Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современная теория и технология способов стабилизации пшеничных зародышей 9
1.1 Пшеничные зародыши. Получение, свойства, характеристики 9
1.1.1 Источник получения пшеничных зародышей 9
1.1.2 Строение и химический состав пшеничных зародышей, их физико-механическая и биологическая характери стика 9
1.2 Хемилюминесценция как метод оценки свободно радикальных процессов 14
1.3 Роль ферментативных процессов при хранении пшеничных зародышей 17
1.3.1 Липаза пшеничных зародышей, свойства, структура, механизм действия 17
1.3.2 Липоксигеназа пшеничных зародышей, физико-химические свойства, структура 23
1.3.3 Каталаза, получение, физико-химические свойства 29
1.4 Исследование процесса стабилизации пшеничных зародышей 33
1.4.1 Факторы, влияющие на качество пшеничных зародышей при хранении 33
1.4.2 Способы стабилизации зародышей пшеницы 36
1.4.3 Ингибиторы, их свойства и применение 39
Глава 2 Материалы и методы исследования 43
2.1 Объект исследования 43
2.2 Методы определения активности ферментов, влияющих на процесс хранения пшеничных зародышей 46
2.2.1 Метод определения активности каталазы 46
2.2.2 Метод определения активности липазы 47
2.2.3 Метод определения активности липоксигеназы 47
2.3 Выделение и очистка ферментов, участвующих в процессе перекисного окисления липидов зародышей пшеницы 48
2.3.1 Метод выделения и очистки липазы зародышей пшеницы 48
2.3.2 Метод выделения и очистки липоксигеназы зародышей пшеницы 50
2.3.3 Метод выделения и очистки каталазы зародышей пшеницы 52
2.4 Определение молекулярной массы ферментов 53
2.5 Электрофоретические исследования ферментов 54
2.6 Методы оценки качественных показателей пшеничных зародышей 55
2.6.1 Физико-механические,биохимические и микробиологические методы исследований 55
2.6.2 Оценка интенсивности свободно-радикальных процессов методом хемилюминесценции 61
2.7 Дифференциально-термический и термогравиметрический анализ 63
2.8 Оценка точности выполнения эксперимента методами математической статистики 64
Глава 3 Исследование механизма сопряженного действия ферментов при окислении липидов 65
3.1 Результаты выделения и очистки липазы, липоксигеназы и каталазы пшеничных зародышей 66
3.1.1 Выделение и очистка липазы пшеничных зародышей 66
3.1.2 Выделение и очистка липоксигеназы пшеничных зародышей 67
3.1.3 Разработка метода выделения и очистки каталазы пшеничных зародышей 73
3.2 Исследование влияния рН и температуры на активность каталазы зародышей пшеницы 76
3.3 Кислотная и термическая инактивация каталазы зародышей пшеницы 77
3.4 Идентификация функциональных групп активных центров каталазы пшеничных зародышей 92
3.5 Заключение 106
Глава 4 Исследование влияния ингибиторов и температуры на качество пшеничных зародышей 108
4.1 Исследование влияния ингибиторов на качественные показатели пшеничных зародышей 108
4.1.1 Изучение влияния ингибиторов на показатели качества пшеничных зародышей при хранении 108
4.1.2 Использование метода хемилюминесцентного анализа для оценки качественных показателей пшеничных зародышей при хранении 115
4.2 Исследование влияния ингибиторов на липазу, липоксигеназу и каталазу пшеничных зародышей 121
4.2.1 Исследование влияния фумаровой и аскорбиновой кислот на липазу зародышей пшеницы 121
4.2.2 Исследование влияния фумаровой и аскорбиновой кислот на липоксигеназу зародышей пшеницы 126
4.2.3 Исследование влияния фумаровой и аскорбиновой кислот на каталазу зародышей пшеницы 127
4.3 Исследование термоустойчивости и форм связи влаги в пшеничных зародышах методами дифференциально-термического и термигравиметрического анализов 133
4.4. Заключение 137
Глава 5 Разработка технологии стабилизации пшеничных зародышей и ее апробация в производственных условиях 139
5.1 Математическое планирование многофакторного эксперимента и оптимизация технологических режимов стабилизации ферментативной активности пшеничных зародышей 139
5.1.1 Обоснование выбора и пределов изменения входных факторов 139
5.1.2 Оптимизация технологических режимов стабилизации ферментативной активности пшеничных зародышей 145
5.2 Разработка технологии стабилизации качества пшеничных зародышей 147
5.2.1 Технология способа стабилизации качества пшеничных зародышей 149
5.2.2 Применение теплонасосной установки для стабилизации качества пшеничных зародышей 151
5.3 Изучение качества стабилизированного пшеничного зародышевого продукта при хранении 152
5.4 Выработка стабилизированного зародышевого продукта в производственных условиях 162
5.5 Расчет экономической эффективности при производстве стабилизированных пшеничных зародышей 165
5.6 Заключение 169
Выводы 172
Литература 174
Приложения 199
- Хемилюминесценция как метод оценки свободно радикальных процессов
- Методы определения активности ферментов, влияющих на процесс хранения пшеничных зародышей
- Исследование влияния рН и температуры на активность каталазы зародышей пшеницы
- Исследование влияния ингибиторов на липазу, липоксигеназу и каталазу пшеничных зародышей
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время существенное внимание уделяется применению натуральных растительных компонентов в различных направлениях промышленности. Особого внимания заслуживает побочный продукт мукомольного производства - пшеничные зародыши, ценный с биологической точки зрения продукт, содержащий в своем составе белки, липиды, значительное количество витамина Е, витамины группы В, макро- и микроэлементы.
Однако широкое применение пшеничных зародышей сдерживается ввиду их нестойкости при хранении. Первопричиной порчи зародышей пшеницы является окисление липидов, вызванное автоокислением и действием гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов.
Стабилизации пшеничных зародышей в последнее время уделяется большое внимание; существующие технологии термической обработки позволяют увеличить срок хранения пшеничных зародышей, однако при этом существенно меняется их биохимический состав; при стабилизации продукта воздействием антиоксидантов увеличение сроков хранения продукта требует значительного расхода консервантов.
Значительный вклад в решение данной проблемы внесли ученые Жеребцов Н.А., Егоров Г.А., Кретович В.Л., Бабаев С.Д., Попова Т.Н. и др.
Работа выполнена в соответствии с тематическим планом НИР Воронежской государственной технологической академии по научному направлению кафедры «Технология хранения и переработки зерна» «Интенсификация технологических процессов зерноперерабатывающих предприятий» (№ гос. регистрации 01.200.1 16821).
Цель диссертационной работы: разработка технологии стабилизации качества пшеничных зародышей на основе сочетания термической обработки и действия стабилизатора.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы задачи исследования:
изучение механизма сопряженного действия липазы, липоксиге-назы и каталазы при окислении липидов пшеничных зародышей;
разработка метода выделения и очистки каталазы пшеничных зародышей, исследования ее физико-химических свойств и иден-тификациия функциональных групп активного центра фермента;
исследование влияния ингибиторов на качественные показатели пшеничных зародышей при хранении;
исследование процесса термолиза пшеничных зародышей методом диференциально-термического анализа и определение температурных зон испарения влаги с различной энергией связи;
определение рациональных технологических режимов стабилизации качества пшеничных зародышей методами планирования эксперимента;
разработка способа стабилизации пшеничных зародышей с применением теплонасосной установки;
изучение динамики изменения качественных показателей стабилизированного по предлагаемому способу пшеничного зародышевого продукта при хранении;
разработка способа количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции;
проведение опытно-производственных испытаний и разработка рекомендаций для внедрения в промышленность предлагаемого способа.
Научная новизна. Научно обоснованы условия и режимы стабилизации качества пшеничных зародышей на основе сочетания термической обработки и действия стабилизатора. Доказана возможность применения метода хемилюминесцентного анализа для оценки качества пшеничных зародышей
при хранении. Изучен механизм сопряженного действия ферментов (липазы, липоксигеназы, каталазы) при окислении липидов пшеничных зародышей. Выявлены температурные интервалы, которые соответствуют испарению влаги с различной формой и энергией ее связи в продукте. Методами планирования эксперимента получены уравнения регрессии, отражающие влияние температуры и ингибитора на активность ферментов. Сформулирована и решена задача оптимизации режимов обработки пшеничных зародышей по минимальному значению активности ферментов.
Практическая значимость работы. Разработана новая технология стабилизации пшеничных зародышей (патент РФ № 2259746). Способ апробирован в производственных условиях на экспериментальной базе ОАО ВНИИКП г. Воронежа.
Предложен способ оценки качества пшеничных зародышей методом хемилюминесцентного анализа (положительное решение о выдаче патента РФ по заявке № 2005112084/028 (013984) от 12.05.2006 г.).
Выявлены температурные зоны, соответствующие испарению влаги с различной энергией связи и термическому разложению белково-углеводного комплекса; установлены предельно допустимые температурные режимы обработки пшеничных зародышей.
Определены оптимальные технологические режимы стабилизации качества пшеничных зародышей.
Рассчитана экономическая эффективность разработанного способа производства стабилизированных пшеничных зародышей на примере ОАО "Бутурлиновский мелькомбинат" г. Бутурлиновка Воронежской области.
Хемилюминесценция как метод оценки свободно радикальных процессов
Хемилюминисценция (фосфоресценция) - явление возникновения излучения, вследствие образования продуктов химических реакций в возбужденном состоянии [22]. Энергия возбуждения излучается в виде фотонов при квантовом переходе в основное состояние молекулы. Спектр излучения чаще всего располагается в видимом диапазоне, хотя известны реакции с излучением инфракрасных и ультрафиолетовых фотонов. Яркость хемилюминис-ценции обычно пропорциональна квантовому выходу - отношению числа фотонов, испускаемых химической системой к числу прореагировавших частиц, практически определяемому как отношение интенсивности свечения к скорости химической реакции [20]. Квантовый выход колеблется от 1 (ферментативное окисление на воздухе люциферина светляка) до 10 15 (реакции нейтрализации кислот основаниями).
В некоторых системах излучателем является вовсе не та молекула, которая возбуждается в первичном химическом акте. Энергия возбуждения передается с нее безизлучательно другим частицам, которые способны излучать с более высоким выходом (активаторы хемилюминисценции). Активаторы смещают спектры излучения в более длинноволновую область.
Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсив ностью и не случайно получила название "сверхслабого свечения" [119]. Значительное распространение получило, однако, измерение хемилюминесцен-ции в присутствии определенных соединений, получивших в отечественной литературе общее название "активаторов", а за рубежом - "усилителей" хе-милюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать химическими и физическими активаторами [22]. Химические активаторы хеми-люминесценции - это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов:
Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин [BHC(N-метилакридиний)]. Под действием окислителя, например радикала гидрокси-ла, происходит образование радикала люминола, который затем вступает в реакцию с супероксидным радикалом, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Ее разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света. Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор [22]:
Интенсивность свечения в большой степени зависит от квантового выхода люминесценции продукта реакции, т.е. от того, какая часть возбужденных молекул продукта перейдет в основное, невозбужденное состояние с испусканием фотона. Обычно эта доля невелика, всего десятые или даже сотые доли процента. Но если все молекулы продукта передадут энергию электронного возбуждения на молекулы активатора, то интенсивность свечения будет теперь определяться уже квантовым выходом люминесценции активатора, который в идеале приближается к единице [148]. К физическим активаторам можно отнести некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие хемилюминесценцию при цепном окислении липидов. Оказалось, что некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов обладают способностью многократно усиливать интенсивность такой хемилюминесцен-ции. Так, например, комплекс редкоземельного иона европия (Еи3+) с антибиотиком хлортетрациклином усиливает хемилюминисценцию при окислении липидов почти в 1000 раз. Один из красителей, производное кумарина, применяемое при создании лазеров под условным названием С-525, усиливает хемилюминесценцию, сопровождающую цепное окисление липидов, более чем в 1500 раз, никак не влияя при этом на хемилюминесценцию при взаимодействии радикалов кислорода (гидроксила и супероксида). Активируют свечение и такие известные красители как родамин Ж6, нильский красный и нильский синий, а также некоторые порфирины. Все эти активаторы не оказывают влияния на ход реакций перекисного окисления, но заметно увеличивают интенсивность свечения. По-видимому, в основе их действия лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции (например, кетона) на активатор:
Интенсивность свечения в присутствии активатора во много раз выше, чем без него, по той причине, что квантовый выход ф люминесценции активатора (А) выше квантового выхода люминесценции продукта реакции (Р).
Хемилюминесценция наблюдается в том случае, если в реакции происходит выделение большого количества энергии, например в реакции взаимодействия двух радикалов или в реакциях с участием перекисей [23]. В последнее время все больший интерес привлекает собственное ("сверхслабое") свечение клеток живых тканей которое обусловлено реакциями свободных радикалов: радикалов липидов и кислорода, а также окиси азота.
Методы определения активности ферментов, влияющих на процесс хранения пшеничных зародышей
Метод определения активности каталазы основан на учете пероксида водорода, образующегося в окислительно-восстановительном процессе при восстановлении молекулярного кислорода и как побочный продукт окисления жирных кислот [65, 184].
Для определения каталазной активности реакционную смесь, состоящую из 20 мл фермента, 20 мл фосфатного буфера (рН = 7,4) и 3 мл пероксида водорода (со = 1 %), инкубировали в течение 15 минут при температуре 37 С.
Параллельно проводили контрольный опыт: к 20 мл фермента приливают 5 мл раствора серной кислоты (со = 10 %) для инактивации фермента, 20 мл фосфатного буфера (рН = 7,4) и 3 мл пероксида водорода (со = 1 %). Смесь инкубировали в течение 15 минут при температуре 37 С. После инкубирования в опытную колбу добавляли 5 мл раствора серной кислоты (со = 10 %). Остаток пероксида водорода в опытной и контрольной колбах титруют раствором 0,1 н перманганата калия. Активность каталазы К выражают в мМ пероксида водорода, разложившегося за время инкубации, на 1 мл ферментного препарата (2.1): где V и V] - соответственно объем перманганата калия, пошедшего на титрование в контроле и опыте, мл; v - объем фермента, мл; 1,7 - масса пероксида водорода, мг, соответствующая 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Активность липазы определяли методом рН-статирования [136, 242], основанным на количественном учёте продуктов реакции гидролиза триглицеридов: жирных кислот и глицерина. В качестве субстрата в опытах использовали эмульсии триглицеридов высокоочищенного рафинированного подсолнечного масла, стабилизированные водным раствором поливинилового спирта (ПВС-8/14) (со = 2 %) [82]. Реакционная смесь состояла из 2,5 мл эмульсии субстрата, 2 мл трис/НС1-буфера (рН = 8,0) и 1 мл раствора фермента. Реакционную смесь вносили в термостатируемую ячейку, нагревали до 37 С и доводили рН реакционной среды до заданной величины добавлением 1,0 н раствора гидроксида натрия. После этого приливали 1 мл раствора фермента. Активность определяли за промежуток времени между 5 и 30 мин после начала реакции. Контрольный опыт проводили аналогично, только вместо раствора фермента добавляли 1 мл буферного раствора (трис/НС 1-буфер, рН 8,0). Удельную активность липазы выражали отношением числа мкМ жирной кислоты в минуту на 1 мг белка. Метод определения активности липоксигеназы основан на определении перекисного числа, изменяющегося в процессе поглощения молекулярного кислорода субстратом и образования при этом гидроперекисей под действием фермента [145]. В качестве субстрата использовали высокоочищенное рафинированное подсолнечное масло [72]. Реакционная смесь состоит из 5 мл раствора фермента, 50 мл фосфат-но-цитратного буфера 0,15 моль/дм с ионной силой 0,06, рН 7,0 и 100 мл субстрата. В контрольном растворе вместо раствора фермента используют воду. В опытной и контрольной пробах определяли перекисное число [45]. За единицу активности принимали такое количество липоксигеназы, при котором один ммоль молекулярного кислорода переходит в гидроперекись за одну мин при 30 С и рН 7,0. В исследовании конформации ферментов обязательным требованием является получение препарата высокой степени чистоты. Объект локализации исследуемого фермента содержит десятки, сотни других сопутствующих соединений, которые необходимо удалить. В ходе выделения фермента использовалась предварительная подготовка биологического материала, заключающаяся в измельчении пшеничных зародышей на лабораторной мельнице и делипидизации охлажденным до (-10 С) ацетоном [2]. Обезжиривание проводили охлажденным ацетоном при температуре (-10) С, обрабатывая реагентом измельченные на лабораторной мельнице пшеничные зародыши, в соотношении зародыш : растворитель =1:1. Отделение обезжиренных зародышей пшеницы, после промывки новой порцией ацетона, осуществляли на воронке Бюхнера через слой фильтровальной бумаги, затем осуществляли сушку на воздухе. Полученный ацетоновый порошок хранили в эксикаторе при температуре 4 - 7 С и использовали для экстракции фермента. Все последующие операции проводили при температуре 4 С. Для экстракции навеску ацетонового порошка растирали в фарфоровой ступке в охлажденной среде выделения. Гомогенат центрифугировали на рефрижераторной центрифуге ЦЛР-1 (Россия) при частоте вращения 1500 g. Супернатант использовали для определения активности фермента. При использовании кислотного осаждения, полученный гомогенат подвергали подкислению до различных значений рН. Осаждение белков полученного супернатанта осуществляли с помощью магнитной мешалки Magnetic stirrer Type mm6 (Польша) с использованием рН-метра MP 220 фирмы Mettler (Германия) посредством добавления холодной 0,01 М уксусной кислоты. Для формирования осадка смесь выдерживали 10-15 мин. После осаждения осадок отделяли центрифугированием и суспендировали в минимальном объёме среды выделения. В полученных после осаждения препаратах определяли активность фермента [82, 136, 242] и содержание белка [216]. Для очистки применяли ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе фирмы «Reanai» (Венгрия). Перед использованием ионообменник подвергали специальной обработке. На каждый грамм сухого вещества добавляли 30 мл дистиллированной воды и оставляли набухать в течение 3-4 часов. Затем выдерживали в течение часа він NaOH, потом в 1 н НС1 и снова в 1 н NaOH. После каждой стадии обработки ионообменник отмывали на воронке Бюхнера дистиллированной водой до нейтрального значения промывных вод. Ионообменник помещали на колонку 1,8 х 15 см и уравновешивали в течение 8-10 часов элюирующей средой. На колонки наносили ферментный препарат, предварительно освобожденный от низкомолекулярных примесей. Элюцию с ДЭАЭ-целлюлозы проводили с помощью ступенчатого градиента КС1 в трис-HCl буфере, рН = 8,0. Скорость элюции составляла 30 мл/ч. Фракции, обладающие ферментативной активностью, объединяли и использовали для дальнейшей очистки.
Исследование влияния рН и температуры на активность каталазы зародышей пшеницы
Для исследования условий действия каталазы наибольший интерес представляют температура и рН - важные физико-химические факторы, оказывающие большое влияние на активность ферментов.
Для определения оптимального значения рН каталазы опыты проводили в интервале рН 3,0 - 11,0. Заданное значение рН поддерживали 0,1 М фосфатным буфером. Активность фермента определяли по начальной скорости реакции при температуре 37 С и выражали в % от максимальной активности (vmax =100 %). Результаты исследования зависимости активности каталазы от концентрации ионов водорода показали, что оптимум рН равен 7,4 (рис. 3.4).
Зависимость активности каталазы от температуры представлена на рис. 3.5. Активность определяли по начальной скорости реакции при значении рН 7,4 в интервале температур 10 - 60 С и выражали в % от максимальной активности (vmax =100 %). Как видно на рис. 3.5, температура оказывает существенное влияние на скорость ферментативной реакции. Температурный оптимум каталазы составляет 37 С. Кривая v = f (Т) имеет форму, близкую к колоколообразной, восходящая и нисходящая ветви кривой имеют достаточно крутой наклон и симметричны относительно друг друга. Снижение скорости при температурах, ниже оптимальной, обусловлено уменьшением числа активных молекул фермента, а следовательно, снижением скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса; при более высоких температурах происходят глубокими конформационными изменениями фермента вследствие тепловой денатурацией белковой молекулы, что приводит к снижению каталитической активности.
Температура и рН являются важными факторами устойчивости фермента. Как повышение температуры, так и увеличение в среде ионов НҐ ведут к инактивации каталазы. Это связано с тем, что при повышении температуры происходит плавление некоторых участков белковой молекулы, что может привести к необратимым изменениям структуры, в большинстве случаев - к потере функциональной активности. Каждое значение рН белка характеризуется соответствующим распределением зарядов, создаваемым ионогенными группами. При очень низких или высоких значениях рН распределение зарядов может существенно «поляризовать» молекулу белка, приводить к появлению изомеров, способных необратимо изменять конформацию. Нами была исследована кинетика кислотной и термической инактивации каталазы пше ничных зародышей, рассчитаны кинетические и термодинамические параметры этих процессов.
Исследование кислотной и термической инактивации проводили в интервале рН 4,0 - 8,0 при температурах 20 - 60 С. В процессе инактивации контролировали активность каталазы. По истечении определенных промежутков времени отбирали пробы и определяли активность фермента. Как увеличение в среде концентрации ионов Ґ, так и повышение температуры, ведет к интенсивной инактивации каталазы (табл. 3.4). Так, при температуре 20 С и рН 4,0 за 40 ч инкубации остаточная активность была 19,48 %, при рН 6,0 - 37,08 % и при рН 8,0 - 49,51 % (рис. 3.6). При температуре 30 С и рН 4,0, 6,0, 8,0 за 12 ч инкубации остаточная активность составила соответственно 8,30 %, 36,72 % и 60,56 % (рис. 3.7). При температуре 40 С и рН 4,0 за 4 ч инкубации остаточная активность составила 3,83 %, при рН 6,0 - 32,45 % и при рН 8,0 - 57,15 % (рис. 3.8). При температуре 50 С и рН 4,0, 6,0, 8,0 после 1,5 ч инкубации остаточная активность каталазы составила 2,58 %, 16,43% и 40,80 % соответственно (рис. 3.9). Повышение температуры до 60 С приводило к более резкой инактивации фермента (рис. 3.10).
Из данных таблицы 3.4 видно, что каталаза пшеничных зародышей проявляла наибольшую стабильность при рН 8,0 и температуре 20 С. Из данных табл. 3.4 видно, что кислотная инактивация каталазы зародышей пшеницы - типичная реакция первого порядка.
Исследование влияния ингибиторов на липазу, липоксигеназу и каталазу пшеничных зародышей
При изучении влияния данных кислот на липазу зародышей пшеницы в реакционную среду, содержащую раствор фермента, 50 мМ трис/HCl буфер (рН 8,0), вносили фумаровую или аскорбиновую кислоту до конечных концентраций 8, 20, 30 мМ/дм3. После добавления ингибитора контролировали рН. Далее вносили субстрат - эмульсию триацилглицерида рафинированного подсолнечного масла. Активность исследуемого фермента определяли при изменении концентрации масла в пределах 20-120 мМ/дм , принимая молекулярную массу подсолнечного масла 913 Да. Смеси инкубировали при непрерывном перемешивании 30 мин при температуре 37 С и определяли остаточную активность липазы. На рисунках 4.7 и 4.8 представлены результаты наших исследований зависимости активности липазы от концентрации масла в средах, содержащих различные концентрации соответственно фумаровой и аскорбиновой кислоты. На рисунках видно, что данные ингибиторы подавляют активность фермента. Чем выше их содержание, тем выше эффект ингибиторного действия.
Процесс ингибирования может быть обратимым и необратимым. В свою очередь, обратимые ингибиторы бывают конкурентного и неконкурентного действия [64, 68, 180]. Воспользовавшись методом Лайнуивера -Берка [64, 68, 109], по которому можно определить тип ингибирования, по данным рисунков 4.7 и 4.8 мы построили графики зависимости 1/v = f (1/[S]) (рисунки 4.9 и 4.10). На рисунках 4.9 и 4.10 видно: все графики на оси абсцисс пересекаются в одной точке. С увеличением содержания ингибиторов наклон графиков к оси абсцисс возрастает. Эти данные свидетельствуют о том, что фумаровая и аскорбиновая кислоты подавляют активность липазы по неконкурентному типу ингибирования. Неконкурентный ингибитор подавляет каталитическое превращение субстрата в продукты реакции. При неконкурентном торможении ингибитор связывается с ферментом на участке, отличающемся от центра связывания субстрата; при этом он деформирует этот центр, подавляя его каталитическую функцию. Ингибитор связывается либо с ферментом, либо с комплексом фермент-субстрат. То есть, когда в реакционной среде находятся и субстрат и ингибитор, они присоединяются к ферменту одновременно, не конкурируют за один и тот же центр связывания. Это можно представить в виде схемы (4.1) [68].
При изучении влияния аскорбиновой и фумаровой кислоты на липок-сигеназу зародышей пшеницы в реакционную среду, содержащую раствор липоксигеназы, 0,15 моль/дм фосфатно-цитратного буфера (рН 7,0), вносили фумаровую кислоту или аскорбиновую кислоту до конечных концентраций 8, 20, 30 мМ/дм3. После добавления кислоты контролировали рН. Далее вносили субстрат— рафинированное подсолнечное масло. Активность липоксигеназы определяли при изменении концентрации масла в пределах 20-120 мМ/дм3, принимая молекулярную массу подсолнечного масла 913 Да. В реакционной среде контролировали рН. Смеси инкубировали при непрерывном перемешивании 20 мин при температуре 30 С и определяли остаточную активность липоксигеназы.
Зависимости активности липоксигеназы от концентрации субстрата в средах, содержащих различные концентрации фумаровой или аскорбиновой кислоты представлены соответственно на рис. 4.11 и рис. 4.12. Из рисунков видно, что при увеличении концентрации кислот ингибирующий эффект усиливается.
Воспользовавшись методом Лайнуивера-Берка [64, 68, 109], по данным рис. 4.11 и 4.12 построили графики зависимости 1/v = f (1/[S]) для пшеничных зародышей, содержащий фумаровую кислоту (рис. 4.13) и аскорбиновую кислоту (рис. 4.14). Из рис. 4.13 и 4.14 видно, что фумаровая и аскорбиновая кислоты подавляют активность липоксигеназы, так же как и липазы, по неконкурентному типу ингибирования (4.1). Кинетика неконкурентного ингибирования описывается уравнением (4.2).
Константа Михаэлиса Км для липоксигеназы в присутствии фумаровой кислоты составляет: Для липоксигеназы в присутствии аскорбиновой кислоты константа Михаэлиса составляет Константа равновесия системы фермент-ингибитор К, вычисляется по формуле (4.3).
