Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Строение молекул пектина 11
1.1.1. Физико-химические свойства низкометоксилированных пектинов 20
1.1.2. Выделение и свойства свекловичного пектина. особенности его строения 25
1.2. Методология исследования пектина 31
1.3 Определение аналитических характеристик пектина и совершенствование методики оценки состояния карбоксильных групп пектина 32
1.4. Влияние способа очистки на физико-химические свойства пектина... 38
1.5 Использование компьютерного моделирования процессов экстракции и очистки пектиновых веществ 42
1.6. Значение пектина как пищевой добавки 44
1.7. Пектин как биологически активный компонент 46
1.8. Использование пектина при стимуляции роста семян 46
2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Определение аналитических характеристик пектина совместным кондукто- и потенциометрическим титрованием 50
2.1.1. Определение содержания свободных и нейтрализованных карбоксильных групп в пектине 50
2.1.2Определение содержания этерифицированных карбоксильных групп в пектине 52
2.1.3.Определение содержания ацетильных групп в пектине 54
2.2. Кондиционирование ионообменных смол и пектина 55
2.3. Термический анализ 56
2.4. ИК-спектроскопия препаратов галактуроновых кислот 57
2.5. Определение аминокислотного состава белков 58
2.6. Атомно-абсорбционная спектрофотометрия 60
2.7. Определение содержания сахара (ГОСТ 5672-68) 61
2.8. Методика очистки свекловичного пектина Na-ЭДТА 63
2.9. Статистическая обработка полученных данных 64
3 Совершенствование аналитических методов исследования состава и пектина 66
3.1. Использование методов кондукто- и потенциометрии для определения основных аналитических характеристик свекловичного пектина 66
3.2. Применение электрохимических методов анализа для оценки содержания ацетильных групп и солевых форм свекловичного пектина 81
4. Влияние способов выделения и очистки на состав и физико-химические свойства пектина 91
4.1. Состав и свойства пектина. выделенного с использованием Na-ЭДТА 91
4.2. Сорбционная очистка свекловичного пектина 102
4.3. Компьютерное моделирование взаимодействий в системе полигалактуроновая кислота-вода-ион кальция 109
5. Использование пектина в пищевой промышленности и сельскохозяйственном производстве 119
5.1. Неизотермическая дегидратации пектина и ее влияние на процесс выпечки хлеба 119
5.2. Использование пектина в качестве стимулятора прорастания семян растений 127
6. Выводы 136
Список использованной литературы 138
- Выделение и свойства свекловичного пектина. особенности его строения
- Кондиционирование ионообменных смол и пектина
- Применение электрохимических методов анализа для оценки содержания ацетильных групп и солевых форм свекловичного пектина
- Компьютерное моделирование взаимодействий в системе полигалактуроновая кислота-вода-ион кальция
Введение к работе
В настоящее время ухудшение экологической обстановки связано с тем, что ежегодно в окружающую среду вводятся десятки тысяч веществ, характеризующихся токсическими свойствами для человека и влияющих на изменение пищевого статуса населения. В организм человека с водой и пищей поступает значительная часть веществ, обладающих канцерогенным и мутагенным действием.
Государственная политика направлена на то, чтобы снизить количество токсикантов в окружающей среде и уменьшить их проникновение в организм человека, в том числе и с продуктами питания. Концепция государственного развития в области здорового питания населения РФ на период до 2005 года № 917 от 10 августа 1998 года своею составной частью предусматривает разработку безопасных пищевых продуктов и продуктов функционального назначения. В этой связи использование пектиновых веществ как природных детоксикантов остается актуальным. Очевидно, что получение безопасных и биологически активных продуктов заключается в разработке оптимальных технологий не только в процессе переработки сырья» но и при его выращивании в условиях минимизации воздействия на него факторов, способных вызвать токсикацию тканей уже на этом этапе [180],
Для соблюдения перечисленных требований при выращивании и переработке растений с целью получения пектина большое значение имеют методы контроля конечного продукта. Совершенствование этих методов позволяет с учетом физико-химических показателей целевого продукта контролировать его качество на этапах выращивания, промежуточной переработки [19, 21] и при получении конечных оценочных характеристик [40].
Изучение пектина начато достаточно давно, и со времени классических работ в области свойств и классификации пектина [143, 353, 159, 162] выделились два основных направления его изучения и использования.
Первое связано с применением пектина в качестве желирующей добавки в пищевой промышленности. Классификации сырья, технологии получения и использования пектинов в этой области посвящены работы Н.П. Шелухиной, Г\Б. Аймухамедовой, КС. Карповича, Л.В. Донченко и др.
Несколько позднее получило распространение новое направление, основанное на протекторных свойствах пектина, связанных с функциональной активностью молекул галактуроновой кислоты [63, 73]. Обострение экологических проблем определило использование детоксицирующих свойств пектина в ряде задач по обеспечению статуса пищевой безопасности населения [37, 38, 39, 54, 62, 151, 152]. Кроме того, пектиновые вещества используются в промышленном и аграрном секторе в качестве добавок в кремы [64] и микробиологические среды [142], как консерванты почвы и в других целях [18, 62, 72].
Научные разработки этих направлений, подтверждаемые практическими результатами, должны закономерно привести к организации производства пектина и пектинопродуктов на территории, где в них высока потребность и существует достаточная сырьевая база. По экспертным оценкам потребность рынка в России [33, 95] может доходить до 7000 тонн в год. Половина из этого количества может приходиться на пектин медицинского назначения, особенно в экологически неблагоприятных зонах.
Доминирующим источником сырья в России, особенно в ЦЧЗ, является свекловичный жом, полная переработка которого на пектин могла бы обеспечить 2/3 потребности России в низкометоксилированных пектинах.
Продолжает оставаться актуальным вопрос получения высокоочищенных пектинов, в том числе и низкометоксилированных. Ранее существовавшие мощности СССР по получению пектинов, в силу нарушения межреспубликанских связей, были ликвидированы и не восстановлены до сих пор. Частично это связано с тем, что высокая конкуренция на рынке пектинов, созданная мировыми лидерами в этой области (Геркулес-США, II&F—Австрия) за счет низкой себестоимости и высокого качества,
продолжают контролировать рынок пектина в России. Ситуация может
измениться в том случае, если будут созданы эффективные
высокотехнологичные производства, позволяющие получать
высококачественный пектин из местного сырья.
Существовавшие ранее в СССР технологии [34, 52], особенно на стадии очистки пектина, не позволяли эффективно получать целевой продукт высокого качества. Поэтому поиск методов очистки пектиновых концентратов в наши дни продолжает привлекать интересы ученых.
Производство пектина может базироваться только па критериях комплексного подхода в решении научных, производственных и экономических вопросов по организации рынка сбыта пектина и пектинопродуктов [134]. Для такого замкнутого цикла решения проблемы актуальным является дальнейшая разработка новых видов пектино содержащих продуктов [31, 105] и расширение области его агропромышленного использования.
Цель и задачи исследования. Целью работы является совершенствование технологии выделения и очистки свекловичного пектина и методов его аналитического контроля.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
1. Усовершенствование методов определения функционального
состава молекул пектина.
2. Повышение степени чистоты пектина с применением
комплексообразующих веществ.
Выявление изменения состава пектина при его обработке ионообменными смолами.
Выявление особенностей гидратации пектина, полученного с использованием различных методов очистки.
5, Разработка компьютерных моделей, отражающих изменение
гидратации и межмолекулярных взаимодействий на различных стадиях выделения и очистки пектина.
6. Обоснование и разработка схемы использования высокоочищенного
пектина при выпечке хлеба и для стимулирования физиологической
активности семян растений.
Научная новизна работы. Установлено влияние метода выделения пектина из раствора на его состав и гидратационные характеристики. Выявлено, что выделенный с применением хлорида кальция ("кальциевый") пектин менее гидратирован, чем полученный спиртовой обработкой раствора ("спиртовой"). Показано, что различия в гидратации молекул пектина связаны с образованием низкомолекулярных структур, образующихся под действием связывающего цепи полигалактуроновой кислоты иона кальция.
Выявлено, что обработка раствора пектина дииатриевой солью этилендиамиптетрауксусной кислоты (Na-ЭДТА) приводит к снижению в 2...3 раза содержания в продукте балластных веществ, повышает степень ионизации карбоксильных групп и общую гидратацию его молекул. Показано увеличение содержания фрагментов полигалактуроновой кислоты в очищенном Na-ЭДТА пектине.
Установлено преимущество применения неионогенного сорбента "Стиросорб МХДЭ-100" перед анионитами различной природы при сорбционной очистке препаратов пектина. Выявлено, что минимальные потери целевого продукта имеют место при очистке раствора пектина последовательной обработкой катионитом КУ-2-8 и исследованным неионогенным сорбентом.
Показано, что для объяснения явлений, протекающих при выделении и очистке пектина, и прогнозирования его свойств могут быть использованы методы компьютерного моделирования.
Подтверждены экспериментальные данные о гидратации молекул галактуроновой кислоты и известные данные о комплексообразовании
молекул пектина с ионами кальция с участием как карбоксильных групп, так и спиртовых гидроксилов.
Положения, выносимые на защиту:
Усовершенствованная методика определения аналитических характеристик пектина.
Экспериментальные данные по влиянию способа очистки пектина на его состав и гидратационныс характеристики.
Результаты компьютерного моделирования состава, процесса выделения, очистки пектина и прогнозирования его свойств.
Результаты использования очищенного пектина как пищевой добавки при выпечке хлеба и в качестве стимулятора роста яровых зерновых культур.
Практическая ценность работы:
Результаты и выводы диссертационной работы были положены в разработку патентных исследований и технической документации, нашедшей применение в хлебопекарной отрасли и аграрном секторе,
Усовершенствована методика оценки физико-химических показателей пектина с использованием совместного кондукто- и потенциометрического титрования.
Разработанные методы очистки пектина положены в основу рецептуры хлеба с использованием пектина как пищевой добавки.
С использованием очищенного свекловичного пектина разработан и прошел испытания в хозяйстве ЗАО "Каттонинвест Нижнебайгоровский" препарат по стимулированию энергии прорастания и полевой всхожести семян яровых зерновых культур.
Достоверность результатов работы. Достоверность результатов, представленных в работе, подтверждается использованием современных физико-химических методов анализа, математических методов обработки
данных, методов компьютерного моделирования, а также лабораторно-
полевыми испытаниями.
АпрпПацип работы. Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены:
- на международной научно-практической конференции, посвященной
90-летию Воронежского государственного аграрного университета имени
К,Д. Глинки и 10-летию технологического факультета ВГАУ: "Актуальные
направления развития экологически безопасных технологий производства,
хранения и переработки сельскохозяйственной продукции" (Воронеж, 15—18
апреля 2003года);
на международном научном семинаре "100 лет хроматографии" (Воронеж, ВГУ, 1.,,3 октября 2003 года);
на X международной конференции "Физико-химические основы ионообменных процессов'1 (Воронеж, 14.,.17 сентября 2004 года);
на международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса" (Донской государственный аграрный университет, 1,,,4 февраля 2005 г);
на научных и учебно-методических конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Воронежского государственного аграрного университета имени К, Д. Глинки (Воронеж, 2003...2005 гг.).
Работа выполнена в соответствии с координационным планом научного совета РАН по адсорбции и хроматографии на 2000...2004 гг. (раздел 2Л5.6.2: "Исследование межмолекулярных и гидратационных взаимодействий, кинетики и механизма массопереноса в ионитах и ионообменных мембранах в системах с органическими электролитами и полиэлектролитами") и плану НИР ВГАУ на 2001,..2005 гг. (тема № 6: "Разработка научных основ формирования устойчивых агроэкосистем ЦЧР" № 01,200.1003985). Исследования выполнены в лабораториях кафедры химии ВГАУ, кафедры аналитической химии Воронежского государственного университета,
лаборатории массовых анализов ВГАУ, зональной агрохимической
лаборатории и лабораторией диагностики и ветеринарной медицины.
Публикации. По теме исследования опубликовано 9 научных работ и подана заявка на изобретение (регистрационный № 2004125842).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 155 страницах, состоит из введения, шести глав, рекомендаций производству, выводов и заключения. Работа содержит 36 рисунков и 32 таблицы. В списке используемой литературы приведено 188 библиографических ссылок на отечественные и иностранные источники. Приложения даны на четырех страницах.
Выделение и свойства свекловичного пектина. особенности его строения
Использование свекловичного пектина ограничивается его слабыми желирующими свойствами в сравнении с цитрусовым и яблочным [153], Плохое качество желе связано с присутствием в молекуле ацетилированных групп. Однако свекловичный жом, остающийся после экстракции сахара, содержит около 25 % пектина в пересчете на сухое вещество и доступен в течение всего года, что очень важно для промышленного производства. Свекловичный пектин имеет некоторые характерные особенности строения, а именно наличие феруловых групп, Показано, что остатки феруловых и коричных кислот и тирозина связаны с биополимерами и формируют определенную структуру, которая обладает антиоксидантными свойствами. Например, сахара пшеничной муки содержат феруловые группы, и добавление гидропироксидазы для образования феруловых кислот приводит к образованию геля. Аналогичная реакция использована при получении фоточувствительных искусственных полимеров целлюлозы с ее взаимодействием с поливиниловым спиртом, содержащим остатки коричной кислоты. Одним из путей повышения качества и промышленного использования свекловичного пектина является сшивка его молекул с увеличением молекулярной массы [182].
При получении свекловичного пектина из жома 22 % его растворяется в воде и 1,6 % под действием желирующих веществ от общего количества спиртоосаждаемого пектина. Основная масса пектина растворяется при температуре 85С действием на жом 0,05 N раствора НС1, что составляет около 19 % от общего содержания спиртоосаждаемого пектина. Значительное количество (около 11 %) спиртоосаждаемого пектина доэкстрагируется при 4С 0,05 N раствором NaOH. За две такие процедуры экстрагируется 95 % галактуроново й кислоты, составляющей общее количество спиртоосаждаемого пектина.
К другим способам получения пектина можно отнести экстракцию горячей водой (при 80С, при рН 5 в течение 2 часов), оксалатом аммония (при 80С, рН 5 в течение 2 часов) и с помощью хлората уксусной кислоты (при 70С, рН 4 в течение 2 часов). При этом соответственно экстрагируется 8 А 7,4 и 23 % пектина.
Свекловичный пектин имеет достаточно низкую молекулярную массу, от 15000 до 48000 а.е.м., что частично объясняет его низкую желирующую способность. Он содержит нейтральные сахара (арабинозу, галактозу и рамнозу), по гораздо меньше, чем яблочные и цитрусовые пектины (6.„24 % от их количества). В зависимости от вида экстрагента пектин может извлекаться преимущественно с поверхностных или глубинных частей жома. Поверхностные слои пектина сильно обогащены арабинозой, содержат фрагменты эфиров феруловых и р-кумаровых кислот, которые образуются в результате распада лигнинов. Степень ацетилирования свекловичного пектина может достигать 35 %, что особенно характерно для кислото-растворимой фракции. При таком содержании ацетилированных фрагментов для обеспечения эффективного желирования необходима предварительная обработка молекул пектина [129].
Свекловичный пектин содержит до 1.,.2 % остатков аминокислоты пролина [137] и до 1 % феруловых кислот, что отличает его от яблочного, цитрусового и некоторых других видов пектина. Как отмечалось ранее, свекловичный пектин представляет собой рамногалактуронан, причем в его молекуле с полимерной цепью галактуроновой кислоты связаны боковые цепи, состоящие из нейтральных Сахаров, а также имеются участки для содержания разветвлений. Расположение ацетильных в макромолекуле групп изучено при получении продуктов деградации пектина после обработки пектинметилэстсразой и эндополигалактуроназой, экзоарабиназой и эндогалактаназой [138, 139, 140, 141]. Показано, что 80.-.90 % ацетильных групп расположено на неразветвленных участках у атомов С2 и Сз пиранозных циклов галактуроновых кислот и достаточно регулярно расположены вдоль цепи галактуронана. В противоположность этому связи с феруловой кислотой образованы в основном в местах боковых ответвлений.
Методами ферментативного анализа была определена структура нейтральных Сахаров в боковых цепях, а также точное расположение феруловых фрагментов. С использованием метода метилирования показано, что кислото- и щелочерастворимые пектины, а также их боковые цепи имеют сходное строение и состоят из а-1,4 связанных галактуроновых кислот и 1,2 связанных /-рамнозильных остатков, Арабиноза, представленная в фуранозной форме, является конечным фрагментом 1,5 и 1,3,5 связей. Галактозные фрагменты связаны в положении 1,4и некоторое их количество в положениях С-3 1,3-, 1,6- и 1,3,6, Поэтому различают два типа I и II араби но гал актанов. Эти данные были получены на основе 13С ЯМР, которым подтверждено, что свекловичный пектин составлен из 1,4-а-В-галактуронана, содержащего небольшое количество рамнозы с боковыми цепями.
Более полная информация о содержании остатков арабинозы и галактозы в разветвленных областях получена при слабом кислотно-ферментативном гидролизе. Гидролиз с использованием арабинофуразидазы является двухстадийным процессом, причем на первой стадии рвутся а-1,3 связи, и остается только линейный а-1,5 арабинан, который затем гидролизуется на второй стадии. Сходная картина наблюдалась и при высоком содержании арабинанов. Эндоарабиназы гидролизовали пектин с образованием линейных арабинанов, показывая низкую активность при гидролизе первичных ответвленных фрагментов, однако эта активность усиливалась при добавлении арабинофуразидазы [171]. Тот факт, что [3 - галактозидаза и эндогалактоназа слабо отщепляют боковые фрагменты и галактаназная активность не возрастает говоря о том, что галактаназа не воздействует на арабинозные боковые цепи, Галактозные фрагменты имеют достаточно короткую протяженность. Это подтверждается высоким содержанием в молекулах пектина концевых 1,4 галактоз и отсутствием олигомеров галактозы в продуктах распада. Жесткая обработка трифлоровой кислотой (ТФК) при 100С в течение 1 часа не вызвала полного отщепления всех остатков галактозы, что подтверждает непосредственную связь ее с галактуроново и кислотой- Из этого следует, что боковые цепи высоконасыщены а-1,5-арабинанами в положении С-3, р-1,4-галактанами в положении С-3, Р-1,3- и р-156-галактанами.
Влияние окислителей на различные пектины, в том числе и свекловичный, носит отличительные особенности. Такие оксиданты, как йодат калия, перманганат калия, хлорат натрия, ферриционид калия, перекись водорода в водном растворе пектина вызывают постепенную его деградацию и уменьшение вязкости раствора. В противоположность этому перекись водорода - пероксидаза и персульфат аммония увеличивают вязкость среды. Причем первая быстро увеличивает предельную вязкость до ее максимального значения, а второй вызывает постепенное увеличение вязкости до предельной величины. Дальнейшее использование растворов с повышенной вязкостью используется в зависимости от их назначения. Детально процесс сшивания молекул пектина в присутствии оксидантов изложен в работе Тибалта [176]. В этом исследовании показано, что феруловые группы коренным образом вовлечены в реакции сшивания цепей. Кроме того, выделены следующие закономерности.
Содержание остатков галактуронової! кислоты и нейтральных Сахаров не изменяется в течение всего процесса сшивания, в отличие от остатков феруловой кислоты, концентрация которых значительно уменьшается при увеличении вязкости раствора. Процесс деградации пектина при этом изучить достаточно сложно, так как одновременно несколько факторов (концентрация полимера, молекулярная масса, рН, ионная сила) влияют на скорость реакции.
Кондиционирование ионообменных смол и пектина
Ионообменные смолы являются эффективными сорбентами, позволяющими удалять из жидких смесей ионизированные компоненты [47, 48].
Синтетические ионообменные смолы (иониты) делятся на катиониты -смолы, способные к обмену катионов и аниониты, способные к обмену анионов. Наиболее широко на практике применяются катионит КУ-2-8 (катионит универсальный, марки КУ-2) и анионит АВ-17-8 (анионит высокоосновный, марки АВ-17).
Перед использованием иониты подготавливались к работе. Сухой ионит (КУ-2-8 и АВ-17-8) заливался насыщенным раствором хлорида натрия и выдерживался в течение суток, затем в течение суток в 10 % и еще 12 часов в 3 % его растворе. После этого смолы отмывали дистиллированной водой от избытка соли и обрабатывали: катионит - 1 М раствором соляной кислоты, а анионит - 1 М раствором гидроксида натрия с многократной их сменой, а затем промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции. В результате получались катионит КУ-2-8 в Н-форме и анионит АВ-17-8 в ОН-форме.
Комбинированная очистка жидких смесей от ионизированных примесей может осуществляться последовательной их обработкой ионообменниками различной полярности. Имеются сведения об использовании ионообменных смол очистки растворов полигалактуроновой кислоты для их обеззоливания [83, 84, 86]. Нами с целью получения чистых препаратов полигалактуроновой кислоты проводилась их последовательная обработка анионитом и катионитом. В результате образовывались препараты пектина в кислотной его форме.
Одним из главных методов определения содержания сольватирующих растворителей является измерение потери массы иопообменника при его высушивании. При этом режим сушки должен обеспечить полное удаление определяемого растворителя без химических изменений самого образца. Использование методов термического анализа для исследования гидратированных ионообменных систем было показано в работах.
При работе с органическими объектами чаще всего используют модификации термического анализа, связанные с регистрацией изменений температуры (дифференциальный термический анализ — ДТА) или веса образца (термовесовой анализ - ТВ) [107].
Дифференциальный термический анализ (ДТА) представляет собой метод изучения переходов, происходящих под действием тепловой энергии. Образец и эталон нагревают в одинаковых условиях. До тех пор, пока в образце не происходит превращений, сопровождающихся выделением или поглощением тепла, температура образца и эталона остается одинаковой. Разность температур между ними регистрируется автоматически в виде графика (термограмма) в координатах: разность температур - температура образца. Таким путем, возможно, наблюдать и изучать как экзотермические, так и эндотермические процессы. Метод ДТА позволяет определять температуру таких превращений, как потеря свободной влаги, распад гидратов с последующим испарением воды, термическое разложение. При этом площадь пика на термограмме пропорциональна количеству тепла выделенному или поглощенному при данном переходе, а калибровка прибора по известным образцам позволяет получать достаточные результаты.
Особенности гидратации пектина исследовали на дериватографе системы "F. Paulik, J. Paulik, L. Erdey". В процессе анализа образец воздушно-сухого пектина помещали в платиновый тигель и нагревали в печи дериватографа от 293 до 423К с постоянной скоростью 5 К/мин. Эталоном служил прокаленный при 1375К оксид алюминия. Для получения корректных результатов оптимальная масса навески составляла 0,10 г. ИК-спектроскопия как один из разделов спектроскопии включает получение, исследование и применение спектров испускания, поглощения и отражения в инфракрасной области спектра. С помощью этого метода можно выявить не только наличие функциональных групп, но и особенности межмолекулярных взаимодействий [110, 111].
Метод ИК-спектроскопии основан на взаимодействии исследуемого вещества с электромагнитными колебаниями. В результате поглощения колебаний с определенными и специфичными для каждого вещества значениями длин волн формируется спектр поглощения. Качественные особенности вещества характеризуются набором длин волн и максимумов полос поглощения. Количество вещества определяется по степени поглощения колебаний при определенных значениях длин волн.
Для качественной характеристики инфракрасного спектра пользуются волновым числом v, которое выражается в обратных сантиметрах. Волновое число v показывает, какое число длин волн укладывается на отрезке длиной 1 см. Соотношение между длиной волны А,, выраженное в микрометрах, и волновым числом характеризуется равенством
Наиболее интенсивное поглощение веществом электромагнитных колебаний наблюдается тогда, когда энергия кванта точно отвечает разности двух возможных энергетических уровней молекулы. В ИК-области изменение энергии молекулы связано с колебаниями отдельных атомных групп или вращением молекулы в целом. Колебания атомов даже в простых молекулах весьма разнообразны. Они могут совершаться в направлении валентной связи, как бы растягивая ее, — это валентные колебания. Они бывают симметричные (два атома движутся в одном направлении по отношению к третьему) и асимметричные (атомы движутся в разных направлениях). Колебания с изменением угла между направлениями связей называют деформационными [109]. Инфракрасные спектры изображают в виде графика, откладывая по оси ординат пропускание, а по оси абсцисс -волновые числа.
Для проведения ИК-спектроскопических исследований подготавливали образцы, путем нанесения тонким слоем приготовленного раствора пектина концентрации 0,05 %. на оптически прозрачные пластины моно кристаллического кремния, а затем высушивались при температуре 20С. Толщина пленок составляла 1 мкм. ИК-спектры снимали с помощью ИК Фурье спектрометра "Infralum FT-02" с разрешением 4 см"1 и компьютерной обработкой результатов с автоматической записью характеристических частот, по которым с использованием литературных данных [101] проводился качественный анализ образцов. Расчет интенсивностей характеристических максимумов проводили методом базовой линии [78]. В качестве реперной принималась высота пиков, соответствующих области частот 2929...2948 см" , характеризующих валентные колебания связей С-Н. Обработку ИК-спектров проводили в стандартной программе "GRAMS-32/4".
Применение электрохимических методов анализа для оценки содержания ацетильных групп и солевых форм свекловичного пектина
Известно, что физико-химические свойства пектина определяются строением его молекулы, основными фрагментами которой являются пиранозные циклы D-галактуроновой кислоты, содержащие свободные или метоксилированные карбоксильные группы, а также ацетилированные гидроксогруппы [2, 3]. Наличие свободных карбоксильных групп в молекуле пектина определяет его способность к участию в реакциях ионного обмена.
Выделение пектина из растительного сырья в основном осуществляется кислотно-спиртовой обработкой, которая на последней стадии включает использование гидроксида аммония [51]. Поэтому конечный продукт частично содержится в солевой аммонийной форме. Однако технологические свойства пектина (желирование, комплексообразование и т.д.) определяются наличием не только свободных или диссоциированных карбоксильных групп, но и фрагментов, содержащих сложиоэфирные связи. Поэтому, при разработке технологических процессов с применением пектина необходимы знания о его качественном и количественном составе.
Для определения содержания функциональных групп в пектине в основном используется метод кондуктометрического титрования [115, 116]. Однако недостатком этого метода является невысокая точность нахождения точек эквивалентности, особенно при определении содержания свободных карбоксильных групп и их общего количества. Как показано в разделе 3.1, для повышения достоверности аналитических определений содержания свободных карбоксильных групп в пектине, может быть использован способ одновременного титрования навески пектина методами кондукто- и потенциометрии.
Использование в качестве контроля метода потенциометрии, как более точного [56, 73], позволило модернизировать метод определения точки эквивалентности по пересечению линий тренда прямых, охватывающих максимальное число экспериментальных точек на первом и втором участках зависимости электропроводность - объем титранта.
Необходимым является определение их содержания, так как технологические свойства пектина в значительной степени зависят от содержания в нем ацетилированных гидроксогрупп и солевых форм. С этой целью нами использован разработанный выше метод.
Определение содержания исследуемых групп пектина осуществлялось одновременным кондуктометрическим и потенциометрическим титрованием по методике, изложенной в разделе ЗЛ. По объему титранта в точках эквивалентности определяли общее содержание в пектине свободных и деэтерифицироваппых карбоксильных групп {Ссв\ а содержание этерифицировапных рассчитывали по формуле
Содержание общего количества функциональных групп Сф определялось ацидимитрическим титрованием 0,1 н раствором НС1 гидролизованного раствора пектина, полученного при определении карбоксильных групп.
Количество ацетилированных гидроксогрупп (Сац) рассчитывалось по формуле Известно, что кислотно-основные свойства пектина определяются наличием свободных карбоксильных групп [2], При этом фактором, влияющим на кислотно-основное равновесие в растворе пектина, является также содержание нейтрализованных карбоксильных групп, образующихся в процессе обработки пектина аммиаком. Традиционная схема обработки пектина і идроксидом аммония предполагает десятикратный его избыток по отношению к содержанию свободных карбоксильных [рупп. Поэтому получаемый таким образом пектин должен частично находиться в солевой аммонийной форме- Представляет интерес выявить сходство и различие между процессами титрования аммонийной и кислотной форм пектина. На рисунке 13 показаны кривые кондуктометрического титрования аммонийной и кислотной форм выделенного пектина.
Данные показывают, что на начальной стадии титрования ход кривых имеет значительные различия. При титровании солевой формы при этом имеет место некоторое увеличение электропроводности (рис. 13а), Причиной этого является то, что в водном растворе пектата аммония, как соль, образованная слабым основанием и слабой кислотой [70, 73], полностью гидролизуется: где Я- полимерная цепь молекулы пектина.
При титровании щелочью происходит нейтрализация карбоксильных групп: фиксированные на матрице карбоксилат-ионы практически не вносят вклада в электропроводность, а относительное ее постоянство обусловлено присутствием в растворе продукта гидролиза — гидроксида аммония. Кривая титрования кислотной формы пектина (рис, 136) соответствует аналогичным кривым титрования слабых низкомолекулярных кислот [115, 116]. Некоторое снижение электропроводности связано с накоплением в растворе менее подвижных, чем протон, ионов натрия, а дальнейшая стабилизация электропроводности и ее увеличение определяется процессом гидролиза образующихся при титровании карбоксилат-ионов пектина. После полной нейтрализации карбоксильных групп электропроводность резко увеличивается за счет избытка титранта с аномально подвижным гидроксид-ионом.
Обработка экспериментальных данных рис. 13 путем построения линий тренда с максимальным уровнем аппроксимации линейного участка левой части кривых титрования показала для солевой формы пектина у - 1,9281х - 2,5693 при R2 = 0,9980, а для кислотной у - 2,0584х - 3,2665 при R2 = 0,9980. При этом объемы в точках эквивалентности соответствуют данным потенциометрического титрования (рис. 14).
Компьютерное моделирование взаимодействий в системе полигалактуроновая кислота-вода-ион кальция
Пектиновые вещества различного происхождения, используемые в пищевой технологии, должны обладать высокими желирующими свойствами и способностью связывать ионы солей тяжелых металлов. Эти требования могут быть выполнены при использовании достаточно совершенной технологии их получения.
Современная технология выделения пектина из растительного сырья включает стадии кислотной экстракции, нейтрализации, осаждения солями кальция или этанолом, спиртовой очистки с последующим концентрированием для получения конечного продукта. В процессе выделения пектина, его очистки и концентрирования происходят превращения молекул протопектина с разрывом химических связей с балластными веществами, изменением конформаций, а также гидратации функциональных групп. В зависимости от условий экстрагирования и последующих воздействий молекулы полигалактуро новой кислоты, являющейся основой пектина, переходят из недиссоциированного состояния в диссоциированное и обратно, что влечет за собой изменение условий взаимодействия их с другими компонентами раствора, в первую очередь воды.
Гидратация молекул пектина происходит за счет образования водородных связей их функциональных групп с водой при изменении структуры водных кластеров. Если же в систему вводятся молекулы спирта, то возможно образование ассоциатов пектин - спирт, вода - спирт. Изучение особенностей гидратации и сольватации пектина позволяет корректно оценить молекулярную структуру и прогнозировать его макроскопическое поведение. Изменение степени гидратации должно сказаться на желирующей и комплексообразующей способности пектина.
В настоящее время традиционные исследования молекул пектина, основанные на классических физико-химических методах, дополняются все более популярными методами компьютерного моделирования. Эти методы позволяют уточнять пространственные модели пектина, корректно оценивать расстояния между атомами и энергетические взаимодействия в системе, демонстрировать полученные на основе физико-химических исследований образуемые продукты реакций и моделировать их дальнейшее поведение.
Нами выполнено исследование гидратации и сольватации молекул полигалактуроновой кислоты, образующейся на различных этапах традиционных технологий получения пектина, методами компьютерного моделирования.
Традиционная технология выделения и очистки пектина методом кислотной экстракции с последующим осаждением солями кальция или спиртом была смоделирована в среде компьютерных программ Hyperchem и Chemoffice, и обработана с использованием методов молекулярной механики ММ+, а для уточнения геометрической конфигурации молекул -полуэмпирическим методом AM 1 Моделирование проводилось в системах, содержащих галактуроновую кислоту как элементарное звено полигалактуроновой кислоты. Условия гидратации галактуроновой кислоты моделировались путем сравнения кратчайших расстояний между молекулами галактуроновой кислоты и воды по связям Ogal,..Hw.
Особенности гидратации молекул галактуроновой кислоты исследовались путем последовательного добавления к ее модели молекул воды. Было установлено, что полная гидратация осуществляется 19 молекулами. При этом кратчайшие расстояния Ogal-.,Hw составляют от 1,94 до 2,53 А0. Добавление в модель двадцатой и следующих молекул воды вызывает ее перераспределение с увеличением кратчайших расстояний между центрами гидратации галактуроновой кислоты и образование ассоциатов "вода-вода". Как и следовало ожидать, из значений величин дипольных моментов связей [101] максимально гидратированным оказывается карбоксилат-ион. Несущий заряд и карбонильные атомы кислорода гидратированы каждый пятью молекулами воды (кратчайшие расстояния Oga ,„HW 1,94...2,14 А0). При этом четыре молекулы воды имеют кратчайшие расстояния с обоими этими атомами. Таким образом, число гидратации карбрксилат-иона равно 6, что согласуется с данными по гидратации ацетат-иона, представленными в работе [103]. Вызывает интерес сравнение моделей гидратации, выполненных в среде Chemoffice (рис. 25) и Hyperchem (рис, 26), Однако, в настоящее время ни одна из программ не имеет полной универсальности, и использование какой-либо из них связано с выполнением конкретных задач.
