Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор химический состав органической массы торфа 16
1.1. Химический состав битумов 16
1.2. Химический состав водорастворимых
и легкогидролизуемых веществ 26
1.3. Негидролизуемые вещества (лигнин) 32
1.4. Гуминовые вещества торфа 36
1.5. Природа биологической активности гуминовых кислот 58
1.5.1. Методы повышения биологической активности препаратов на основе гуминовых кислот .63
Выводы к главе 1 67
2. Методы анализа и аппаратура 68
2.1. Технический анализ 68
2.1.1. Определение влажности 68
2.1.2. Определение зольности 68
2.1.3. Элементный анализ 69
2.1.4. Эмиссионный спектральный анализ
2.1.5. Рентгено-флуоресцентный анализ 69
2.2. Групповой состав торфа 70
2.2.1. Определение содержания битумов 70
2.2.2. Определение содержания водорастворимых и легкогидролизуемых веществ 71
2.2.3. Определение содержания гуминовых кислот 72
2.2.4. Определение фульвокислот 73
2.2.5. Определение содержания трудногидролизуемых веществ (целлюлозы) и негидролизуемого остатка (лигнина) 73
2.2.6. Определение содержания редуцирующих веществ 74
2.3. Определение молекулярной массы .74
2.4. Функциональный анализ
2.4.1. Определение фенольных гидроксилов. 75
2.4.2. Определение спиртовых гидроксилов... , 75
2.4.3. Определение алкоксильных групп 75
2.4.4. Определение кетонных групп 75
2.4.5. Определение хиноидных групп 75
2.4.6. Определение карбоксильных групп 75
2.4.7. Определение гетероциклического кислорода 75
2.4.8. Определение общего основного азота 76
2.4.9. Определение йодного числа 76
2.4.10. Определение сложноэфирных групп и лактонов. 76
2.5. ИК-спектроскопия 76
2.6. Электронная спектроскопия 77
2.7. Дифференциально-термический анализ 77
2.8. Капиллярная газожидкостная хроматография (КГЖХ) 77
2.9. Структурно-групповой анализ 78
2.10. Тонкослойная хроматография (ТСХ) фульвокис-лот
2.10.1. ТСХ аминокислот 78
2.10.2. ТСХ углеводов ,...79
2.10.3. ТСХ водорастворимых карбоновых кислот 79
2.11. Методы химической модификации гуминовых кислот 80
2.11.1. Обработка гуминовых кислот азотной кислотой и пероксидом водорода 80
2.11.2, Галоидирование гуминовых кислот 81
2.11.2.1. Хлорирование гуминовых кислот. 81
2.11.2.2. Бромирование гуминовых кислот 81
2.11.2.3. Йодирование гуминовых кислот 82
2.12. Определение галогенов в гуминовом препарате 83
2.12.1. Поглощение хлора и брома 83
2.12.2. Поглощение йода 84
2.13. Определение биологической активности 84
2.13.1. Определение биологичсекой активности дрожжевым тестом 84
2.13.2. Определение антибактериальной активности 85
3. Экспериментальная часть химический состав гуминовых кислот торфа (Емельяновский район, Тверская область) 87
3.1. Характеристика исходного торфа 87
3.2. Характеристика фульвокислот 87
3.3. Химический состав гуминовых кислот. 88
3.4. Адсорбционная жидкостная хроматография 94
Выводы к главе 3 129
4. Химическая модификация торфяных гуминовых кислот 131
4.1. Модификация гуминовых кислот азотной кислотой 131
4.1.1. Влияние концентрации азотной килсоты на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность 131
4.1.2. Влияние продолжительности обработки ГК азотной кислотой на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность 133
4.1.3. Влияние температуры обработки ГК
азотной кислотой на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность 129
4.2. Модификация гуминовых кислот пероксидом водорода , 135
4.2.1. Влияние концентрации Н2Ог на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность 135
4.2.2. Влияние температуры обработки гуминовых кислот Н2О2 на выход ГП, его струткурные параметры
и биологическую активность 137
4.2.3. Влияние продолжительности обработки гуминовых кислот Н2О2 на выход ГП, его структурные парамет ры и биологическую активность 139
3. Модификация ГК хлором 141
4.3.1. Влияние продолжительности хлорирования на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность 141
4.3.2. Влияние температуры хлорирования на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность 143
4. Модификация гуминовых кислот бромированием 143
4.4.1. Влияние продолжительности бромирования на выход ГП, его струткурные параметры и биологическую активность 143
4.4.2. Влияние температуры бромирования на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность 147
4.5. Модификация гуминовых кислот иодированием 149
4.5.1. Влияние продолжительности иодирования на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность 149
4.6. Сравнительная характеристика методов химической модификации ГК 151
4.7. Влияние природы галогена
на биологическую активность ГП 154
4.8. Антибактериальная активность ГП 156
Выводы к главе 4 163
Выводы... 165
Литература
- Методы повышения биологической активности препаратов на основе гуминовых кислот
- Определение содержания битумов
- Химический состав гуминовых кислот.
- Влияние продолжительности бромирования на выход ГП, его струткурные параметры и биологическую активность
Методы повышения биологической активности препаратов на основе гуминовых кислот
С целью получения более детальной структурной информации при изучении компонентного состава смолы торфяного воска проводят его разделение на воск, смолу и парафины.
П. Белькевич и др. [13] на колонке с оксидом алюминия (III) разделили торфяные парафины на шесть узких фракций, которые затем дополнительно разделялись ТСХ на силикагеле. В составе отдельных фракций были обнаружены н- и изоалканы, сложные эфиры, 3-ситостерин, спирты, ке-тоны, соединения с сопряженными связями (полиеновые и ароматические структуры), смесь кислот смешанного строения, эфирокислоты.
Авторы [14] методами полученных адсорбционной жидкостной хроматографией (АЖХ) на силикагеле L 100/250, КГЖХ, масс-спектрометрии (МС), ИК-спектроскопии подробно изучили состав сложных эфиров спир торастворимой части смолы торфяного воска. Показано присутствие сложных эфиров терпенов, алифатических спиртов н-строения С12-С34, с доминированием Cjg, С20 и С22. Исследование тритерпенов методом МС показало наличие смеси двух стеринов с молекулярными массами 414 (J3-ситостерин) и 400 (компастерин). Жирные кислоты представлены алифатическими н-строения C16-C32, с преобладанием С2з, С25 и С27, и изострое-ния С15-С33, с преобладанием С24, Сгб и Сгв Изучению химического состава свободных кислот, выделенных из нейтральной фракции спирторастворимой части смолы торфяного воска, посвящена работа [15]. После ацилирования данная фракция АЖХ на оксиде алюминия (III) была разделена на несколько субфракций, отдельные из которых дополнительно подвергались ТСХ на силикагеле КСК. Согласно данным ИК- и МС-спектроскопии в отдельных субфракциях присутствуют: циклический углеводород С30Н50 (гексановая фракция), ацетаты свободных алифатических и циклических спиртов (бензол). Методами ГХ и МС-спектрометрии в составе полученных фракций были идентифицированы алифатические спирты н-строения С12-С27, причем преобладали гомологи с нечетным числом атомов углерода. В хлороформной фракции установлено наличие ацетатов циклических спиртов, которые в основном представлены ацетатами стеринов и спиртов изостроения: Сп-Сзв с доминированием четных гомологов С26 и С28- растворимая при температуре - 10 С часть смолы торфяного воска представлена: углеводородами с три- и дизамещенными ненасыщенными группировками типа скваленов и стероидов, спиртами, насыщенными кетонами, а, р-ненасыщенными эфира-ми, кетонами, хинонами, оксикетонами, сложными эфирами, ароматическими структурами, отвечающих, вероятнее всего, жирноароматическим, алифатическими кислотами изостроения, эфирокислотами.
Согласно [16] нейтральную часть бензиновых экстрактов сосново-пушицевого торфа со степенью разложения 40 % составляют: углеводороды, сложные эфиры, карбонильные соединения, алифатические и циклические спирты (стерины), а, р -ненасыщенные карбонильные соединения, красящие вещества, перешедших в экстракты из растений-торфообра-зователей.
Авторы [17] экстракцией, ионообменной и ТСХ на силикагеле, КГЖХ и ИК-спектроскопией подробно изучили торфяной воск. Кислотная часть воска переводилась в метиловые эфиры, а затем разделялась ТСХ на силикагеле с выделением предельных и непредельных соединений. Метиловые эфиры предельных кислот карбамидом в метаноле делили на алифатические кислоты н-строения, а также изостроения и циклические. КГЖХ в составе первых были идентифицированы компоненты С}б-Сз2; непредельных кислот с одной двойной связью С16-С24, с преобладанием Qg; непредельных кислот с двумя двойными связями С14-С20, с преобладанием Cjg. В составе ароматических кислот преобладает бензойная. Нейтральная часть воска представлена углеводородами, сложными эфирами, спиртами н-строения С12-С34, изостроения и циклическими (стеринами) - Р-ситостерин, компастерин и другие (12.9 %). Согласно КГЖХ во фракции углеводородов присутствуют н-алканы С21-С33, пентациклические Сзо,зі с одной двойной связью (тритерпены и другие). Кроме того, идентифицированы каро-тиноиды, представленные кислородсодержащими соединениями типа фу-коксантинов; эстрогенные вещества фенольного характера. Сложные эфи-ры состоят из спиртов н-строения С12-С34, стеринов (Р-ситостерина и ком-пастерина) и других полициклических спиртов, ароматических кислот (коричная и бензойная), алифатических кислот н-строения С16-С32 и изострое-нияСі5-Сзз П. Белькевич [18] в составе экстракта (петролейный эфир - бензол) торфяного воска идентифицировал и выделил в индивидуальном виде циклический кетон - фриделин, циклический спирт - стерин, а также смеси углеводородов различной природы, алифатических спиртов, кетос-пиртов, полярных ненасыщенных соединений.
Результаты исследования [19] показали, что в составе фенолсодержащей фракции смолы торфа присутствуют эстрогенные соединения фенольного характера (фенолы с кетогруппой в боковой цепи) и фенолкарбо-новые кислоты, а также циклический углеводород СзоН5о.
Определение содержания битумов
Эмиссионные спектры были сняты на спектрографе ИСП-30 с кварцевым трехлинзовым конденсором. Электроды угольные, безборные, выточенные в форме рюмочки (ЧССР). Дуговой промежуток 1.5 мм; ширина щели спектрографа 10 мкм; пластинки спектрографические, тип ЭС, проявитель - контрастный, метолгидрохиноновый, экспозиция 10 мин. Расшифровка спектрограмм осуществлялась с помощью атласа спектров, прилагаемого к прибору. Фотометрирование плотности почернения линий элементов для полуколичественной оценки их содержания проводилось на микрофотометре типа МФ-2.
Рентгено-флуоресцентный анализ минеральной части торфа, ГК, их узких фракций, ГП выполнялся на спектрометре рентгеновском многоканальном флуоресцентном СРМ-25 (ГОСТ 15150-69) способом разложения рентгеновского излучения в спектр кристаллофракционный с применением кристаллов - анализаторов по схеме Иогансена и отдельных по схеме Ио-гана. Источником рентгеновского излучения служит рентгеновская трубка типа 3 PXB2-Rh. Режим работы трубки: Ua = 40 KV; Ja = 20 mA. Процесс анализа полностью автоматизирован с момента установки пробы до выдачи результатов анализа на ленте печатающего устройства.
Для оценки химического состава торфа использовался метод Инстор-фа [199], согласно которому навеска сухого торфа последовательно обрабатывается бензолом; 4%-ной НС1; 0.1 н NaOH и 80%-ной H2SO4. В ходе анализа выделяются: битумы, водорастворимые и легкогидролизуемые вещества, гуминовые и фульвокислоты, целлюлоза и негидролизуемый остаток (лигнин).
Анализ ведется в аппарате Грефе в присутствии бензола. Для навески торфа изготавливают гильзу из плотной фильтровальной бумаги (d=35 мм, 1=100-120 мм). Готовую гильзу помещают в марлевый мешочек, сшитый из двух слоев марли и подвешивают на крючки в пробке холодильника в аппарате Грефе. В среднем экстракция продолжается 10-12 часов. Бензольную вытяжку битумов переводят количественно в колбу для отгонки бензола, соединенную с холодильником Либиха и приемником растворителя. Остаток после отгонки бензола переносят количественно во взвешенный на аналитических весах бюкс, который помещают в вакуум-шкаф при 40
Торф, освобожденный от битумов, переносят из гильзы (2.2.1) в литровую колбу Эрленмейера, в которую добавляют 4 %-ную НС1 из расчета 20 мл НС1 на 1 г исходной навески. Кислоту добавляют порциями, стараясь взбалтыванием смочить торф. Колбу соединяют с обратным холодильником и помещают в кипящую водяную баню. Гидролиз продолжается 5 часов. Для полноты гидролиза содержимое колбы время от времени встряхивают. Содержимое колбы фильтруют через двойной бумажный фильтр. В фильтрате определяют содержание Сахаров (редуцирующих веществ).
Содержание водорастворимых и легкогидролизуемых веществ в торфе (мае. % на органическую массу торфа): ВРиЛГ=100-Б-Сог где Gor - остаток гидролиза. 2.2.3. Определение содержания гуминовых кислот
От остатка торфа, освобожденного от битумов, водорастворимых и легкогидролизуемых веществ, берется навеска 4 г и переносится в колбу (1 л) Эрленмейера. К навеске добавляют 0.1 н NaOH из расчета 150 мл на 1 г навески. Колбу с содержимым ставят в водяную баню и выдерживают в течение 1 часа при 80 С, после чего колбу вынимают из бани и дают отстояться торфу в течение суток, после чего раствор отделяют посредством сифона. Обработку торфа проводят трехкратно. Все три порции гуматов соединяют вместе, а остаток торфа 3-4 раза промывают водой. Водные растворы добавляют к гуматам.
В колбу с гуматами приливают 10 %-ную НС1 из расчета 20 мл кислоты на 1 л гуматов (до сильно кислой реакции). Выпавшим гуминовым кислотам дают осесть и по возможности отделяют раствор фульвокислот. Гуминовые кислоты фильтруют через абсолютно сухой беззольный фильтр.
Гуминовые кислоты на фильтре промывают дважды 0.5 %-ной НС1, затем холодной водой отмывают до нейтральной реакции.
Гуминовые кислоты с фильтром подсушивают на воздухе, помещают во взвешенный бюкс и сушат до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 80 С. Высушенные гуминовые кислоты с фильтром помещают во взвешенный тигель и озоляют в муфельной печи при 800 С в течение 2 часов.
Химический состав гуминовых кислот.
Выход отдельных элюатов ГК и их структурные параметры даны в табл. 3.4.1. Основу исходных ГК составляют группы соединений десорбируемые смесью этанола и уксусной кислоты (83.55 мае. %). Молекулярная масса элюатов изменяется (а.е.м) от 455 до 2205; содержание углерода - от 86.3 до 39.2; водорода - от 13.5. до 2.6; азота - от 6.5 до 0.3; кислорода, серы -от 57.6 до 4.6 (мае. % daf); ФГ - от 23.80 до 0.83; ХГ - от 11.25 до 0.36; КГ - от 21.60 до 0.45; КрГ - от 33.95 до 0.15; СЭГ, ЛК - от 2.03 до 0.03 (мг-экв/г); степень ароматичности - от 0.86 до 0.02; нафтеновости - от 0.24 до 0.03; алкильной замещенности - от 0.95 до 0.08. Согласно ИК-, УФ/ВИС-спектроскопии полученные элюаты значительно различаются структурой соединений, определяющих их состав. Так, например, циклоалканы, гидроароматические компоненты, терпены, азотсодержащие структуры с доминированием пиррольных и пиперидиновых циклов, концентрируются в хлороформных элюатах; стероидные спирты, кетоны - в этанольных, для которых также характерно высокое содержание фенолов, спиртов, сложных эфиров и лактонов. Длинноцепные алканы десорбируются н-гексаном, бензолом; уксуснокислотные элюаты обогащены конденсированными ароматическими соединениями - производными антрацена, фе-нантрена, пирена, хризена, флуорантена, замещенными широким набором функциональных групп.
Элюаты различаются содержанием и качественным составом минеральной части, в которой были обнаружены: Si, Al, Zn, Си, Pb, Mn, Fe, Ni, V, Mo, Ge, Zr, Cr, Co, Ga, Nd, Ce, La, Au, Ag, Pt, Pd. ИК-, УФ/ВИС-спектроскопией установлено, что отдельные металлы связаны в форме солей карбоновых кислот, фенолятов, металлопорфиринов; отдельные металлы коррелируются со строго определенными структурными фрагментами ГК. Так, например, Си, Со, Ni, V концентрируются в хлороформных элюатах, обогащенных гетероциклическим азотом. В этанольных и уксус-нокислотных элюатах высокая концентрация V, Fe, Zr, Cr, что обусловлено обогащенностью данных элюатов фенольными, хиноидными, карбоксильными и кетонными группами, гетероциклическими формами кислорода, азота и серы.
Согласно ИК-, УФ/ВИС-спектроскопии в элюатах (5, 6, 7, 5.4, 6.4, 7.4 и 8.4) (рис. 3.3.3) сконцентрированы стероидные структуры. Для установления их структуры была выполнена препаративная ТСХ в следующих оптимальных условиях: пластинки "Силуфол". Оптимальная система растворителей: I -хлороформ; II - хлороформ-ацетон-этанол (20:1:0.5), об.; длина пробега - 150 мм. После элюирования пластины высушивались в среде аргона, размечались в лучах аналитической УФ-лампы (1=366 и 254 нм), разрезались на отдельные полоски, которые обрабатывались ацетоном, а его отгоняли на водяной бане. Полученные узкие фракции высушивались в вакуумном шкафу, взвешивались и анализировались методами криоскопии, элементного, количественного функционального, структурно 128 группового анализов, ИК-, УФ-спектроскопии, капиллярной газожидкостной хроматографии, обобщение данных которых позволило вывести гипотетические структурные формулы соединений.
Для концентрирования разбавленных растворов стероидов был использован метод [281], заключающийся в следующем. Пробу наносят на короткий кусочек фильтровальной бумаги, который имеет форму узкого треугольника. Основание этого треугольника погружают в ацетон, и пятно стероида или другого соединения перемещается вместе с растворителем к узкой вершине треугольника. Бумагу вынимают из растворителя, сушат и повторяют всю процедуру до тех пор, пока в вершине треугольника не сконцентрируется требуемое количество вещества. После этого кончик бумаги помещают на тонкослойную пластинку и постепенно элюируют с него исследуемое вещество ацетоном.
Были идентифицированы: (З-ситостанол и (3 -ситостерин (II), а также (З -стигмастерин (I), подтвержденные рективом Сальковского (уксусный ангидрид + серная кислота), окрашивающим органический слой в крваво-красный цвет с переходом в пурпурно-красный в присутствии {3 -ситостанола, (3 -стигмастерин - оранжевый, (3 -ситостерин - красный.
Таким образом, использование адсорбционной жидкостной и препаративной тонкослойной хроматографии позволяет получать узкие фракции ГК, и даже индивидуальные соединения, обогащенные соединениями со строго определенной структурой, являющимися активными биостимуляторами.
Влияние продолжительности бромирования на выход ГП, его струткурные параметры и биологическую активность
Температура хлорирования ГК варьировалась от 20 до 40 С, продолжительность хлорирования - 5 час.
Из табл. 4.3.2.1. видно, что температура является важным параметром при хлорировании ГК. Изменение температуры в пределах 20 - 40 С уменьшает выход ГП от 63.5 (20 С) до 46.8 (40 С), мае. % от ГК, молекулярная массу ГП - от 451.2 до 348.2, которая в 2.3-2.95 раза меньше чем для исходных ГК.
С увеличением температуры отмечается рост содержания: ФГ - от 5.49 до 6.67; ХГ - от 0.56 до 1.21, а также уменьшение - КрГ - от 0.43 до 0.37; КГ - от 0.28 до 0.05; ИЧ - от 0.05 до 0.02, мг-экв/г. Одновременно увеличивается БА гуминовых препаратов от 1.5 до 2.3, что можно объяснить как повышением общего содержания хлора и функциональных групп (ФГ и ХГ) в составе ГП, так и существенным уменьшением его молекулярной массы.
Оптимальные условия хлорирования ГК: температура - 20 С, продолжительность реакции - 1 час. Из табл. 4.4.1.1 следует, что при изменении продолжительности бромирования ГК от 0.5 до 6.0 час возрастает массовая доля брома в полученном ГП - от 3.80 (0.5 час) до 12.0 мае. % (6 час); уменьшается выход ГП -от 86.3 до 64.3 мае. % от ГК, а также их молекулярная масса - от 1062.4 до 562.2. сравнение значений молекулярной массы исходных ГК, равной 1027.0 и ГП позволяет сделать вывод, что в пределах 0.5-1.0 час наблюдается присоединение брома, например, по кратным связям и молекулярная масса ГП увеличивается от 1027.0 до 1184.2. Дальнейшее повышение продолжительности обработки ГК бромом интенсифицирует процессы окислительной деструкции их молекул до более низкомолекулярных продуктов.
Увеличение продолжительности действия брома на ГК вызывает рост содержания таких функциональных групп как ФГ и ХГ: от 4.05 до 4.94 и от 1.45 до 1.62 мг-экв/г, соответственно, а также уменьшение КрГ - от 0.38 до 0.28, КГ - от 0.30 до 0.06, ИЧ - от 0.21 до 0.08, мг-экв/г. БА гуминовых препаратов постоянно повышается от 1.1 до 1.8.
При температуре 40 С соблюдаются, в основном, все закономерности отмеченные для 20 С. Б А гуминовых препаратов, полученных при температуре 40 С выше (табл. 4.4.1.2).
Таблица 4.4.1.1 Влияние продолжительности бромирования на выход ГП, его структурные параметры и биологическую активность (температура - 20 С) Время, час Массовая доля брома вГП,% Выходгп,мае. % отГК Структурные параметры. Биологическая активность
Из табл. 4.4.2.1 видно, что при повышении температуры от 20 до 40 С содержание брома в ГП возрастает от 5.81 до 13.67 мае. %, выход и молекулярная масса ГП падают от 80.8 до 74.1 мае. % от ГК и от 1184.2 до 695.2, соответственно. Содержание ФГ и ХГ при увеличении температуры постоянно растет от 4.65 до 5.41 и от 1.51 до 1.81 мг-экв/г, соответственно, а КрГ, КГ и ИЧ уменьшается; Б А гуминовых препаратов возрастает от 1.3 до 1.7. Повышение продолжительности бромирования ГК до 6 час в интервале температур 20-30 С позволило, в основном, установить выше рассмотренные закономерности. Однако, при 40 С сократились доля брома в ГП - от 19.48 до 15.11 мае. %, содержание ХГ - от 1.32 до 0.88.
БА гуминовых препаратов, полученных при продолжительности бромирования ГК равной 6 час выше, чем при 1 час. Она изменяется от 1.8 (20 С) до 2.6 (40 С), что, по-видимому, объясняется значительным уменьшением молекулярной массы ГП (табл. 4.4.2.1 и 4.4.2.2).
Оптимальные условия модификации ГК бромированием: температура - 20 С, продолжительность реакции - 2 часа.
Продолжительность иодирования ГК варьировалась от 2 до 15 час, температура 50 С. Из табл. 4.5.1.1 видно, что внедрение иода в ГК весьма несущественно. Его массовая доля в ГП изменяется от 0.98 (2 час) до 2.10 % (10 час). Повышение продолжительности иодирования до 15 час вызывает уменьшение массовой доли йода в ГП до 1.88 %. По-видимому, в интервале времени от 2 до 10 час протекают реакции присоединения йода, например, по кратным связям, что указывает на сокращение количества последних от 0.18 до 0.13, мг-экв/г, а затем йод действует как окисляющий агент, вызывая деструкцию ПК и уменьшение молекулярной массы, образующихся ГП от 1432.1 до 941.5. Кроме того, возможно протекание реакции дегидрогалоидирования с выделением иодоводорода, а в составе ГП увеличение содержание непредельных связей (табл. 4.5.1.).
Увеличение продолжительности обработки ГК йодом, в основном, понижает содержание ФГ, КрГ, но повышает - ХГ и КГ, что несомненно связано с особенностями процесса иодирования ГК. БА гуминовых препаратов растет с увеличением в них массовой доли йода от 1.8 (0.98) до 2.8 (2.10)%.
