Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор. химический состав и биологическая активность сапропелей
1.1. Природа сапропелеобразователей 11
1.2. Органическое вещество сапропелей 18
1.2.1. Элементный состав сапропелей 18
1.2.2. Групповой состав сапропелей 21
1.2.3. Битумы сапропелей 23
1.2.4. Гидролизуемые вещества и негидролизуемый остаток сапропелей 31
1.2.5. Гуминовые кислоты сапропелей 33
1.3. Биологическая активность сапропелей 43
2. Объект исследованіія, методы и аппаратура
2.1. Технический анализ сапропеля 57
2.2. Элементный анализ 57
2.3. Дифференциально-термический и дифференциально-термогравиметрический анализ 58
2.4. Рентгено-флуоресцентный анализ 58
2.5. Эмиссионный спектральный анализ 58
2.6. Электронная спектроскопия 58
2.7. ИК-спектроскопия 59
2.8. 'Н-ЯМР-спектроскопия 59
2.9. Адсорбционная жидкостная хроматография (АЖХ) 60
2.10. Препаративная тонкослойная хроматография (ТСХ) 60
2.11. Функциональный анализ 60
2.11.1. Определение фенольных гидроксилов 60
2.11.2. Определение йодного числа 61
2.11.3. Определение хиноидных групп 61
2.11.4. Определение кетонных групп 61
2.11.5. Определение карбоксильных групп 61
2.12. Криоскопия 61
2.13. Экстракция сапропеля 62
2.14. Щелочной и кислотный гидролиз сапропеля 62
2.15. Методика биологического тестирования сапропелевых препаратов 62
3. Экспериментальная часть. изучение химического состава органической массы сапропеля оз. глубокое (республика татарстан)
3.1. Характеристика сапропеля 64
3.2. Схема изучения органической массы сапропеля (ОМС) 68
3.3. Водный экстракт и гидролизаты 68
3.3.1. Водный экстракт 68
3.3.2. Гидролизаты 68
3.4. Экстракты сапропеля 73
3.4.1. Гексановый экстракт 74
3.4.2. Толуольный экстракт 80
3.4.3. Хлороформный экстракт 85
3.4.4. Ацетоновый экстракт 90
3.4.5. Этанольный экстракт 95
3.5. Адсобционная жидкостная хроматография экстрактов 100
3.5.1. Хлороформный экстракт 100
3.5.1.1. Бензольный элюат 100
3.5.1.2. Толуольный элюат 106
3.5.1.3. Хлороформный элюат 111
3.5.1.4. Ацетоновый элюат 119
3.5.1.5. Этанольный элюат 125
3.5.1.6. Уксуснокислотный элюат 129
3.5.2. Этанольный экстракт 134
3.5.2.1. Бензольный элюат 134
3.5.2.2. Хлороформный элюат 142
3.5.2.3. Ацетоновый элюат 147
3.5.2.4. Этанольный элюат 154
3.5.2.5. Уксуснокислотный элюат 158
3.6. Химический состав гуминовых кислот 164
3.6.1. Адсобционная жидкостная хроматография гуминовых кислот 171
3.6.1.1. Хлороформный элюат 171
3.6.1.2. Ацетоновый элюат 176
3.6.1.3. Этанольный элюат 179
3.6.1.4. Уксуснокислотный элюат 185
3.7. Химический состав фульвокислот 194
3.7.1. Тонкослойная хроматография фульвокислот 196
3.7.1.1. Аминокислоты 196
3.7.1.2. Сахара 197
3.7.1.3. Водорастворимые карбоновые кислоты 197
4. Биологическая активность препаратов на основе сапропеля оз. глубокое (республика татарстан)
4.1. Биологическая активность солей гуминовых кислот 199
4.2. Биологическая активность фульвокислот 200
4.3. Биологическая активность водорастворимых веществ 202
4.4 Сапропелевые препараты - стимуляторы роста растений 203
4.5. Практические рекомендации по использованию результатов рабо ты 205
Выводы к главе 4 207
Выводы 209
Литература 212
- Органическое вещество сапропелей
- Элементный анализ
- Схема изучения органической массы сапропеля (ОМС)
- Биологическая активность фульвокислот
Введение к работе
Сапропели - сложные органические, органоминеральные комплексы веществ, формирующиеся в результате биохимических, микробиологических механических процессов из остатков отмирающих растительных и животных организмов и привносимых в водоемы органических и минеральных примесей с отличной от торфов тонкой структурой и более низким содержанием органического вещества (ОВ) [1].
Сапропелевые отложения представляют одно из характернейших образований галоценового периода - самой молодой геологической эпохи, и в них ярко отразилось развитие геологических и климатических условий, изменение ландшафта, растительного покрова после отступления ледника.
Основным процессом в сапропелеобразовании является разложение исходного растительного и животного органического материала, главным образом под влиянием микроорганизмов; а также синтез последними новых соединений, необходимых для собственной жизнедеятельности, которые, ровно как и продукты их метаболизма, остаются в формирующей сапропелевой залежи.
Механизм конкретных превращений, протекающих при преобразовании исходного биологического материала в сапропель до настоящего времени остается наименее изученным. Единственным исключением являются механизмы биохимических превращений жиров и белков, входящих в состав водорослей. Скопления водорослей гидролизуются с образованием жирных кислот, которые частично полимеризуются до циклических кислот, затем декарбоксилирующихся до углеводородов. Другая часть жирных кислот переходит в углеводороды и кетоны без полимеризации. При гидролизе белковых веществ образуется смесь аминокислот, декарбоксилирующихся под действием гнилостных бактерий; протекают процессы дезаминирования и восстановления аминокислот в жирные кислоты, окисление в альдегиды, разрушение под действием бактерий, взаимодействие с углеводами. Аминокислоты могут рассматриваться также в качестве возможного предшественника циклических кетонов и гетероциклических азотсодержащих соединений в результате конденсации с альдегидами и оксипроизводными. Существенная роль принадлежит и макрорастениям с высоким содержанием углеводов.
Сложные биохимические процессы, протекающие при генезисе сапропеля, обуславливают большое разнообразие химического состава его органической массы (ОМ). Исчерпывающие и детальные исследования последней для широкого набора сапропелей до сих пор практически отсутствуют.
В составе ОМ сапропелей определены битумы, водорастворимые, легкогидролизуемые и гуминовые вещества, целлюлоза, лигнин, липиды, ароматические эфиры, каротиноиды, ксантофиллы, спирты, кислоты, стерины, производные хлорофилла, фосфолипиды, углеводороды. Состав углеводно-уронового комплекса представлен гексозами (глюкоза, галактоза, манноза), пентозами (ксилоза, арабиноза) и уроновыми кислотами. В гидролизатах сапропелей идентифицированы аминокислоты, среди которых доминируют аспарагиновая и глутаминовая, глицин, пролин, L-a-аланин, гистидин, лизин, аргинин. Особенностью гуминовых кислот (ГК) является их обогащенность аминокислотами, полипептидами, 5-й 6-членными азотсодержащими гетеро-циклами, пигментами, каротиноидами, витаминами, стеринами, металлопорфиринами. Данный спектр соединений определяет высокую биологическую активность как ГК так и сапропеля в целом, что определило сферы использования последнего.
Сапропель давно применяется в медицине и ветеринарии, оказывая положительное влияние на нервную, эндокринную, сердечно-сосудистую системы, улучшает состояние опорно-двигательного аппарата, стимулирует процессы метаболизма в печени. Наличие в сапропеле антибиотиков и отсутствие патогенных микроорганизмов обеспечивает быстрое прекращение воспалительных процессов и хорошее излечение экзем, дерматитов, ожогов. Успешно лечатся различные флегмоны, маститы, фурункулезы, хронические гастриты, язвенные болезни желудка и двенадцатиперстной кишки за счет усиления фагоцитарной активности лейкоцитов в крови, регенерации ткани. Исследования в области микробиологии позволили установить мутагенные изменения, возникающие при использовании ряда синтетических антибиотиков, затрагивающие генетический материал и передающиеся по наследству. Следовательно, заранее предсказать эффект применения многих промышленных лекарственных препаратов невозможно. Избежать указанных недостатков позволяет использование сапропелей, которые нетоксичны, содержат уникальный набор биологически активных соединений, включая оптически активные D- изомеры, практически полностью усваиваемые живыми организмами.
Велика роль сапропелей в сельском хозяйстве, технике, нефтяной, газовой и химической промышленности, строительстве. Являясь экологически чистым органоминеральным удобрением, сапропели не только существенно повышают урожайность самых различных сельскохозяйственных культур, но и улучшают качество продукции. Сапропели, содержащие в своем составе макро- и микроэлементы, разнообразные биологически активные соединения, способствующие активизации физиологических процессов в организме животных, более полному усвоению питательных веществ кормов, позволяют значительно повысить производство молока и мяса. При скармливании сапропелей нормализуется деятельность важнейших систем и органов животного: кроветворения, кровообращения, печени, желудка, вследствие чего снижается заболеваемость, повышается устойчивость к неблагоприятным воздействиям внешней среды.
Перечисленное выше убедительно доказывает актуальность и своевременность выполнения данного исследования.
Объектом работы являлся сапропель озера Глубокое (Республика Татарстан), который ранее не изучался.
В работе ставились следующие задачи: выполнить подробное комплексное исследование вещественного состава сапропеля, установить особенности структурной организации соединений ОМ, качественный и количественный состав минеральной части, провести биологическое тестирование отдельных сапропелевых продуктов, выявить взаимосвязь химического состава последних с их биологической активностью, наметить рациональные пути применения сапропеля и препаратов на его основе.
Для решения перечисленных выше задач необходимо: обобщить и критически проанализировать имеющиеся в литературе данные о химическом составе органической и минеральной частей сапропелей, классификации, генезисе, составе исходного биологического материала и его взаимосвязи с компонентами сапропелей; разработать схему разделения сапропеля на узкие фракции, различающиеся значением молекулярной массы, элементным и функциональным составом; выполнить биологическое тестирование различных сапропелевых препаратов, установив взаимосвязь химического состава последних с их биологической активностью; предложить пути рационального использования сапропеля, а также продуктов на его основе.
В первой главе диссертации приведен перечень и химический состав биологического материала, участвовавшего в сапропелеобразовании; обобщены данные о химическом составе различных групповых составляющих ОМ сапропелей: битумов, водорастворимых, легко- и трудногидролизуемых веществ, гуминовых и фульвокислот; структурной организации гуминовых кислот. Особое внимание уделено соединениям, обуславливающим биологическую активность сапропелей и препаратов на их основе; подробно рассмотрены наиболее перспективные направления использования сапропелей.
Однако, несмотря на наличие большого количества литературных сведений, до сих пор отсутствуют работы посвященные детальному комплексному изучению особенностей структурной организации различных соединений, определяющих химический состав ОМ сапропелей, а также установлению взаимосвязи последнего с биологической активностью. Это подтверждает целесообразность и своевременность проведения настоящего исследования.
Во второй главе приведены объект и методики исследования, экспериментальное оборудование.
Третья глава посвящена комплексному изучению вещественного состава сапропеля оз. Глубокое (Республика Татарстан), с привлечением технического, элементного, эмиссионного спектрального, рентгено-флуоресцентного, дифференциально-термического и дифференциально-гравиметрического, структурно-группового и количественного функционального анализов, ИК-, УФ/ВИС-, Н-ЯМР-спектроскопии, криоскопии, адсорбционной жидкостной и тонкослойной хроматографии, экстракции водой и органическими растворителями, кислотно-щелочного гидролиза. Приведены данные указанных методов анализа, полученные при изучении исходного сапропеля, различных экстрактов и гидролизатов, минеральной части. В составе ОМ сапропеля идентифицированы аминокислоты, сахара, водорастворимые карбоновые кислоты; каротиноиды, производные хлорофилла, витамины, спирты, фенолы, флавоноиды, углеводороды; пиридиновые, хинолиновые, пиперидиновые, пиррольные, тиофеновые, фурановые гетероциклические соединения, метал-лопорфирины, хиноны, стерины, терпены.
Гуминовые кислоты характеризуются достаточно высокой молекулярной массой и полифункциональностью, определяемой наличием фенольных, карбоксильных, кетонных, хиноидных, сложноэфирных групп и лактонов, лактамов. Основная часть соединений связана с макромолекулой ГК легкогидролизуемыми сложноэфирными, пептидными и гликозидными связями, при расщеплении которых выделяются аминокислоты, сахара, водорастворимые карбоновые кислоты и другие компоненты, большинство из которых обладают высокой биологической активностью.
Отдельные экстракты и ГК методом адсорбционной жидкостной хроматографии были разделены на большое число узких фракций, значительно различающихся молекулярной массой, элементным и функциональным составом, содержанием биологически активных соединений: производных хлорофилла, каротиноидов, 71- комплексов металлов с фенольными и хиноидными группами, витаминов, флавоноидов, азот- и кислородсодержащих гетероциклических соединений.
Минеральная часть исходного сапропеля, а также экстрактов, гуминовых кислот отвечает участию в сапропелеобразовании каолинита, монтмориллонита, галлуазита, нонтранита, гиббсита, хлорита, биотита и других минералов.
В четвертой главе приведены данные биологического тестирования гуминовых и фульвокислот, а также водорастворимых соединений и установление взаимосвязи с химическим составом последних.
Биологическое тестирование проводилось на штаммах кишечных микроорганизмов: Escherichia coli, Shigella sonnie, С. freundii, грамположителъных кокков - Staphylococcus aureus и грибов рода Candida. Из высокотребовательных к питательным веществам культур, изучался штамм Corynebacterium diphtheriae gravis, который растёт на средах с добавлением нативного белка крови.
Установлена четкая взаимосвязь проявления биологической активности сапропелевых препаратов с наличием в их составе комплексов с металлами переменной валентности (в хлорофиллах, л-комплексах; хиноидными, фенольными, карбоксильными группами); усиление роста колоний бактерий при наличии большого количества янтарной (30.0), галловой (0.5), феруловой (0.5) и метилянтарной (8.8) кислот; ингибирующим действием на бактерии Е. coli и St. Aureus терефталевой (0.1), бензойной (0.6) и салициловой (1.0) кислот (мг / кг сапропеля).
Результаты полевых испытаний сапропелевых ГК в качестве удобрения показали, что они являются активными стимуляторами роста различных сельскохозяйственных культур, способствуя существенному увеличению урожайности, улучшению биохимических показателей продукции (снижение содержания нитратов, повышение клейковины, крахмала, сахара, витаминов, каротина), увеличение устойчивости культур к различным заболеваниям.
Предложены пути рационального использования сапропеля и препаратов на его основе.
Органическое вещество сапропелей
Понятие "органическое вещество сапропеля" в литературе имеет несколько определений. Одни ученые рассматривают "органическое вещество" как совокупность аморфного детрина и остатков водорослей, животных и высших растений различаемых под микроскопом [80], т.е. по сути сумму биологической и органической компоненты; другие - не затрагивают надмолекулярный уровень организации материи. Согласно определению Е. Степановой: "Органическое вещество (ОВ) сапропелей это комплекс низкомолекулярных органических соединений и биополимеров как в свободном виде, так и в виде гетерополярных солей, комплексно - гетерополярных солей и адсорбционных комплексов с минеральной частью" [81].
В настоящее время большинство ученых при химическом анализе сапропеля придерживаются последней точки зрения и не учитывают высвобождение органических молекул и их переход на молекулярный уровень организации при разрушении организмов.
В результате многочисленных исследований установлено, что общее количество ОВ в сапропелях разных типов колеблется в следующих пределах (%): в органических - 70-93, кремнеземистых и карбонатных - 15-60, смешанных - 43-58.
Важной химико-технологической характеристикой сапропелей является их элементный состав: содержание углерода (С), водорода (Н), кислорода (О), юта (N) и серы (S).
Средний элементный состав ОВ сапропеля (мае. % daf): С 60.0, Н 6.0, N 2.5, S и О 35.0 [80, 82].По данным Н. Бракша [59], содержание С в сапропелях различных месторождений (мае. % daf) колеблется в пределах С = 51-59; Н = 6.5-7.4; соотношение С/Н да 7.0-8.9.Содержание Н и N в каустобиолите может служить одним из основных показателей при определении генезиса послеледниковых органогенных отложений [82].
Латвийскими учеными показано, что четкая зависимость между содержанием N и степенью минерализации сапропеля отсутствует, так как примерно одинаковым значением величины N часто характеризуются сапропели различной зольности [59].
Отличительными особенностями сапропелеобразователей являются значительные количества N (особенно в зооорганизмах), что обусловило самый высокий уровень этого элемента в сапропелях по сравнению с другими органогенными отложениями.
Согласно исследованиям Е. Казакова [12], микрорастения, зооорганизмы планктона и бентоса богаты белками, содержащими много N, а макрорастения -углеводами. Поэтому гипотеза о том, что при образовании богатых N сапропелей доминирующую роль играли преимущественно такие сапропелеобразователи как фито- и зоопланктон и бентос, а при образовании отложений с пониженным содержанием N - макрорастения, высшая водная растительность (или частично также "гумус", внесенный в водоем внешними водами) послужила основанием для исследований в данном направлении.Г. Евдокимовой и др. [83], при изучении элементного состава сапропелей 130 месторождений Белоруссии, было установлено, что колебания содержания С, Н и N в пределах одного типа обусловлены участием в формировании отложений разных сапропелеобразователей и составом групповых компонентов. Повышенное содержание С и пониженное Н и N наиболее характерно для отложений, образовавшихся при значительном участии растений - торфообра-зователей и содержащих 40-60% ГВ. При возрастании доли зоогенных остатков в сапропелях количество Н и N увеличивается, С уменьшается [4].
Изменения содержания N в вертикальных разрезах могут служить наряду с другими признаками химическим показателем для расчленения сапропелевой толщи на отдельные стратиграфические горизонты.
По мнению М. Лопотко [2], максимальное содержание N наблюдается в пелогене (до 7.0-7.5% на ОВ), что является следствием активно протекающих микробиологических и биохимических процессов, накопления значительных количеств микробного белка и фиксации N из воздуха синезелеными водорослями.
Н. Бракш [59, 84-86] результатами своих исследований показал, что распределение содержания N в вертикальных разрезах сапропелевой толщи (в пересчете на daf) для отложений различных месторождений (так же, как и зольность) имеет различный характер.
Заметное изменение содержания N в разных горизонтах отложений, по мнению Н. Бракша [59], указывает на соответствующие изменения природы основного исходного материала в сапропелеобразовании в данном водоеме.Содержание N в изученных (средних) образцах латвийских сапропелей колеблется в пределах 1.2-4.7 на сухую и 3.0-5.4 (мае. % daf).
По данным исследований Е. Казакова [13], ОВ пресноводных сапропелей содержит N до 4-5 (мае. % daf ).Количество N в сапропелях различных типов колеблется в пределах 2.7-6.0%) ОВ и 0.5-4.0%) СВ. В ОВ сапропелей, содержащем остатки зоо-организмов, N больше (4.4-4.8% ОВ), чем в чисто водорослевых (3.0-4.2%), особенно торфянистых (2.6-3.5%). Аммиачного N - 0.4-0.8%, подвижного 3-25% общего, причем этот показатель выше в сапропелях с повышенной 7іільностью.
Содержаже серы (S) в пересчете на сухую массу в большинстве случаев колеблется в пpeдt7ax 0.6 - 1.4%, составляя в среднем 1%; в ОВ сапропелей - от 0.1 до 1.8% (не более 3% на сухое вещество). При заготовке и хранении сапропеля соединения S окисляются и это повышает обменную кислотность озерных илов [87, 88]. Наиболее высокий уровень S в ОВ карбонатных сапропелей [4].
Содержание S (мас.% daf) варьирует от 0.3 до 6.3; она находится в виде сульфатной, сульфитной, элементарной и органической [13, 59, 82, 89-98].
А. Гонцов и В. Ложеницына [99], исследуя сапропелевые отложения озер Белоруссии (Червоное, Судобль и Сергеевское), определили их элементный состав: максимальное содержание (мас.% daf) С (59.3) и Н (7.4) наблюдается в известковистых, О (32.0) - в кремнеземистых, N (4.8) - в органических сапропе-лях.
По характеру элементного состава пресноводные сапропели приближаются к гумусовым образованиям. Донные отложения соленых озер в связи с относительной бедностью флоры и фауны, большей интенсивностью процессов минерализации содержат меньше ОВ (нижний предел 10% принят условно) [2, 29, 90].
Всякое горючее ископаемое по характеру соединений, входящих в его органическую массу (ОМ), состоит из различных групп химических соединений. В молодом топливе идентифицировать эти соединения не представляет большой сложности [82]. Групповой состав ОМ сапропелей является наиболее важной и полной химической характеристикой. Его изучение имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение. В зависимости от содержания различных групп соединений в ОМ сапропеля выбираются наиболее рациональные направления практического использования этого ископаемого.
Наиболее подробно в этом отношении исследованы сапропели Белорусской ССР [2]. Опубликованы также данные о групповом составе сапропелей ряда месторождений других районов СССР [59]. Состав сапропелей
Элементный анализ
Элементный анализ выполнялся на автоматическом анализаторе фирмы "Карло Эрба" модель 1100. Условия: температура в реакторе окисления 1100С, который заполнен - Cr203/CuO; газ-носитель - Не. Температура в восстановительном реакторе 650 С; наполнитель - медная стружка. Температура хрома-тографической колонки -127 С; стационарная твердая фаза - хромосорб-102; детектор - катарометр по теплопроводности. Окислитель - AgMnO стандарт -9-нитроантрацен.
Дериватограммы снимались на дериватографе Q-1500 (Венгрия). Навеска пробы 500 мг. Начальная температура 20 С, конечная - 1000 С. Скорость подъема температуры 10 С / мин. Масштабы: TG -500; ДТА -500; ДТС -500.
Рентгено-флуоресцентный анализ выполнялся на энергодисперсионном спектрометре "Oxford instruments ED-2000 " при следующих условиях:рентгеновская трубка с Rh анодом; фильтр первичного рентгеновского излучения тонкий Rh; напряжение на трубке 35 кВ; ток 31 дА; время съемки 300 с (для "средних" элементов); фильтр первичного рентгеновского излучения толстый Си; напряжение на трубке 50 кВ; ток 242 цА; время съемки 300 с (для "тяжелых" элементов); фильтр не используется; напряжение на трубке 5 кВ; ток 485 цА; время съемки 300 с (для "легких" элементов).
Эмиссионные спектры были сняты на спектрографе ИСП-30 с кварцевым трехлинзовым конденсором. Электроды угольные, безборные, выточенные в форме рюмочки (ЧССР). Дуговой промежуток 1,5 мм; ширина щели спектрографа 10 мкм; пластинки спектрографические, тип ЭС, проявитель -контрастный, метолгидрохиноновый, экспозиция 10 мин. Расшифровка спектрограмм осуществлялась с помощью атласа спектров из комплекта прибора. Фотометрирование плотности почернения линий элементов для полуколичественной оценки их содержания проводилось на микрофотометре типа МФ-2.
Спектры в УФ- и видимой областях снимались на спектрофотометрах "Спекорд М 40" (ГДР) и СФ-46 в растворе спектрально чистых октана, четыреххлористого углерода и этанола. Концентрация растворов составляла 10" МО"4 моль/л. Кюветы кварцевые, длина рабочей грани 2 и 10 мм. Спектральная область 200 - 800 нм.
Режим экстинкции. Интерпретация электронных спектров проводилась в соответствии с литературными данными [328-335].
Спектры сняты на ИК-Фурье-спектрометре модели Impact 400d (фирма NICOLET, США) в области спектра 4000-400 см"1 с образцов в таблетках из бромида калия. Диаметр таблетки - 3 мм. Количество сканирований - 16. Разрешение - 4 см 1. Формат - % Transmittance. Дополнительная обработка -выравнивание базовой линии.
Отнесение полос поглощения в ИК-спектрах проводилось в соответствии с литературными данными [161, 162, 336-343].Спектры ЯМР - Н записаны на Фурье - спектрометре JNM FX - 90Q фирмы JEOL (Япония) на частоте 89.6 МГц при комнатной температуре. В качестве растворителей использованы гексадейтеробензол, ацетон- de, ДМСО de, CD3OD. В этих растворителях не происходит деструкция сапропеля и его составных частей, а также доступна область, закрываемая обычно при использовании D20.
Методика эксперимента: 1-5 мг подготовленного образца растворяли в 0.6-0.7 мл дейтерированного растворителя. Раствор помещали в ампулу ЯМР спектрометра (0 5 мм) и фиксировали спектр ЯМР-1!! после 10 сканирований.
Общее число сканирований составляло 200-300 с накоплением сигнала в форме Н-ЯМР-спектра. Если образец полностью не растворялся, нерастворенную его часть помещали вне приемной катушки спектрометра. В качестве внутреннего стандарта использовали примеси в дейтерированных растворителях: C6HD5 (7.10 м. д.), ацетон - d5 (2.05 м. д.), ДМСО - d5 или гексаметилдисилоксан (8 0.05 м. д.) [344-347].АЖХ осуществлялась на активированном при НО С в течение 1 часа силикагеле марки АСКМ. Массовое соотношение: разделяемое вещество: силикагель = 1 : 70. Элюирование колонки продолжалось до достижения значения коэффициента преломления для исходного растворителя.
Анализ водорастворимых продуктов осуществлялся методом ТСХ на активированных стандартных пластинках "Silufol" 20x20 см. Длина пробега смеси растворителей - 100 мм. В качестве "свидетеля" использовались стандартные растворы индивидуальных органических кислот, Сахаров и аминокислот. Системы элюентов и проявители: а) аминокислоты: изопропанол : 25 %-ый раствор аммиака (7 : 3 об.); проявитель - 0,1 %-ый раствор нингидрина в ацетоне; б) органические кислоты: этанол : бензол : 25%-ый раствор аммиака (4:2: 1 об.); проявитель - бромкрезоловый пурпурный; в) сахара: изопропанол : метилэтилкетон : вода : 25%-ый раствор аммиака (20 : 10 : 1 : 1 об.); проявитель - ОД н раствор AgNOs : 5 н раствор NH3 (1:1 об.), сушка 10 мин при 105 С. Количественное содержание соединений определялось с использованием растворов с известной массовой долей стандарта. Фенольные гидроксилы определялись модифицированным баритным методом [348, 349]. Содержание фенольных гидроксилов рассчитывалось по формуле (мг-экв/г):
Схема изучения органической массы сапропеля (ОМС)
Исследование группового состава ОМС осуществлялось экстракцией, а также кислотно-щелочным гидролизом, в ходе которых были получены гексановый, толуольный, хлороформный, ацетоновый, этанольный экстракты (битумы), водорастворимые и легкогидролизуемые вещества, уроновые, гуминовые и фульвокислоты :; продукты гидролиза: целлюлоза, гемицеллюлозы и негидролизуемый остаток. Схема исследования приведена на рис. 3.2.1; выход продуктов - табл. 3.2.1.
Водный экстракт получали обработкой сапропеля в аппарате Сокслета водой в течении 24 час. Соотношение сапропель : вода - 1 : 50 мае. Экстракт анализировался методом ТСХ (глава 2, раздел 2.10). Качественный и количественный состав экстракта дан в (табл. 3.3.1.1 - 3.3.1.3). Из табл. 3.3.1.1 видно, что основу аминокислот составляют лейцин (615.3), аспарагиновая (152.2) и глутаминовая кислоты (104.5), треонин (75.3), мг/кг сапропеля, как известно, наиболее стабильных при диагенезе. Меньший вклад вносят фенилаланин, аспарагин, L-a-аланин, гистидин, тирозин, валин, глицин.
Углеводы представлены в основном галактозой, D-глюкозой, рамнозой; в значительно меьшем количестве содержатся лактоза и мальтоза; в следовых -раффиноза (табл. 3.3.1.2).Водорастворимые карбоновые кислоты в основном представлены: щавелевой (1.3), янтарной (0.8), салициловой (1.0), бензойной (0.6) и малоновой (0.5) кислотами, мг/кг сапропеля (табл. 3.3.1.3).
После экстракции водой сапропель экстрагировался гексаном, толуолом, хлороформом, ацетоном, этанолом, а затем подвергался последовательному кислотно-щелочному гидролизу (рис. 3.2.1); выход продуктов (табл. 3.2.1).
Состав аминокислот, Сахаров и водорастворимых карбоновых кислот, содержащихся в гидролизатах (ЛГВ, УК, ФК), приведен в табл. 3.3.1.1.-3.3.1.3.
Из табл. 3.2.1 видно, что экстракцией водой, органическими растворителями, а также последовательным кислотно-щелочным гидролизом извлекается 97.3 (мае. % ОМС); причем основная доля ОМС - гидролизом.
ЛГВ (гемицеллюлозы), извлекаемые раствором НО с массовой долей 2%, составляют 14.9 (мае. % от воздушно-сухого сапропеля), или 3.4 мае. % ОМС. Среди аминокислот ЛГВ доминируют лейцин (1435.2), аспарагин (1215.3), гистидин (2135.3), фенилаланин (501.8), валин (475.3) и глутаминовая кислота (357.2); Сахаров - D-галактоза (287.2), D-глюкоза (143.4) и мальтоза (43.5);
водорастворимых карбоновых кислот - янтарная (147.3), щавелевая (61.3), феруловая (40.7) и метилянтарная (23.5), мг/кг сапропеля. Среди других органических кислот представляют интерес ванилиновая, галловая, сиреневая, которые, вероятно, являются продуктами окислительной деструкции дигидрокониферилового спирта, составляющего основу лигнина (табл. 3.3.1.1 -3.3.1.3).
Доля аминокислот достаточно велика и в случае УК, извлекаемых раствором НС1 с массовой доолей 12 %. Однако их гамма ограничена такими о кислотами как: валин (213.5), гистидин (3 3.5), глутамин (833.4) (табл. 3.3.1.1); содержание остальных изменяется от 0.6 (фенилаланин) до 40.2 (глутаминовая кислота), мг/ кг сапропеля. Почти втрое (1624.5 - 569.2) мг/ кг сапропеля, по сравнению с ЛГВ, в составе УК возрастает содержание Сахаров, среди которых преобладает галактоза (галактуроновые кислоты) и почти в 3.5 раза водорастворимых карбоновых кислот (табл. 3.3.1.3). Среди последних в составе УК доминируют: щавелевая (510.5), янтарная (393.2), салициловая (80.3) и метилянтарная (64.3), мг/ кг сапропеля. Некоторые количества аминокислот, Сахаров и водорастворимых карбоновых кислот соизвлекается при щелочном гидролизе сапропеля в ходе выделения ГК (табл. 3.3.1.1 - 3.3.1.3), определяя состав их водорастворимой части - ФК. Вероятно, щелочным гидролизом расщепляются сложноэфирные связи, посредством которых с макромолекулой ГК связаны аминокислоты и водорастворимые карбоновые кислоты. Обнаружение моносахаридов (D Схема последовательной экстракции сапропеля органическими растворителями приведена на рис 3.2.1; выход отдельных экстрактов и их характеристика - в табл. 3.4.1. Экстракты были охарактеризованы комплексом физико-химических методов (глава 2, разделы 2.2, 2.3, 2.5, 2.6-2.8, 2.11-2.13). Из табл. 3.4.1 видно, что максимальный выход отмечен для этанольного экстракта, составивший 1.4 (мае. % ОМС); минимальный - для хлороформного (0.3). По внешнему виду экстракт - мелкодисперсный сыпучий порошок бледно-желтого цвета. Выход экстракта - 0.5 (мае. % ОМС). Комплексным дифференциально-термическим (ДТА) и дифференциально-термогравиметрическим (ДТт А) анализом установлено, что на кривых нагревания гексанового экстракта зафиксированы 3 стадии термолиза. При 70 С наблюдается первый эндотермический пик, соответствующий плавлению ОВ (парафины, воска). В интервале 230-480 С происходит разложение ОВ экстракта; пик процесса приходится на 450 С, о чем свидетельствует сильный экзотермический эффект (возможен процесс разложения высокомолекулярных парафинов и восков). В интервале 480-540 С разлагается минеральная часть экстракта (дегидратация связанной Н20, разложение СаС03, MgC03, А1(ОН)3), либо окисляется ОВ (высокомолекулярные парафины и воска). При 540 С разложение гексанового экстракта завершается.
Элементный анализ гексанового экстракта показал довольно высокое содержание (мае. % daf): С (85.8) и Н (10.6); незначительное - N (0.1), 0+S (3.5), что свидетельствует о преимущественно алифатической природе экстракта, а именно, о повышенном содержании предельных углеводородов (высокомолекулярных парафинов) и крайне невысоком - ароматических структур. Данный вывод подтверждается отношением Н/С (ат), равным 1.48 (табл. 3.4.1).Рентгено-флуоресцентным и эмиссионным спектральным анализами в составе экстракта идентифицированы: Fe, Si, Mg (доминируют), Са, Си, А1, Ті (достаточно высокое содержание), Ва, Na. Sn, Sc (следовые количества).
Примечание: М - молекулярная масса; С, Н, N, О, S - содержание углерода, водорода, азота, кислорода, серы (мае. % daf); ФГ - фенольные; КрГ -карбоксильные; КГ - кетонные; ХГ - хиноидные группы; И.Ч. - йодное число (мг-экв / г); Н/С(ат) - атомное отношение водорода к углероду. ИК-спектроскопия (рис. 3.4.1.1) позволила идентифицировать в составе гексанового экстракта п.п. следующих структурных фрагментов (v, см 1):- алканов с примесью циклоалкановых структур (2860; 2880; 2940; 2975; 1470; 1460; 1380; 1260; 725; 970);-кратных связей (1680; 1645; 680); циклических спиртов (3300-3500; 1070-1090); ароматические соединения практически отсутствуют.УФ/ВИС-спектроскопия (рис. 3.4.1.2) позволила уточнить особенности структуры соединений гексанового экстракта. Регион 210-265 нм с максимумами (210; 225; 265) - моноциклические производные бензола; (200; 220) - ненасыщенные карбоновые кислоты и их производные; (210; 265) -производные фенолов; (212; 270) - полициклические ароматические соединения, в основном, нафталинового ряда; (210) - ненасыщенные амиды, лактамы, а, Р - ненасыщенные кетоны; (260-280) - производные фенилкетонов, ненасыщенных кетонов, хинонов, (260) - витамина К; (280) - ацетофенона; (240-250) - абиетиновой кислоты; стероидные производные типа холестадиена и эргостена, эргостерина, тахистерина; кумарины (220; 276; 311); порфириновые структуры (405-410); производные пиридина (200); енолы, оксипиридины (265-300); флавоновые гликозиды (265-370).С целью идентификации функциональных групп, содержащих атомы водорода, записаны спектры ЯМР-И гексанового экстракта. В спектре ЯМР -!Н экстракта (рис. 3.4.1.3) наиболее интенсивный сигнал (8 1.26 м. д.) соответствует метиленовым протонам алкильного заместителя. Триплет концевой метальной группы алкильного фрагмента расположен при 0.86 м. д. Заметное уширение этих сигналов и наличие широкой линии при 0.90 м. д. свидетельствуют о том, что в экстракте присутствуют несколько веществ. Сравнение интегральных интенсивностей поглощения метиленовых и метильных протонов (приведенных к одному протону) показывает, что на одну СНз- группу приходится 9 СН2- групп. Триплет при 9.27 м. д., принадлежащий альдегидному протону, свидетельствует о наличии в составе сапропеля соединения с фрагментом -СН2СНО. Сигнал а- метиленовой группы его дает
Биологическая активность фульвокислот
Исследование биологической активности ФК проводилось согласно методическим рекомендациям к контролю питательных сред по биологическим показателям.Исследовали параллельно растворы ФК исходного, дебитуминизированного и декальцированного сапропеля и их солей. Учёт биологической актив ности осуществляли визуально по количеству выросших колоний и их морфологии.В опытах с ФК отмечалось подавление роста Escherichia coli и Staphylococcus aureus в 10 и более раз, причем ФК дебитуминизированного сапропеля обладали более выраженными антибактериальными свойствами.
В опытах с солями ФК наблюдали сливной рост микроорганизмов.Соли ФК исходного (проба 1), дебитуминизированного (проба 2) и декальцированного (проба 3) сапропеля исследовали по методике (2.2.16) с применением количественной обработки результатов на классических для микробиологических исследований штаммах Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Результаты: 1) Опыт с E.coli контрольная чашка - 368 колоний, пробы № 1,2,3 - сливной рост - больше 1000 колоний; 2) Опыт с St. aureus-контрольная чашка - 540 колоний, пробы № 1,2,3- сливной рост - больше 1000 колоний.
Получено подтверждение о необходимости присутствия ионов К+ в растворе для стимуляции роста микроорганизмов, а также угнетающее влияние ионов Н . Соли ФК проявляют высокую биологическую активность, обусловленную наличием в их составе большого количества галловой (0.5), феруловой (0.5) и метилянтарной (8.8) (мг / кг сапропеля) кислот, а также янтарной кислоты (30.0), которая является субстратом для дыхания различных растительных организмов и микробов.
При исследовании ВРВ исходного сапропеля (проба № 1) и дебитуминизированного сапропеля (проба № 2) по методике (2.2.16) с применением количественной обработки результатов на классических для микробиологических исследований штаммах Escherichia coli, Staphylococcus aureus и грибах рода Candida получили следующие результаты: 1) Опыт с Е. coli контрольная чашка- 340 колоний, проба 1 -72 колоний, проба 2-102 колонии; 2) Опыт с St. aureus контрольная чашка-425 колоний, проба 1- 109 колоний, проба 2- 210 колоний; 3) Опыт с грибами рода Candida: на всех чашках примерно одинаковое число колоний - 420.
Таким образом, можно сделать вывод, что водорастворимые экстракты сапропеля обладают ингибирующим действием на бактерии Е. coli и St. aureus (рис. 4.3.1), что, по-видимому, обусловлено присутствием (мг / кг сапропеля): терефталевой (0.1), бензойной (0.6) и салициловой (1.0) кислот.
В целях апробации водных растворов сапропелевых ГК в качестве ростовых биостимуляторов проведены полевые агротехнические испытания. Площадь 10 м2. Оценено влияние ГК на урожайность: томатов, огурца, картофеля, перца сладкого, сахарной свеклы, пшеницы яровой и озимой. Осуществлялся прикорневой полив раствором гумата калия с массовой долей 0.01 % 3 раза в течении вегетативного периода развития культур. Срок испытания 2 года. Обобщение результатов позволило сделать вывод, что использование сапропелевого гумата калия весьма эффективно. Увеличение урожайности в среднем составило (%): томаты (30-35); картофель (20-25); огурец (45-50); перец сладкий (25-35); сахарная свекла (25-45); пшеница озимая и яровая (30- 35%).
Применение сапропелевого гумата калия, наряду с увеличением урожайности, способствуют повышению устойчивости растений к различным заболеваниям (пероноспороз, серая белая и пепельная гниль, вертицелез, ржавчина, фамоз, пузырчатая головня, северный гельминтоспориоз, корневая гниль, церкоспороз, корнеед, черная бактериальная пятнистость, бактериоз, мучнистая роса, парша, антрокноз и др.), а также улучшает биохимические показатели сельскохозяйственной продукции: снижение содержания нитратов (на 20-30 %), кислотности, ослабление действия тяжелых металлов, снятие токсикоза растений, повышение содержания сахара (0.8-2%), витамина С (на 2-3 мг%), клейковины в зерне (на 5%), белка (1.5-2%), каротина (до 5%).
Биологическую активность сапропелевых препаратов можно объяснить не только особенностями их состава, набором специфических соединений, но и явлением их синергизма. Поэтому рассмотрение свойств отдельных компонентов целесообразно проводить с точки зрения их функций в живом организме. Среди биологически активных веществ необходимо выделить стероиды, участвующие в построении внутриклеточных мембран, образуя с белками сложные комплексы; а- и у-пироны - кумарины, хромоны, ксантоны, обладающие выраженным противовоспалительным действием; янтарную и метилянтарную кислоты, являющиеся субстратом для дыхания различных растительных организмов и микробов, а также глутаминовую кислоту, дающую ряд важных физиологически активных аминокислот (пролин, оксипролин и
Сапропель оз. Глубокое (Республика Татарстан) может быть рекомендован для получения фармацевтических препаратов. Так, уникальное сочетание в сапропеле производных хлорофилла, каротиноидов, алкалоидов, стероидных спиртов, кетонов, карбоновых кислот, терпенов, полициклических хинонов, комплексов металлов с переменной степенью окисления, вероятно, должно способствовать благоприятному эффекту при лечении различных заболеваний крови. Каротиноиды увеличивают устойчивость организма к ионизирующим излучениям, адаптируемость к экстремальным условиям. Свободные радикалы, стабилизированные сопряженной системой хлорофилла и полициклических хинонов, могут оказаться полезными при использовании гуминовых и гематомелановых кислот для лечения злокачественных новообразований.
Установленный значительный бактерицидный и бактериостатический эффект сапропелевых препаратов, а именно гуминовых и фульвокислот, водо растворимых веществ может быть успешно использован для бальнеологического лечения гнойно-воспалительных, кишечных, гинекологических и грибковых заболеваний, экзем, дерматитов.
Высокосопряженная система пиррольных пигментов, хиноидных фрагментов при наличии комплексов с металлами переменной степени окисления может оказаться эффективной при лечении кровеносной и дыхательной систем, профилактике и лечении онкологических заболеваний и лучевой болезни.
Комплексы гуминовых кислот с металлами эффективны при лечении заболеваний суставов; являются адсорбентами и гемосорбентами тяжелых металлов, радионуклидов, токсинов.Водорастворимые, легкогидролизуемые, гуминовые, фульво- и уроновые кислоты могут быть успешно использованы в сельском хозяйстве, животноводстве, птице- и рыбоводстве.
