Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Функциональное питание и пробиотики. Принципы производства кисломолочных продуктов с бифидобактериями 9
1.2 Нормальная микрофлора кишечника. Функции бифидобактерий в организме человека и их значение 11
1.3 История изучения вопроса. Бифидосодержащие баклрепараты и кисломолочные продукты сегодня 15
1.4 Краткая характеристика бифидобактерий, их свойства и условия культивирования 19
1.4.1 Морфология, классификация, культурально-физиологические свойства бифидобактерий, их биохимическая, антагонистическая активность и отношение к антибиотикам 19
1.4.2 Питательные потребности бифидобактерий. Факторы роста и их источники. Бифидус-фактор 23
1.4.3 Питательные среды для культивирования бифидобактерий 27
1.4.4 Отношение бифидобактерий к кислороду воздуха. Средства и способы для снижения воздействия кислорода на бифидобактерий при их культивировании 30
1.4.5 Отношение бифидобактерий к температуре и рН среды 32
1.4.6 Влияние процесса перемешивания, дозы и вида вносимого инокулята на накопление биомассы бифидобактерий 33
1.5 Технология производства сухих бактериальных концентратов 35
1.5.1 Отделение и концентрирование биомассы 36
1.5.2 Защитные среды 37
1.5.3 Консервирозание бактериальных клеток и хранение бактериальных препаратов 39
1.5.4 Особенности производства многоштаммовых концентратов с бифидобактериями 41
1.6 Бактерии Lbc.casei и их использование для создания новых пробиотических продуктов 42
1.6.1 Некоторые свойства бактерий Lbc.casei. Бактерии Lbc.casei в качестве пробиотика 43 1.6.2. Клиническое влияние Lbc.casei на желудочно-кишечные заболевания. Поддержание нормальной работы микрофлоры кишечника. Иммуномодулирующий эффект Lbc.casei 44
1.6.3 Технологические аспекты изготовления и использования бакконцентратов с бифидобактериями и бактериями Lbccasei 46
1.7 Влияние продуктов метаболизма на рост и развитие бифидобактерий и молочнокислых бактерий 47
2 Цели и задачи исследований 51
3 Организация работы, объекты и методы исследований 53
3.1 Организация работы 53
3.2 Объекты исследований и материалы 61
3.2.1 Объекты исследований 61
3.2.2 Материалы исследований 62
3.3 Методы исследований 62
3.3.1 Микробиологические методы исследований 62
3.3.2 Биохимические методы исследований 68
3.3.3 Физико-химические методы исследований 70
3.3.4 Математические методы исследований 71
4 Собственные исследования 73
4.1 Подбор и конструирование питательной среды для бифидобактерий 73
4.1.1 Сравнительная оценка различных питательных сред, используемых ранее для культивирования бифидобактерий 74
4.1.2 Изучение возможности использования белковых добавок в составе питательных сред БФ-1 и ГМК-2 для периодического культивирования бифидобактерий 76
4.1.3 Уточнение количественного состава среды БФ-2 при периодическом культивировании бифидобактерий 80
4.1.4 Исследование влияния включённых в состав среды БФ-3 компонентов (дрожжевого экстракта, лактозы, глюкозы и лимоннокислого натрия) на
развитие бифидобактерий при периодическом культивировании 83
4.1.5 Исследование влияния цистеин-Ьгидрохлорида в составе питательной среды БФ4
на развитие бифидобактерий при периодическом культивировании 86
4.1.6 Изучение влияния препарата «Фитотон» на процесс развития бифидобактерий при периодическом культивировании на различных питательных средах 90
4.1.7 Изучение развития различных штаммов бифидобактерий на питательных средах БФ-4 и БФ-5 при периодическом культивировании в условиях ферментёра 92
4.1.8 Исследование возможности использования питательной среды БФ-4 с целью наращивания биомассы различных штаммов мезофильных молочнокислых бактерий Lbc.casei 95
4.2 Уточнение отдельных параметров процесса периодического культивирования бифидобактерий с целью получения бактериальной массы 100
4.2.1 Изучение влияния дозы и вида инокулята на процесс периодического культивирования бифидобактерий 100
4.2.2 Исследование влияния углекислого газа и скорости перемешивания на процесс периодического культивирования бифидобактерий 104
4.3 Влияние концентрации лактата и глюкозы в питательной среде на процесс периодического культивирования бифидобактерий и молочнокислых бактерий Lbc.casei 108
4.4 Изучение влияния отдельных технологических факторов на качество готового бактериального концентрата 114
4.4.1 Исследование влияния продолжительности культивирования бифидобактерий на качество бактериального концентрата и стойкость при хранении 114
4.4.2 Сравнительная оценка различных защитных сред, используемых для производства сухих заквасок и бакконцентратов бифидобактерий. Изучение влияния на качество сухого бактериального концентрата вида защитной среды и концентрации бифидобактерий в ней перед сублимационной сушкой 117
4.4.3 Изучение возможности использования разработанной защитной среды № 5 для сублимационной сушки молочнокислых бактерий Lbc.casei 122
4.4.4 Исследование влияния температуры предварительного замораживания бактериального концентрата на выживаемость клеток бифидобактерий и Lbc.casei при последующей сублимационной сушке 123
4.4.5 Исследование влияния дозы сырого бактериального концентрата во флаконах на выживаемость бифидобактерий и молочнокислых бактерий Lbc.casei при сублимационной сушке 126
4.5 Определение сроков хранения замороженного и сухого бактериальных концентратов бифидобактерий и сухого бактериального концентрата молочнокислых бактерий Lbc.casei 129
4.5.1 Определение возможностей хранения замороженного концентрата бифидобактерий 129
4.5.2 Определение сроков хранения при различной температуре сухих бакконцентратов бифидобактерий и молочнокислых бактерий Lbc.casei 130
4.6 Разработка технологии производства бактериального концентрата бифидобактерий и молочнокислых бактерий Lbc.casei на основании проведённых исследований
4.7 Результаты опытно-промышленной выработки бактериального концентрата бифидобактерий и бактерий Lbc.casei
Выводы
Список литературы
- Нормальная микрофлора кишечника. Функции бифидобактерий в организме человека и их значение
- Морфология, классификация, культурально-физиологические свойства бифидобактерий, их биохимическая, антагонистическая активность и отношение к антибиотикам
- Микробиологические методы исследований
- Сравнительная оценка различных питательных сред, используемых ранее для культивирования бифидобактерий
Введение к работе
Анализ ситуации в отечественном молочном производстве свидетельствует, что в последние годы идёт неуклонный рост объёмов выпуска кисломолочных продуктов с пробиотическими штаммами бифидобактерий и молочнокислых бактерий.
Изготовление пробиотических кисломолочных продуктов относится к числу производств, в основе которых лежат разнообразные микробиологические и биохимические процессы, определяющие органолептические, физико-химические и функциональные свойства данных продуктов, их пищевую ценность и безопасность для потребителя. Главной проблемой при выработке кисломолочных продуктов с такими относительно медленно или слабо развивающимися культурами является обеспечение необходимого количественного состава микроорганизмов, определённого соотношения отдельных видов и штаммов. При этом в подавляющем большинстве случаев причины изменения концентрации в продукте, например, бифидобактерий, связаны либо с нарушениями в направленности и интенсивности микробиологических процессов (в случае способа производства, предусматривающего размножение пробиотической культуры во время выработки), либо с гибелью вносимых клеток (при способе производства с обеспечением определённой концентрации в продукте прямым внесением без дальнейшего размножения). Поскольку необходимым элементом процесса изготовления пробиотических кисломолочных продуктов являются концентрированные и пригодные для длительного хранения закваски, очевидно, что в любой из рассматриваемых ситуаций для устранения недостатков функциональных кисломолочных продуктов нужны бактериальные закваски и концентраты высокого качества.
Низкое качество бакконцентратов с пробиотическими микроорганизмами - это, прежде всего, недостаточно высокая концентрация и слабая физиологическая активность микробных клеток в них. Поэтому одним из интенсивно разрабатываемых научно-технических направлений является совершенствование существующих и создание новых более эффективных бактериальных концентратов с длительным сроком годности, содержащих клетки пробиотических культур в большом количестве и высокобиологичном состоянии.
Многочисленные литературные данные подтверждают, что целенаправленное регулирование параметров технологии подготовки пробиотических культур, т. е. изготовления высококонцентрированных бактериальных препаратов, оказывает существенное влияние на их качество и, следовательно, на качество функциональных молочных продуктов. Поэтому
рабочей гипотезой является предположение о том, что существует реальная возможность стабилизировать качество кисломолочных продуктов с пробиотическими культурами путём изучения, подбора и разработки рациональных условий и приёмов выращивания, а также обработки пробиотических микроорганизмов с целью интенсификации процесса производства бактериальных концентратов и улучшения их основных показателей и технологических свойств. В соответствии с вышеизложенным представляется актуальной разработка и совершенствование технологии двухвидового бактериального концентрата пробиотических л/ік/іур для производства новых видов кисломолочных продуктов и повышения их качества.
Нормальная микрофлора кишечника. Функции бифидобактерий в организме человека и их значение
Сегодня общепризнанным является тот факт, что микрофлора кишечника человека сформировалась в процессе эволюции и имеет для макроорганизма большое значение [190,294,316]. Она представляет собой открытый биоценоз, который находится в динамическом равновесии с организмом хозяина и окружающей средой [45].
В микрофлоре кишечника определяется более 100 видов микроорганизмов, а общее количество микрофлоры составляет до 1012 КОЕ / 1г фекалий. Основу кишечной микрофлоры составляют бесспоровые анаэробные микроорганизмы, и их количество достигает 95,0 - 99,6% от общей микробной массы. Анаэробная кишечная микрофлора представлена бифидобактерия ми, бактероидами, лактобактериями, пропионовокислыми бактериями, фузобактериями, эубак-териями, клостридиями и др. [92,194]. Аэробная кишечная микрофлора - это энтеробактерии, стафилококки, энтерококки, дрожжи и др. Разные авторы приводят несовпадающие данные о количественном преобладании отдельных видов [45, 209,231,234]. Некоторые из них отмечают преобладание над всеми видами анаэробных микроорганизмов бифидобактерии.
Наиболее глубокое представление в настоящее время имеется о бифидофлоре. Содержание бифидобактерии у детей первого года жизни достигает 85 - 95% всего биоценоза толстого кишечника. В микрофлоре взрослых людей отмечается также преобладание бифидобактерии, которые вместе с бактероидами составляют 80 - 90% всей микрофлоры [45,138].
На положительное влияние бифидофлоры на организм человека указывают отечественные [20,34,100,124,191] и зарубежные авторы [212,242,266]. По их мнению, физиологическая роль бифидобактерии обусловлена защитной и систематической функциями, а также участием в конечном звене пищеварительного процесса. Положительное действие бифидобактерии на организм человека связывают также с их ферментативными, витаминообразующими и антагонистическими свойствами [103,143,348].
Антагонистическое действие бифидобактерии носит комплексный характер. М.Э.Микель-саар и соавт. [101] изучали экологическое положение бифидобактерии в организме человека. Установили, что в кишечнике бифидобактерии расположены в непосредственной близости от эпителия слизистой, а именно в обволакивающих её муцинах. В связи с этим, авторы делают вывод о том, что обильное накопление клеток в этих участках препятствует адгезии патогенных и условно-патогенных бактерий к слизистой оболочке. Это лишает конкурирующие нежелательные микроорганизмы нутриентов и жизненного пространства и, как следствие, ведёт к их подавлению [98].
Другой причиной защитной роли бифидобактерии считают то, что они образуют в качестве конечных продуктов обмена веществ органические кислоты. Г.И.Гончарова, А.МЛян-ная и др. выявили способность бифидобактерии образовывать уксусную, молочную, муравьиную кислоты, которые оказывают специфическую токсичность на основные штаммы грибов, дрожжей и бактерий, или путём снижения рН до 3,8 - 4,0 ингибируют рост гнилостных микроорганизмов [47,48,94,130,189,192].
Известны литературные данные, авторы которых считают неправомерным отождествлять высокую антагонистическую активность бифидобактерии только с продуцированием кислот. SAIbrahim [263] показал, что при культивировании бифидобактерии совместно с энтеропатогенной кишечной палочкой в условиях поддержания рп среды близким к нейтральному, наблюдалось интенсивное угнетение роста E.coli. По его мнению, бифидобактерии способны выделять в среду иные антимикробные факторы. Работами G.R.Gibson [243] также доказано, что при культивировании клостридий и кишечных палочек вместе с бифидобактериями при постоянном рН среды ингибирование патогенной флоры не зависело от кислотности. Эти исследования показывают, что бифидобактерии имеют более сложные механизмы подавления патогенной микрофлоры ЖКТ.
Большое значение в обеспечении защитной функции бифидофлоры имеет её регулирующее влияние на факторы местного иммунитета [104]. H.Yasui с соавт. [230] обнаружили штаммы бифидобактерии, индуцирующие большое количество иммуноглобулина IgA. В работе авторы делают вывод о стимулировании бифидобактериями иммунного ответа в кишечнике. Иммунопотенциирующее действие бифидобактерии описано у многих исследователей [54,119,203,265,270,289].
Таким образом, с момента рождения ребёнка бифидобактерии наряду с другими представителями нормальной микрофлоры стимулируют лимфоидный аппарат, участвуют в создании общего пула иммуноглобулинов, увеличивают уровень комплемента, пропердина, повышают активность лизоцима, формируют неспецифическую защиту и иммунорезистент-ность. Они деконьюгируют желчные соли в свободные формы, обладающие большей биоцидальной активностью против посторонних в кишечнике бактерий [4,63,64,93,181,272, 313,316,347,348].
Бифидобактерии играют важную роль в процессах обмена веществ. Присутствие их в ЖКТ связано со многими функциями, относящимися к процессу пищеварения. Бифидобактерии усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омыляютжиры, растворяют клетчатку. Летучие жирные кислоты, секретируемые бифидобактериями, могут действовать как перистальтические стимуляторы, что помогает здоровому функционированию толстой кишки. Эти микроорганизмы принимают участие в печёночно-кишечной циркуляции желчных кислот и стеринов [195].
Создавая в кишечнике кислую среду, бифидобактерии улучшают всасывание в кровь солей железа, кальция, витамина D, т.е. обладают антирахитическим и антианемическим действием [24].
Морфология, классификация, культурально-физиологические свойства бифидобактерий, их биохимическая, антагонистическая активность и отношение к антибиотикам
По современным данным, бифидобактерий включают более 20 видов облигатно-анаэробных бактерий.
Морфология клеток различна. Ещё H.Tissier установил, что характерным свойством бифидобактерий является полиморфизм, в частности, бифуркация. На эту особенность бифидобактерий указывали и другие исследователи [46,147,210]. Помимо ветвящихся форм встречаются прямые, слегка изогнутые, почти без ветвления особи, палочки с вздутиями, утолщениями на одном (булавовидные) или двух (гантелеобразные) концах, а иногда и в центре клетки, способные образовывать беспорядочные скопления, похожие на «китайские иероглифы» [23,122,193,215,288,316].
Морфологически бифидобактерии представляют собой неспорообразующие неположительные неподвижные палочки размером (0,2 - 1) х (2,0 - 9,0) мкм, зернистые; микробные клетки иногда складываются в короткие цепочки. От лактобацилл отличаются образованием ответвлённых, разделённых перегородками палочковидных форм, очень напоминающих актиномицеты и коринебактерии. После выделения и выращивания культур бифидобактерии in vitro ветвление исчезает, клетки становятся грамвариабельными, появляется много гранулированных форм. В некоторых средах у этих бактерий появляются глобулярные формы, а также разбухшие инволюционные шаровидные формы.
Форма клеток бифидобактерии зависит от разных факторов. В отношении причин, вызывающих полиморфизм этих микроорганизмов, мнения исследователей противоречивы. Так, если H.Tissier [353], H.Topley, G.Wilson [354], R.T.Norris и др.[352] отмечали появление ветвящихся форм у более старых особей, S.O.Orla-Jensen и др. [297], M.Lerche, G.Reuter [279] ветвление наблюдали у молодых свежевыделенных культур, субкультуры же имели тенденцию к образованию палочковидных форм. Причинами, вызывающими морфологические изменения бифидобактерии, могут быть условия культивирования (рН среды, температура, состав питательных компонентов среды, присутствие кислорода), условия хранения, возраст культуры, количество пересевов и некоторые др. [23,29,153,295,319,334].
Подавляющим большинством исследователей этого вопроса установлено, что ветвление происходит в строго анаэробных условиях, на более поздних стадиях развития, в среде, неполноценной в отношении источников питания, а также индуцируется катионами одновалентных металлов - калия, натрия, лития, цезия, или исключением из среды культивирования одной из четырёх аминокислот: DL-аланина, DL-серина, DL-аспарагиновой кислоты, Ц+)-глютаминовой кислоты (M.Kojima и др., 1968 год; I.Husain и др., 1972 год).
Микроскопическое изучение клеточной структуры бифидобактерии показало, что среди штаммов, выделенных из кишечника взрослых людей, преобладают палочковидные и булавовидные формы, а ветвящиеся палочки чаще встречаются у детей грудного возраста.
Таким образом, морфологические изменения микробной клетки бифидобактерии служат как бы дополнительным показателем состояния культуры при ферментации и позволяют регулировать, например, с помощью условий культивирования сложные процессы жизнедеятельности этих микробов.
Различны и колонии бифидобактерии. В высоком столбике плотной питательной среды бифидобактерии часто образуют белые колонии, напоминающие по форме зерно гречихи, усеченную треугольную пирамиду, «гвоздик», «комету со шлейфом». Размеры таких колоний -от 0,5 до 15,0 мм [23].
Систематическое положение бифидобактерий было в течение длительного времени предметом дискуссии [144,145,217,229,232,287,296,320,344,354,359,360]. Согласно 8-ого издания определителя бактерий Берги бифидобактерий выделены в самостоятельный род Bifidobacterium, который включён в семейство Actinomycetaceae и насчитывает 11 видов, различающимся между собой по биохимическим, физиологическим и серологическим признакам, а также по морфологии, строению клеточной стенки, гемологичности ДНК-ДНК [215].
Бифидобактерий, живущие в кишечнике человека, различаются по видовому составу. Определяют 5 видов бифидобактерий: B.bifidum, В.Іопдит, B.adolescentis, B.infantis (подвиды Mantis, lactensis, biberomm), B.breve (подвиды breve и parvulorum) [19,101,229,288]. Кроме того, в последних исследованиях к человеческим видам были отнесены B.pseudocatenulatum, B.catenulatum, B.dentium, B.angulatum [304].
Преобладание одного или другого вида зависит от возраста человека и от состояния его здоровья. Так, вид B.bifidum выявлен у здоровых людей всех возрастных групп, однако у детей, содержащихся на грудном вскармливании, он является преобладающим и выделен у 40 - 70% обследованных; у взрослых частота выделения снижена до 15 - 20%. Вид В.Іопдит также характерен и для детей и для взрослых и выделяется у 40 - 60% грудных детей и у 70 - 75% детей старшего возраста и взрослых. Вид B.adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста и выделяется у них в 50 - 65% случаев. У пожилых лиц он становится преобладающим - до 85% [45,78,90].
В последние годы за рубежом получил широкое распространение штамм бифидобактерий, выделенный из организма животных - B.lactis (ранее В. animalis). По мнению исследователей, при наличии ярко выраженного пробиотического эффекта происхождение само по себе не является значительным критерием селекции. Установлено, что B.lactis даёт достаточно высокий уровень клеток, способствует улучшению вкуса продукта, устойчив к кислой реакции среды и, следовательно, имеет высокие адгезивные свойства (выживаемость в ЖКТ и в процессе микробной трансформации) [41,282].
Микробиологические методы исследований
Количество клеток бифидобактерий определяли методом предельных разведений в физиологическом растворе с последующим высевом на тиогликолевую среду (для экспериментов, описанных в пунктах 4.1.1 -4.1.4), на тиогликолевую среду и сконструированную среду БФ-4 (в экспериментах пунктов 4.1.5,4.1.6), на среды БФ-4 с «Фитотоном» и БФ-5 (в экспериментах пунктов 4.1.7,4.2.1,4.2.2, подраздела 4.3, пунктов 4.4.1,4.4.2,4.4.4 и 4.4.5). При измерении количества бифидобактерий в опытах по установлению возможных сроков хранения бактериального концентрата (см. подраздел 4.5) использовали среды тиогликолевую, БФ-4 с
«Фитотоном» и БФ-5 с «Фитотоном». Посевы выдерживали в термостате при температуре (38,5 ± 1,0) С в течение 36 - 60 часов с последующим микроскопированием препарата из отдельных колоний (особенно сомнительных по форме или расположенных слишком близко к поверхности среды).
Использование в экспериментах данной работы сред БФ-4, БФ-5, БФ-4 с «Фитотоном» и БФ-5 с «Фитотоном» в качестве контрольных для определения количества бифидобактерий -это усовершенствованный нами метод, основанный на результатах соответствующих исследований (см. пункты 4.1.4,4.1.5,4.1.6).
Количество клеток бактерий Lbc. casei определяли этим же методом с высевом на среду MRS (производство Франции) и параллельно на контрольную среду, 40 % сухих веществ которой составила среда ГМК-1 и 58 % среда MRS (см. пункт 4.1.8, подраздел 4.3, пункты 4.4.3, 4.4.4, 4.4.5 и 4.5.2). Посевы выдерживали в термостате при температуре (32,5 ± 1,0) С в течение 60 - 96 часов с последующим микроскопированием препарата из отдельных колоний.
Питательные среды БФ-4 и БФ-4 с «Фитотоном» для контрольных посевов перед стерилизацией фильтровали, чтобы увеличить прозрачность и облегчить процесс подсчёта колоний. Содержание агар-агара во всех контрольных средах устанавливали в пределах (2,5 ± 0,5) г / дм3 с учётом того, что в некоторых из них уже присутствует определённое количество этого компонента. В контрольных средах перед стерилизацией устанавливали определённое значение рН с помощью 40%-ного раствора гидроксида натрия. Активная кислотность после стерилизации в средах для бифидобактерий составляла (6,80 ± 0,10) ед. рН (для тиогликоле-вой среды (7,0 + 0,1) ед. рН), в средах для бактерий Lbc.casei - (6,15 ± 0,10) ед. рН. После стерилизации контрольные среды хранили в холодильнике не более 21 дня. Перед посевом контрольные среды расплавляли на водяной бане и затем регенерировали в течение (12 ± 2) минут.
Приготовление раствора хлорида натрия, отбор проб, подготовка их к анализу и приготовление разведений осуществляли согласно «Инструкции по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности» [65]. Посевы производили в высокий столбик среды (7,5 - 10,5 см) в пробирки диаметром 11 - 15 мм с плотно подогнанными или завинчивающимися пробками.
Схему 1 использовали для подсчета клеток в опытах, описанных в пунктах 4.1.1 - 4.1.5, а схему 2- во всех остальных экспериментах. При определении количества микроорганизмов в культуральной среде или закваске высевали в контрольную среду Vlll-мое и !Х-тое разведения, Vll-мое разведение также высевали, однако его результаты, как правило, не использовались в подсчёте клеток из-за сложностей в подсчёте количества колоний. При определении концентрации микроорганизмов в биомассе, в суспензии клеток и защитной среды использовали эти же схемы, но для посевов выбирали ІХ-тое и Х-тое разведения. Для подсчёта микроорганизмов в сухом бакконцентрате выбирали Х-тое и ХІ-тое разведения.
Важнейшим моментом при постановке микробиологических экспериментов с наращиванием биомассы является подготовка посевного материала. Порядок подготовки культур бифидобактерий для получения закваски отражён на рис. 3. Для выращивания и пересадки культур использовали полужидкие среды - Блаурокка, тиогликолевую и БФ-5.
Перед хранением закваски бифидобактерий, полученной на одной из вышеуказанных сред, в ней устанавливали с помощью гидроксида натрия (концентрация 30 - 40 %) или раствора аммиака (концентрация 15 %) активную кислотность (6,6 ± 0,1) ед. рН. Срок хранения в холодильнике при температуре (6 ± 1) С составлял не более 21 дня.
Для молочнокислых бактерий Lbc.casei, схема их подготовки к эксперименту существенно не отличалась от схемы подготовки штаммов бифидобактерий. Для наращивания клеток в этом случае использовали питательные полужидкие среды MRS или реже ГМК-2, а также обезжиренное молоко. Температура термостатирования составляла (32 ± 1) С. Отбор вариантов (см. рис. 3) осуществлялся по тем же критериям, что и для бифидобактерий, за исключением определения наличия зоны аэробиоза.
Закваска бактерий Lbc.casei для хранения готовилась на обезжиренном молоке, окончание процесса термостатирования определяли по наличию плотного сгустка (для штамма Lbc.casei «Финл» по образованию неплотного слабого сгустка). Срок хранения полученной закваски в холодильнике при температуре (6 ± 1) С составлял не более 21 дня.
Для того чтобы приблизительно определить концентрацию посторонних, главным образом молочнокислых микроорганизмов, при подготовке посевного материала бифидобактерий (см. схему на рис. 3), а также на других стадиях экспериментов с этими
Сравнительная оценка различных питательных сред, используемых ранее для культивирования бифидобактерий
Измерение концентрации аминного азота в рассматриваемых средах показало, что среды ГМК-2 и БФ-1 содержат недостаточное количество белкового питания. С целью устранения этого недостатка в состав среды, согласно данным литературного обзора чаще всего добавляют пептоны и различные гидролизаты. Поэтому для обогащения сред в данных экспериментах использовали гидролизат казеина панкреатический (5,00 ± 0,01) г / дм3 (рекомендуемая концентрация в среде для бифидобактерий - от 1,00 до 10,00 г на 1 дм3) и пептон ферментативный неглубокой степени расщепления (10,00 ± 0,01) г / дм3. Закваску бифидобактерий для проведения экспериментов готовили и вносили, как указано в пункте 3.1.
Эксперименты проводили в два этапа. На первом этапе культивирование бифидобактерий осуществляли в бутылках в термостате без нейтрализации образующихся кислот; результаты исследования отражены в таблице В.2 (см. приложение В) и на графиках (см. рис. 6). По результатам накопления клеток бифидобактерий, представленным в таблице В.2, были подобраны общие уравнения аппроксимации экспериментальных данных (см. приложение Г). На втором этапе наращивание биомассы бифидобактерий осуществляли в ферментёре при автоматически регулируемых постоянных параметрах процесса -температуре и активной кислотности, а также при непрерывном перемешивании; результаты представлены в таблице В.З (см. приложение В) и на графиках (см. рис. 7). Кроме того, было поставлено несколько параллельных экспериментов культивирования бифидобактерий в ферментёре с такими же условиями, по окончании которых (несколькими часами ранее, в момент наблюдения максимума КОЕ бифидобактерий) провели охлаждение культуральной среды с последующим получением биомассы. По результатам измерения количества биомассы построили диаграмму, показанную на рис. 8.
Как видно из графиков (см. рис. 6 и 7), при проведении экспериментов на бутылках на среде БФ-1 с гидролизатом казеина и пептоном в составе вырастает наибольшее количество жизнеспособных клеток бифидобактерий -4,0 109 КОЕ в 1 см3 (максимум клеток соответствует 16 часам продолжительности процесса и существенно отличается от максимумов, наблюдаемых на других средах), а при проведении опытов в ферментёре на этсй среде получаем второй по величине результат - 7,1 10э КОЕ в 1 см3 (соответствует 9-часовой продолжительности культивирования), уступающий только результату на тиогликолевой среде.
Среду БФ-1 с гидролизатом казеина и пептоном, содержащую (50,00 ± 0,01) г / дм3 препарата BIOS 2000, условно обозначили как БФ-2. Как показали приближённые расчёты существенности различий по средним величинам (см. пункт 3.3.4 «Математические методы исследований»), при культивировании в условиях ферментёра максимальные значения Log 10 КОЕ бифидобактерий в 1 см3, полученные на средах БФ-2, Блаурокка и тиогликолевой,
Зависимость концентрации бифидобактерий в культуральной среде от продолжительности культивирования в лабораторном ферментёре при использовании различных питательных сред, в том числе обогащенных белковыми добавками несущественно различаются. Среда БФ-1 на 37,9 % уступает среде БФ-2 в точках наблюдения максимального количества жизнеспособных клеток в культуральной среде, соответствующих продолжительности процесса 8-9 часов. При использовании пептона и гидролизата казеина в среде ГМК-2 такого эффекта не наблюдалось, хотя надо отметить, что закваска на среде ГМК-2 с белковыми добавками оказалась немного более активной, чем закваска на ГМК-2 в опытах, описанных в пункте 4.1.1.
При проведении микроскопических исследований культуральной жидкости, отбираемой в момент, близкий к наблюдению максимума КОЕ /1 см3, отметили, что морфология клеток бифидобактерий, полученных на среде БФ-2, отличается присутствием в микроскопическом препарате относительно большого количества булавовидных форм, раздвоенных палочковидных форм, практически полным отсутствием изогнутых («скрюченных») клеток и гранулированных форм. Это является подтверждением благоприятного действия питательных компонентов среды на биологическую активность культуры. Следовательно, добавление пептона и гидролизата казеина целесообразно проводить при использовании для наращивания биомассы бифидобактерий питательной среды БФ-1. Кроме того, было установлено, что на среде БФ-2 (как наглядно показано на диаграмме рис. 8) получено наибольшее количество биомассы - 5,76 ± 0,35 %, причём содержание жизнеспособных клеток бифидобактерий в 1 г биомассы для всех исследованных сред практически не отличалось.
При получении биомассы для промышленного производства бакконцентратов немалое значение имеет массовая доля в среде используемых ростовых добавок и соответствующая себестоимость готовой среды. Ввиду вышеизложенного представляют практический интерес исследования по уточнению концентрации в питательной среде препарата. BIOS 2000, пептона и гидролизата казеина, необходимой и достаточной для наращивания по возможности наибольшего количества качественной биомассы бифидобактерий при относительно небольших затратах.
На первом этапе исследований рассматривали 16 вариантов сред. Варианты № 1 - 16 были приготовлены на основе препарата BIOS 2000 с добавками, концентрация которых варьировалась для пептона - от (5,00 ± 0,01) до (14,00 ± 0,01) г / дм3, для гидролизата казеина - от (3,00 ± 0,01) до (10,00 ± 0,01) г / дм3. Для сравнения использовали тиогликолевую среду. Все испытываемые среды готовили, как описано в подразделе 3.1.
Результаты опытов отражены на графиках (см. рис. 9) и в таблице В.4 (см. приложение В). Из полученных данных видно, что существенное увеличение количества бифидобактерий наблюдается при увеличении концентрации в среде пептона до (10,00 ± 0,01) г / дм3 и гидролизата казеина - до (7,00 ± 0,01) г / дм3. Это соответствует варианту среды № 11. Дальнейшее повышение концентрации этих компонентов (варианты № 4,8,12 - 16) не даёт практически никакого увеличения Log 10 КОЕ /1 см3 или даёт несущественное повышение. Следует отметить, что при использовании вариантов питательной среды № 11 - 16 получили результат по количеству бифидобактерий в 1 см3 культуральной среды, существенно не уступающий результату, полученному на тиогликолевой среде.
На втором этапе исследований, результаты которых отображены на графиках рис. 10 и в таблице В.5 (см. приложение В), уточняли наиболее рациональную концентрацию препарата BIOS 2000 в среде при массовой доле в ней пептона и гидролизата казеина как в варианте №11. Концентрацию препарата BIOS 2000 изменяли в рассматриваемых 7 вариантах от (40,00 ± 0,01) до (60,00 ± 0,01) г / дм3. Вариант № 11 из предыдущих опытов служил здесь для сравнения. Эксперименты осуществляли в ферментёре при постоянных регулируемых параметрах процесса - температуре, рН и при непрерывном перемешивании. На основании результатов аналогичных параллельно проведённых экспериментов, завершенных отделением биомассы (в момент наблюдения максимума клеток бифидобактерий в 1 см3) и взвешиванием, построили диаграмму.
Похожие диссертации на Разработка технологии бактериального концентрата бифидобактерий и бактерий Lactobacillus casei
