготовления жидких дрожжей с хмелем для хлебопекарных предприятий малой мощности (пекарен) 125
2.4.3.1. Отбор хмелеустойчивых штаммов дрожжей S. cerevisiae 125
2.4.3.2. Оптимизация состава питательной среды — дозировки хмеля и разработка режимов приготовления жидких дрожжей с хмелем 126
2.4.3.3. Исследование влияния жидких дрожжей с хмелем на качество пшеничного хлеба 130
Заключение по разделу 2.4.3 132
2.4.4. Промышленная апробация и внедрение основных результатов исследований 133
2.4.5. Расчет экономического эффекта от внедрения разработанных технологий жидких дрожжей 134
3. Выводы 144
Список использованной литературы 148
Приложения 168
- Улучшение составов питательных сред для выращивания дрожжей и молочнокислых бактерий
- Использование пропионовокислых бактерий в хлебопечении
- Оптимизация составов питательных сред и разработка режимов приготовления жидких дрожжей
- Оптимизация состава питательной среды для выращивания пропионовокислых бактерий
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ. В начале XX века в крупных городах России - Петербурге, Москве, Киеве, Екатеринбурге и других промышленных центрах функционировали кустарные пекарни малой мощности с трудоемкими процессами хлебопекарного производства. В 20-х гг. в связи с форсированием индустриализации страны и созданием новых отраслей промышленности (машиностроения, авиастроения и др.) Правительство СССР приняло решение о создании хлебопекарной промышленности. Была поставлена задача о бесперебойном обеспечении населения страны хлебобулочными изделиями промышленного производства и механизации предприятий. Для выполнения государственной программы первый министр хлебопекарной промышленности, талантливый организатор, В.П. Зотов привлек отечественных инженеров и ученых. В 1929 г. в Москве построен первый механизированный хлебозавод по проекту инженера Г.П. Марсакова. Отечественными учеными была разработана уникальная технология, обеспечивающая на хлебопекарных предприятиях производство хлеба высокого качества: профессор А.И. Островский разработал рациональную схему производства жидких дрожжей для хлебозаводов, работающих при круглосуточном непрерывном технологическом процессе [100].
Жидкие дрожжи являются начальной стадией технологического процесса, их готовят из натурального сырья - муки на хлебопекарных предприятиях и применяют в качестве биологического разрыхлителя при производстве хлеба из пшеничной, смеси пшеничной и ржаной муки. Жидкие дрожжи в технологии хлебопечения обеспечивают высокую пищевую ценность хлебобулочных изделий, обогащая их биологически активными и пребиотическими компонентами, синтезируемыми молочнокислыми бактериями Lactobacillus delbrueckii и дрожжами Saccharomyces cerevisiae [39]. Хлеб, выпеченный на жидких дрожжах, содержит незаменимые
аминокислоты, витамины, молочную кислоту, способствующие повышению иммунитета и улучшению микрофлоры организма, в котором не развиваются болезнетворные микроорганизмы и инфекционные желудочно-кишечные заболевания [147]. Хлеб на жидких дрожжах приобретает приятный вкус и аромат, длительное время сохраняет свежесть. При переработке муки с пониженными хлебопекарными свойствами жидкие дрожжи стабилизируют технологический процесс, ингибируют развитие «картофельной палочки», содержащейся в муке, и предотвращают картофельную болезнь хлеба. Применение жидких дрожжей в производстве формовых сортов хлеба из пшеничной муки позволяет значительно сократить расход прессованных дрожжей, в результате улучшаются техноэкономические показатели хлебопекарных предприятий [143].
Большой вклад в совершенствование процесса приготовления жидких дрожжей и их внедрение на хлебопекарных предприятиях внесли ученые: В.А. Николаев, М.И. Ратнер, М.П. Плотников, А.Я. Пумпянский, Э.С. Канель, Р.С. Баширова, Н.В. Запенина, Г.М. Смирнова, В.И. Калинина, Л.Я. Ауэрман, Л.И. Пучкова, Р.Д. Поландова, Т.Г. Богатырева, Л.П. Пащенко и другие [8, 59, 86, 93, 118, 119, 117, 127].
В современных экономических условиях хлебопекарные предприятия в основном работают в одно-, двухсменном режиме с перерывами до 8-16 ч, при этом проблемой является сохранение биотехнологических свойств жидких дрожжей [83]. В настоящее время жидкие дрожжи применяют на отдельных хлебозаводах большой мощности, работающих без перерывов в технологическом процессе. Анализ производственной деятельности хлебопекарных предприятий показал отсутствие научно обоснованной технологии, обеспечивающей микробиологическую чистоту и сохранение биотехнологических свойств жидких дрожжей в условиях работы хлебопекарных предприятий с перерывами.
В связи с этим актуальной задачей является разработка технологий приготовления жидких дрожжей для дискретной работы хлебопекарных
предприятий и обеспечения стабильности технологического процесса, производства хлебобулочных изделий повышенной пищевой ценности и микробиологической чистоты; создание технологий, позволяющих оперативно перестраивать организацию производства для более эффективного использования основного и вспомогательного сырья, технологического оборудования, трудовых и материальных ресурсов; что обеспечит снижение себестоимости продукции и улучшит техноэкономические показатели хлебопекарных предприятий, особенно малой мощности.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью настоящих исследований является разработка технологий производства жидких дрожжей и их применения в технологическом процессе приготовления хлебобулочных изделий в условиях работы хлебопекарных предприятий с перерывами до 8-16 ч.
Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:
1. Разработать дифференциальную технологию приготовления жидких
дрожжей с увеличенной продолжительностью их выращивания (до 16ч):
- провести оптимизацию составов питательных сред и разработать
режимы приготовления жидких дрожжей в зависимости от
продолжительности их выращивания;
- разработать математическую модель процесса приготовления жидких
дрожжей.
2. Разработать технологию приготовления жидких дрожжей с
пропионовокислыми бактериями (ПКБ) для повышения микробиологической
чистоты хлебобулочных изделий:
- исследовать взаимодействия ПКБ Propionibacterium freudenreichii,
дрожжей S. cerevisiae и спорообразующих бактерий рода Bacillus;
- разработать способ культивирования ПКБ в мучной среде;
- оптимизировать состав питательной среды и разработать режим
приготовления жидких дрожжей с ПКБ.
3. Разработать технологию приготовления жидких дрожжей с хмелем
для повышения пищевой ценности и микробиологической чистоты
хлебобулочных изделий, вырабатываемых на хлебопекарных предприятиях
малой мощности:
исследовать влияние хмеля на ферментативную активность дрожжей и селекционировать хмелеустойчивые штаммы;
оптимизировать состав питательной среды и разработать режимы приготовления жидких дрожжей с хмелем в зависимости от продолжительности выращивания.
4. Исследовать влияние жидких дрожжей с различной
продолжительностью выращивания на качество и микробиологическую
безопасность хлебобулочных изделий.
5. Разработать документацию по приготовлению и применению
жидких дрожжей в условиях дискретной работы хлебопекарных
предприятий.
6. Промышленная апробация и внедрение результатов исследований.
Структурная схема исследований приведена на рис. 1.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Научно обоснованы и разработаны
технологии приготовления жидких дрожжей и хлебобулочных изделий в условиях дискретной работы хлебопекарных предприятий.
Оптимизированы составы мучных питательных сред (в том числе с применением хмеля и пропионовокислых бактерий), стабилизирующие биотехнологические свойства жидких дрожжей в условиях одно- и двухсменной работы хлебозаводов, сформулированы принципы культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий (МКБ) L. delbrueckii при различной продолжительности их выращивания.
Разработана математическая модель технологического процесса приготовления жидких дрожжей, описывающая совокупность микробиологических и биохимических процессов при различной продолжительности их выращивания.
Исследовано совместное культивирование в мучных средах дрожжей, пропионовокислых, молочнокислых бактерий L. delbrueckii. Выявлено ингибирующее влияние пропионовокислых бактерий на спорообразующие бактерии рода Bacillus во взаимосвязи с составом питательных сред для выращивания ПКБ. Показан наибольший прирост биомассы ПКБ на мучной заварке, заквашенной L. delbrueckii, используемой для приготовления жидких дрожжей.
Проведены исследования по селекции высокопродуктивных штаммов чистых культур хмелеустойчивых дрожжей и выявлено повышение ферментативной активности дрожжей при их выращивании на мучной осахаренной заварке с хмелем в оптимальных условиях.
Исследованиями хлебобулочных изделий, приготовленных на жидких дрожжах по разработанным технологиям, подтвержден эффект улучшения качества хлеба и повышения его пищевой ценности и микробиологической чистоты.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Разработаны и научно обоснованы дифференциальная технология приготовления жидких дрожжей с увеличением продолжительности их выращивания (до 16 ч) в условиях дискретного производства (патент № 2326937 от 15.11.2006); технология приготовления жидких дрожжей с пропионовокислыми бактериями для повышения микробиологической безопасности хлебобулочных изделий при хранении (положительное решение по заявке на изобретение № 2008146213 от 25.11.2008); технология приготовления жидких дрожжей с хмелепродуктами для обеспечения микробиологической чистоты хлебобулочных изделий на предприятиях малой мощности.
На основе разработанных принципов культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий L. delbrueckii разработана методика расчета потребности жидких дрожжей для хлебопекарных предприятий и прикладная программа для управления процессом приготовления жидких дрожжей в различных условиях производства при изменении ассортимента и объема
вырабатываемой продукции, продолжительности смены, типов и суточной мощности технологического оборудования (печей).
На основании результатов исследований разработана и утверждена «Технологическая инструкция по приготовлению и применению жидких дрожжей в условиях дискретной работы хлебопекарных предприятий» («Сборник современных технологий хлебобулочных изделий», 2008 г.).
Определен ожидаемый экономический эффект по отрасли хлебопечения, который составит 155 млн. руб. (от 30 до 450 тыс. руб. на одно предприятие) в результате снижения себестоимости продукции: эффективного использования основного и вспомогательного сырья (за счет замены прессованных дрожжей жидкими), технологического оборудования (снижения расхода топлива, электроэнергии), сокращения технологических (усушка) и производственных (возвратов хлебобулочных изделий) потерь и работы хлебопекарных предприятий в одно- или двухсменном режиме.
Технологии приготовления жидких дрожжей в условиях дискретного производства хлеба апробированы и внедрены на хлебопекарных предприятиях, в том числе в ОАО «Хлебозавод №9», г. Москва, ОАО «Хлебозавод №2», г. Ижевск, ОАО «Хлебозавод», г. Брянск и др.
Результаты научных исследований и внедрения включены в учебные программы повышения квалификации специалистов хлебопекарной промышленности при Российском Союзе пекарей (РСП) и Международной промышленной академии.
Работа проводилась в соответствии с научно-технической программой
Россельхозакадемии (РАСХН): «Разработать современные
ресурсосберегающие методы и технологии высокоэффективной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных продуктов адекватного питания» в рамках Концепции Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на III Международной конференции «Современное хлебопечение-2003» (МПА, Москва, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов» (РАСХН, Углич, 2004), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов» (МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2004), Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы (МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2005), II Международной конференции «Индустрия пищевых ингредиентов XXI века» (МПА, Москва, 2007), Международном научно-практическом симпозиуме «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях» (ВНИИПБТ, Москва, 2008), региональном научно-практическом семинаре «Микробиологические аспекты хлебопекарного и кондитерского производств» (ОАО «Хлеб», Тверь, 2008), Всероссийской конференции «Научно-практические аспекты экологизации продуктов питания» (РАСН, Углич, 2008), X Межрегиональной научно-практической конференции «Современное хлебопекарное производство: перспективы развития» (Уральский государственный экономический университет, Екатеринбург, 2009 г.); XII Всероссийской научно-технической конференции «Новые информационные технологии» (МГУ приборостроения и информатики, Москва. 2009), Конференции X юбилейного международного форума «Высокие технологии XXI века» (ЦВК «Экспоцентр», Москва, 2009), Ученом Совете ГНУ ГОСНИИХП Россельхозакадемии (Москва, 2003-2009), научно-практических семинарах Российского Союза Пекарей (Москва, 2003-2009).
Улучшение составов питательных сред для выращивания дрожжей и молочнокислых бактерий
В условиях интенсификации производства хлеба, работы предприятий в экологически неблагоприятных условиях, в том числе в регионах с жарким климатом, повысились требования к биотехнологическим свойствам жидких дрожжей, вырабатываемых на хлебозаводах по рациональной схеме. Жидкие дрожжи должны иметь высокую бродильную активность и содержать большое количество дрожжевых клеток.
В результате многочисленных исследований разработаны способы улучшения составов питательных сред для выращивания дрожжей [2, 3, 19, 26, 35, 44, 59, 74, 92, 109, 117, 120, 124, 132, 157] и термофильных молочнокислых бактерий [4, 84, 85].
Установлено [120], что углеводный состав жидких дрожжей зависит от свойств используемого сырья - сорта муки, состояния ее углеводно-амилазного комплекса (наличия собственных Сахаров, содержания и активности амилолитических ферментов, состояния крахмальных зерен), свойств применяемого осахаривающего агента - неферментированного солода либо ферментных препаратов (ФП) и условий осахаривания (температура, продолжительность, рН). Нельзя исключить также влияние свойств применяемых штаммов дрожжей S. cerevisiae и термофильных МКБ L. delbrueckii, обладающих различной амилолитический и протеолитической активностью [26].
В рациональной схеме приготовления жидких дрожжей для осахаривания мучной заварки используют неферментированный ячменный или ржаной солод в количестве 1-2% к массе муки (температура осахаривания 63-65 С, продолжительность - 2 ч), либо ФП а-амилазы и/или глюкоамилазы в количестве 0,007-0,01% при амилолитической активности 1500-2000 ед./г; температура осахаривания 50-55 С, продолжительность -2ч [118, 119], под действием которых из крахмала образуются мальтоза, глюкоза и декстрины различной молекулярной массы.
Исследованиями определен углеводный состав жидких дрожжей с использованием солода и ФП [120].
Выявлено, что предпочтительное сбраживание дрожжами того или иного сахара зависит от его содержания в питательной среде. В питательных средах с преобладанием содержания мальтозы (самоосахаренная заварка, осахаренная солодом или ФП а- и (3-амилазы) количество моно- и дисахаридов уменьшалось к концу брожения за счет ее утилизации с 27,0% до 18,6-19,8% на сухие вещества (СВ); расход - около 7,0% на СВ. В обогащенной глюкозой среде (осахаривание заварки ФП глюкоамилазы) расход углеводов был более интенсивным; при этом утилизовалась главным образом глюкоза и ее количество в среде уменьшалось к концу брожения с 23% до 1,8% на СВ; расход - около 20,0% на СВ. В жидких дрожжах, приготовленных с одновременным внесением ФП а-амилазы и глюкоамилазы, дрожжи активно сбраживали как мальтозу (уменьшение ее содержания - с 20,0% до 4,4% на СВ; расход около 15,0% на СВ), так и глюкозу (с 9,7% до 1,0% на СВ; расход около 8,0% на СВ; общий расход мальтозы и глюкозы - 23,0% на СВ). Преобладающим компонентом редуцирующих веществ в готовых дрожжах являлась мальтоза.
Таким образом, проведенные исследования показали, что на изменение в процессе приготовления жидких дрожжей состава и содержания редуцирующих Сахаров оказывал существенное влияние тип амилолитических ферментов. В свою очередь, состав сбраживаемых Сахаров и их количества в питательной среде влияли на процесс утилизации их дрожжами. В средах с преимущественным содержанием мальтозы дрожжи адаптировались к ее сбраживанию. Дрожжи, приготовленные на питательной среде с повышенным содержанием глюкозы, были адаптированы к ее потреблению. Накопление в питательной среде в значительных количествах одновременно глюкозы и мальтозы приводило к сбраживанию дрожжами этих Сахаров примерно с одинаковой интенсивностью.
Изучение качественного и количественного соотношения моно- и дисахаридов методом газожидкостной хроматографии показало, что на всех этапах приготовления жидких дрожжей качественный состав моно- и дисахаридов независимо от осахаривающих агентов был идентичен и представлен мальтозой, глюкозой, фруктозой, сахарозой, мальтотриозой, арабинозой, ксилозой. Наибольшее содержание моно- и дисахаридов наблюдалось в конце стадии заквашивания заварки, причем основными сахарами, образующимися в заквашенной заварке, были глюкоза и мальтоза.
Состав моно- и дисахаридов обусловливал биохимические и технологические свойства жидких дрожжей. При наличии в питательной среде от 4,0% до 23,0% на СВ глюкозы дрожжи активно ассимилировали глюкозу и мальтозу и в результате обладали более высокой бродильной активностью и накоплением большого количества биомассы. Дрожжи, приготовленные на самоосахаренной заварке и с солодом (содержание глюкозы 0,9-2,1% на СВ), слабо ассимилировали сахара, количество дрожжевых клеток было меньше, подъемная сила хуже. Таким образом, дрожжи энергично размножаются и обладают высокой бродильной активностью в глюкозосодержащей заквашенной заварке, что достигается применением для осахаривания мучной заварки ферментного препарата Глюкоамилазы.
Развитие и размножение дрожжей связано также с синтезом белков -наиболее важных компонентов клетки [13, 35, 59, 81, 115, 125, 138, 139, 140, 142, 144, 149, 152]. Белки составляют основу структурного материала клетки. Этим определяется потребность дрожжевых клеток в азотсодержащих соединениях, которая достигается обогащением заварки белоксодержащими компонентами - соевой мукой, инактивированной дрожжевой биомассой и др.
Изучен аминокислотный состав жидких дрожжей [120]. На стадиях осахаривания мучной заварки содержание аспарагиновой кислоты, треонина, серина, аспарагина и глутамина снижается. Содержание остальных аминокислот остается на том же уровне, что в начале осахаривания или слегка повышается. В конце заквашивания заварки происходит значительное увеличение содержания всех аминокислот. За время брожения дрожжи, приготовленные на самоосахаренной заквашенной заварке, полностью утилизируют аспарагиновую кислоту, пролин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, содержание оставшихся аминокислот значительно снижается.
В жидких дрожжах, приготовленных с ФП Амилоризином П10Х и Глюкоаваморином Г10Х, хорошо усваиваются аминокислоты лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, треонин, серии, аспарагин, глутамин, глутаминовая кислота, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин. В меньшей степени дрожжами усваиваются глицин, аланин и пролин.
Использование пропионовокислых бактерий в хлебопечении
Использование пропионовокислых бактерий (ПКБ) в пищевых технологиях основано на том, что ПКБ являются активными продуцентами пропионовой кислоты и других антимикробных факторов: уксусной, муравьиной, янтарной кислот, диацетила, антимикробных белков -бактериоцинов (пропионицинов), а также витаминов - Ві2 фолиевой кислоты и др., нуклеотидов, незаменимых аминокислот, ферментов, бифидогенного фактора и др. [32, 163, 164, 165, 166, 168, 175, 177, 178].
В хлебопекарной и других отраслях пищевой промышленности часто используют пропионовую кислоту (метилуксусную) Е280 и пропионаты химического происхождения (в том числе получаемые из нефтепродуктов) -пропионат натрия Е281, пропионат кальция Е282, пропионат калия Е283 в качестве пищевых добавок, предотвращающих микробную порчу продукта -консервантов [25, 30, 39]. Пропионовая кислота относится к группе жирных кислот, участвующих в цикле Кребса, и метаболизируется до пировиноградной кислоты. Соли пропионовой кислоты обнаруживаются в забродивших продуктах питания, составе пота человека. Они не оказывает на организм человека выраженного отрицательного действия. Так, при потреблении пропионата натрия в дозировке 6 г в день отрицательных явлений у мужчин не наблюдалось, кроме выраженной щелочной реакции мочи. Для животных пропионовая кислота более токсична. Например, для крыс ЛД5о её составляет 2600 мг/кг массы тела; кроме того, пропионат натрия повышал содержание сахара в сыворотке крови крыс. Имеются сообщения об ингибировании пропионатами активности каталазы [30].
Пропионовую кислоту и пропионаты в качестве консервантов применяют не во всех странах. Например, в США её добавляют к хлебобулочным и кондитерским изделиям для предупреждения плесневения, в ряде европейских стран к муке. В странах ЕС, кроме Германии, также разрешено применение пропионатов в пищевой промышленности.
В России пропионовая кислота и пропионаты, согласно действующим документам СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» [133] и СанПиН 2.3.2.1293-03 «Гигиенические требования по применению пищевых добавок» [134], признаны пищевыми добавками, не оказывающими вредного влияния на здоровье человека. Комитет ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам не установил для этих соединений величину допустимого суточного потребления (29), однако СанПиН 2.3.2.1293-03 регламентирует дозировку пропионовой кислоты и пропионатов по отдельности или в комбинации в пересчете на пропионовую кислоту. Для хлеба пшеничного нарезанного расфасованного и хлеба ржаного для длительного хранения количество пропионатов не должно превышать 3 г/кг; для хлеба с пониженной энергетической ценностью, сдобной выпечки и мучных кондитерских изделий, питы - 2 г/кг; для хлеба пшеничного расфасованного для длительного хранения, кулича пасхального и рождественского - 1 г/кг [134].
Однако для пищевых технологий важны вещества именно биологического происхождения (чистые, метаболизируемые или биодеградабельные в животном организме оптические изомеры). Это, прежде всего, экзометаболиты «пищевых» микроорганизмов, не образующих токсины для человека и животных и обладающие (желательно) пробиотическими свойствами. К таким микроорганизмам относятся ПКБ.
Преимущества микробиологической защиты хлеба очевидны: отсутствие вредных химических примесей, возможность введения кислот (солей) как антимикробных агентов вместе с клетками (обычно пробиотиками), обогащение хлеба нутрицевтиками. Заквасочный способ имеет дополнительные преимущества: экономичность, т. е. приготовление заквасок из сырья, вносимого в тесто при замесе (муки), отсутствие дополнительных затрат на создание отдельного, специально оборудованного производства с участием высококвалифицированного обслуживающего персонала.
Установлено, что экзометаболиты ПКБ подавляют рост бацилл разных видов [33, 34, 91, 106, 107, 108, 173], что обусловливает возможность применения пропионовокислых бактерий в хлебопечении с целью предотвращения развития картофельной болезни хлеба, вызываемой споровыми бактериями рода Bacillus - В. subtilis, В. cereus и др.
В литературных данных не обнаружено сведений о положительном влиянии ПКБ на грибы, но показано, что химически чистые пропионаты, подавляющие рост большинства мицелиальных грибов, оказывают положительное влияние на рост Penicillium roqueforti [176]. Единственными химически идентифицированными метаболитами ПКБ, которые стимулируют рост других микроорганизмов (некоторых видов р. Bifidobacterium), являются вещества хинольной природы - 2-амино-З-карбокси-1,4-нафтохинон и 1,4-дигидроокси-2-нафтоловая кислота [167]. Однако известно, что P. shermanii образует широкий спектр нутрицевтиков, т.е. неметаболизируемых (недеградабельных) веществ, полезных для человека и животных, и, вероятно, для других организмов [164, 165, 168].
Экзометаболиты антимикробного действия, образуемые ПКБ, воздействуют не только на посторонние микроорганизмы, но и на S. cerevisiae. Существующие в литературе сведения противоречивы, однако из них следует, что отрицательное влияние на дрожжи выражено слабее, чем эффект, оказываемый ГЖБ на бактерии и плесневые грибы [109, 167, 169, 170, 171, 172]. Кроме того, они способны также стимулировать рост некоторых микроорганизмов, например бифидобактерий [177].
Ранее показано, что культуральная жидкость P. freudenreichii стимулирует рост исследованных штаммов дрожжей S. cerevisiae. При совместном культивировании хлебопекарных дрожжей и ГЖБ повышается устойчивость дрожжей к посторонней микробиоте, в т. ч. развитию споровых бактерий - возбудителей картофельной болезни хлеба, стабилизируется их бродильная активность в процессе тестоприготовления и улучшается качество хлеба.
ПКБ и препараты на их основе оказывают влияние на качество хлеба, в т.ч. органолептические показатели - вкус, запах, цвет корки. Отдельная проблема состоит в возможности культуры ПКБ развиваться в мучной среде, от чего зависит эффективность их действия.
Использование ПКБ для защиты хлеба от картофельной болезни и плесневения впервые предложено П. Пельсхенке [174]. При содержании в тесте с ПКБ 0,25% пропионовой кислоты обеспечивалось предотвращение микробиологической порчи пшеничного хлеба.
Оптимизация составов питательных сред и разработка режимов приготовления жидких дрожжей
Анализ литературных данных показал, что биотехнологические свойства жидких дрожжей зависят от составов питательных сред (содержания легко усваиваемых углеводов, азотистых, минеральных веществ), режимов приготовления дрожжей.
В соответствии с данными анализа химического состава мучной осахаренной, заквашенной заварки и жидких дрожжей и питательными потребностями дрожжей проведены исследования влияния биохимического состава питательных сред и начальных концентраций дрожжевых клеток на биотехнологические свойства жидких дрожжей, качество и микробиологическую чистоту хлебобулочных изделий; исследован модельный процесс второй стадии приготовления жидких дрожжей (выращивания дрожжей на заквашенной заварке), описывающий совокупность микробиологических и биохимических процессов.
Жидкие дрожжи готовили на мучной осахаренной, заквашенной заварке и на смеси равных количеств осахаренной и заквашенной заварки. Продолжительность выращивания дрожжей варьировали от 4 до 16 ч.
В технологии жидких дрожжей с улучшенными биотехнологическими свойствами для осахаривания мучной заварки применяют ферментные препараты (ФП) глюкоамилазы в количестве 100 ед. ГлС (глюкоамилазной активности)/100 г муки и а-амилазы (в различных дозировках) [120].
Для накопления в мучной заварке глюкозы и других редуцирующих Сахаров использовали ФП альфа- и глюкоамилазы в разных дозировках: Глюкоамилазу очищенную AMG 800 BG с активностью 14500 ед. ГлС/г,
Фунгамил SG 2500 с активностью 12700 ед. АС/г. Дозировки ФП рассчитывали таким образом, чтобы их количество соответствовало от 30 до 580 ед. активности на 100 г муки. Для исследований применяли муку пшеничную II сорта. Мучную заварку готовили при соотношении муки и воды -1:3. ФП вносили после остывания заварки до температуры 50-55 С, осахаривание проводили при температуре 50-55 С в течение 1,5 ч. Количество образовавшейся глюкозы определяли глюкооксидазным методом, редуцирующие вещества (РВ) - перманганатным методом - по Бертрану (таблица 11). Из исследованных ФП наилучшей композицией для накопления глюкозы и редуцирующих веществ является сочетание Фунгамила SG 2500 в количестве 65 ед. АС/100 г муки и Глюкоамилазы очищенной AMG 800 BG в количестве 100 ед. ГлС/100 г муки. Содержание редуцирующих веществ в мучной заварке составляет 23,7% на СВ; глюкозы - 3,2% на СВ (таблица 11).
На основе мучной заварки, осахаренной ФП в указанных дозировках (ОЗ), готовили заквашенную заварку (33) и смесь осахаренной и заквашенной заварки. Полученные питательные среды для жидких дрожжей и жидкие дрожжи (ЖД) были исследованы на содержание редуцирующих веществ (РВ), аминного азота (АА) и по показателям качества (таблица 12). Установлено, что применение питательных сред, содержащих редуцирующие вещества - 31,6-39,7 % на СВ, аминный азот - 152,6-253,4 мг% на СВ, обеспечивает хорошие биотехнологические свойства жидких дрожжей (при продолжительности выращивания 4 ч и соотношении ЖД и питательной среды 1 : 1); при этом количество клеток дрожжей составляет 135-150 млн/г; удельная скорость размножения — 0,21-0,23 ч" ; подъемная сила 15-17 мин; бродильная активность 18,5-19,0 см ССЬ; кислотность 8,5-10,5 град. Расход редуцирующих веществ составляет 25,2-28,8 % на СВ, аминного азота - 25,7-84,1 мг% на СВ. При увеличении продолжительности выращивания дрожжей до 6-10 ч (соотношение ЖД и питательной среды -1:1) содержание Сахаров и аминного азота снижается, бродильная активность и подъемная сила жидких дрожжей ухудшаются (таблица 13). Экспериментальные (1, 2, 3) и расчетные (4, 5, 6) данные количества дрожжевых клеток на заквашенной заварке при соотношении ЖД и питательной среды (33) I : I (1,4), 1 : 2 (2, 5), 1 : 3 (3, 6). Согласно данным исследований, приведенных С.А. Коноваловым [81, 82], в течение 12-15 ч на полноценной питательной среде культура клеток дрожжей растет в геометрической прогрессии, удваиваясь за каждый отрезок времени, так как вновь образующиеся клетки в свою очередь включаются в общий процесс роста. В связи с этим проведено количественное определение времени биохимического цикла, лимитирующего деление, - периода удвоения дрожжевых клеток на заквашенной заварке (таблица 14, рисунок 4) для установления начальных концентраций дрожжевых клеток (соотношений ЖД и питательной среды) при увеличении продолжительности выращивания. Установлено, что при различных начальных концентрациях клеток дрожжей период их удвоения составляет не менее 3-х ч (рисунок 4). Для разработки режимов приготовления жидких дрожжей с учетом производственных условий период удвоения дрожжевых клеток принят равным 4 ч. На основании разработанной математической модели (раздел 2.4.1.3.) определены максимально возможные количества дрожжевых клеток Nmax при выращивании дрожжей на заквашенной заварке. Значения Nmax рассчитывали, исходя из уравнений (9, 11)
Оптимизация состава питательной среды для выращивания пропионовокислых бактерий
В последние годы на хлебопекарные предприятия поступает мука с повышенной микробиологической обсемененностью спорообразующими бактериями рода Bacillus, вызывающими картофельную болезнь хлеба. Результаты исследований и опыт работы промышленности показали, что применение жидких дрожжей является эффективным средством ингибирования картофельной болезни. Однако, в условиях жаркого климата, зонах экологического неблагополучия необходима технология жидких дрожжей с повышенными бактерицидными свойствами. Учитывая высокую антагонистическую активность пропионовокислых бактерий по отношению к спорообразующим бактериям рода Bacillus, с целью повышения бактерицидных свойств жидких дрожжей разработана технология жидких дрожжей с пропионовокислыми бактериями.
Для разработки данной технологии проведены исследования влияния ПКБ на дрожжи S. cerevisiae при их совместном культивировании; изучено действие ПКБ на споровые бактерии В. subtilis и В. cereus; исследован рост ПКБ на различных мучных средах, и разработана оптимальная питательная среда для культивирования ПКБ, предусматривающая предварительную ферментацию мучной осахаренной заварки термофильными МКБ L. delbrueckii; оптимизирована питательная среда для выращивания дрожжей с ПКБ и параметры приготовления теста для пшеничного хлеба.
Для исследования взаимодействия культур проведено совместное культивирование P. freudenreichii и S. cerevisiae на жидкой полусинтетической среде А; Концентрацию клеток S. cerevisiae в начале культивирования поддерживали постоянной; она составляла 3-Ю6 кл-мл"1 (5 об.%). Концентрацию клеток P. freudenreichii варьировали. Параллельно проводили раздельное выращивание культур. Выращивание в монокультуре показало, что активный рост S. cerevisiae начинается на 24 часа раньше, чем рост P. freudenreichii.
При совместном культивировании, если количество клеток P. freudenreichii в момент посева составляло 1,2-108 кл.-мл" - 10 об.% (соотношение клеток P. freudenreichii и S. cerevisiae в посевном материале -40 : 1), наблюдалось взаимное подавление роста культур (рисунок 14 а). Если количество клеток P. freudenreichii в начале культивирования уменьшали до 3,6-10 кл.-мл" - 3,0 об.% (соотношение клеток P. freudenreichii и S. cerevisiae в посевном материале -12:1), выход биомассы S. cerevisiae снижался на 30% по сравнению с монокультурой дрожжей. Несмотря на то, что Р freudenreichii росла медленнее, урожай её биомассы был тем же, что и в чистой культуре (рисунок 14 б). При дальнейшем уменьшении количества клеток в посевном материале рост культуры ПКБ существенно замедлялся (рисунок 14 в-г). Соотношение клеток P. freudenreichii и S. cerevisiae в посевном материале 6 : 1 и 0,8 : 1 (при внесении P. freudenreichii в количестве 1,8.10 и 2,3.10 кл.-мл"1 - 1,5 и 0,2 об.%) практически не влияло на рост дрожжей. Однако, если соотношение клеток P. freudenreichii и S. cerevisiae было 3 : 1 (количество ПКБ в начале роста смешанной культуры - 9-Ю6 кл-мл"1 - 0,75 об.%), происходило ускорение роста S. cerevisiae (рисунок 14 г).
Таким образом, влияние P. freudenreichii на рост S. cerevisiae при совместном культивировании на жидкой среде может быть отрицательным, нейтральным или положительным, что зависит от соотношения количества клеток в инокуляте. Отрицательное влияние ПКБ на рост дрожжей при избытке ПКБ в инокуляте может быть следствием их антимикробного действия. Не исключается также конкуренция за субстрат. Стимулирующий эффект ПКБ в отношении роста дрожжей может быть вызван воздействием как специфических факторов, образуемых ПКБ, что показано в отношении ПКБ и Bifidobacterium spp., так и неспецифических экзометаболитов, относящихся к нутрицевтикам (витамины группы В, аминокислоты, свободные нуклеотиды и др.), которые P. freudenreichii выделяет в среду.
Исследовано влияние культуральной жидкости (КЖ) P. freudenreichii на S. cerevisiae. Данные, представленные в таблице 21, показывают, что КЖ 18- и 24-часовой («молодой») культуры P. freudenreichii оказывала положительное влияние на накопление клеток дрожжей на полусинтетической среде А в течение 24 часов культивирования. Эффект КЖ P. freudenreichii был заметнее при развитии дрожжей на синтетической среде Б, не содержащей кукурузного экстракта, причем в этом случае КЖ и 72-часовой (более «старой») P. freudenreichii стимулировала рост . cerevisiae.
Известно, что разные штаммы S. cerevisiae обладают разной потребностью в витаминах и других биологически активных соединениях. В связи с этим исследована способность P. freudenreichii стимулировать рост различных штаммов хлебопекарных дрожжей: М-23, Краснодарская-11, Б-14, 576 из коллекции культур ГОСНИИХП. Установлено, что культуральная жидкость (КЖ) P. freudenreichii стимулирует рост всех исследованных штаммов дрожжей (рисунок 15).
Для выявления природы веществ, стимулирующих рост S. cerevisiae, исследовали воздействие КЖ P. freudenreichii, подвергнутой нагреванию при 100С (10 мин) или диализу (использовали диализные мешочки, пропускающие молекулы размером до 10 кДа), на рост хлебопекарных дрожжей. Было отмечено, что такая обработка КЖ P. freudenreichii приводит к снижению или потере стимулирующего эффекта (рисунок 16). Следовательно, вещество(а), обладающее стимулирующей активностью в отношении роста S. cerevisiae, термолабильно, но не является высокомолекулярным соединением.
Основной целью применения пропионовокислых бактерий является ингибирующее действие выделяемых ПКБ экзометаболитов (пропионата, ацетата и бактериоцинов) на рост гнилостных бактерий, в частности В. subtilis и В. cereus. Поэтому была проведена серия экспериментов для определения концентрации пропионата, достаточной для подавления роста спорообразующих бактерий рода Bacillus. Важным являлся также вопрос, подавляет ли пропионат (и в какой концентрации) рост самих дрожжей.
Исследовано ингибирующее действие пропионата натрия (ПН) на рост В. subtilis 40 и S. cerevisiae М-23 на полусинтетической среде А. Установлено, что для ингибирования роста дрожжей требуются более высокие концентрации пропионата, чем для подавления роста бацилл. Рост
