Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
Биодеградация целлюлозы: субстраты, микроорганизмы, ферменты, продукты 4
Переспективы и возможные пути биоконверсии целлюлозы 4
Состав целлюлазного комплекса и механизм гидролиза целлюлозы 7
Микроорганизмы разлагающие целлюлозу и их ферменты 14
Биологические способы подготовки грубых кормов к скармливанию 21
Глава II. Экспериментальная часть 27
Объекты и методы исследования 27
Выделение чистых культур целлолитических микроорганизмов . 28
Отбор выделенных штаммов микроорганизмов 29
Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов
Морфологические признаки 30
Изучение энзиматической активности при деградации целлюлозы 33
Оптимальная среда для накопления биомассы целлюлолитических бактерий 35
Определение питательной ценности соломы, как сырья для ферментации 3
Результаты и обсуждения 40
Выделение, отбор и идентификация штаммов целлюлолитических микроорганизмов 40
Отбор целлюлолитических бактерии к низким значением РН среды 51
Изучение энзиматической активности при деградации целлюлозы 52
Оптимизация ,среды для накопления биомассы бактерии p. CeTluTbmonas 61
Изучение питательной ценности соломы после ферментации.. 67
Выводы 87
Список литературы 89
- Состав целлюлазного комплекса и механизм гидролиза целлюлозы
- Биологические способы подготовки грубых кормов к скармливанию
- Изучение энзиматической активности при деградации целлюлозы
- Выделение, отбор и идентификация штаммов целлюлолитических микроорганизмов
Введение к работе
Организация налаживания кормовой базы животноводства, устранение причин нехватки и неполноценности кормов являются важнейшими проблемами, решения которых способствовало бы выведению сельского хозяйства из нынешного кризисного состояния. При решении данного вопроса, наряду с использованием пастбищ и грубых кормов представляет интерес и нетрадиционые способы приготовления корма.
В такой ситуации нельзя не оценить один из перспективных направлений биотехнологии получения кормовых продуктов, в частности белка из отходов сельского хозяйства с помощью микроорганизмов.
Для Монголии известную ценность предоставляют отходы земледелия, в частности солома. Разработка экономически оправданной технологии обработки соломы и других целлюлозосодержащих субстратов может иметь некоторую перспективу.
Известно, что при производстве, примерно, каждой тонны зерна получается тонна соломы, в которой заключены столько же энергии, сколько в зерне. Если мировое производство зерна составляет 16000 млн. тонн, то это означает, что ресурсы соломы также составляют 16000 млн. тонн, из которых половина используется в корм животным.
В нашей стране после уборки урожая остается неиспользованным
более 400 тыс. тонн соломы. Особенностью этого сырья является его
сложная структура, высокое содержание в нем целлюлозы. Кроме того
целлюлоза является и отходом других производств, так что запасы
/ ее велики, поэтому расщепление молекулы целлюлозы' на простые
соединения является актуальной на. сегодняшний день и
переспективной на будущее.
Для повышения питательности соломы, улучшения её поедаемости вкуса и запаха используют физические, химические и биологические, методы обработки С17, 53, 4, 5).
Физические методы требуют сложного оборудования, а химические сложны и дороги. Анализируя зарубежные опыты по переработке соломы, самым актуальным направлением считаем биологический метод.
Повышение питательности соломы достигается при условии нарушения в ней прочных связей целлюлозы с инкруструющими веществами, такими, как лигнин, кутерин, суберин.
При силосавании соломы, обычно применяют различные обогатительные добавки и закваски, представляющие собой высушенную культуру молочнокислых бактерии, а в качестве добавок используют муку, патоку и обрат. При этом не сама солома, а добавки служат энергетическим материалом для размножения бактерии, т.е. силосуются добавки, а не солома. Такой . метод силосования дорог, а вносимые в качестве закваски молочнокислые бактерии не способны разрушать связи целлюлозы с инкрустирующими веществами, следовательно не могут превращать целлюлозу в сахар. По мнению ряда авторов ферментация соломы только целлюлозоразлагающими бактериями явилось бы дешевым и надёжным методом получения сахара из клетчатки. При этом параллельно добавляются молочнокислые бактерии для накопления молочной кислоты, препятствующей развитию гнилостных и других мик роорганизмов.
Таким образом, изучение целлюлозоразлагающих бактерии в качестве закваски в силосуемой массе лежит в пересечении интересов нескольких научных и прикладных дисциплин. В то же время, целлюлозоразлагающие бактерии пока относительно слабо
изучены. В нашей стране эти необычные микроорганизмы оставались вне сферы интересов исследователей. Целью работы являлся поиск активных штаммов бактерии, способных разлагать целлюлозу, исследование физиолого-биохимических признаков, а также определение факторов, контролирующих их развитие и роли отводящейся этим бактериям в ферментации соломы. Исходя из этого были поставлены следующие задачи:
Выделение культуры синтезирующей целлюлазный комплекс на средах с дешевыми лигноцеллюлозными субстратами, изучение физиолого-биохимических свойств и идентификация бактерий.
Изучение эндоглюканазной, экзоглюканазной активности у штаммов бактерий, деградирующих целлюлозу.
Изучение влияния на популяцию целлюлозоразлагающих бактерии различных соотношении концентрации среды и условий культивирования.
4. В лабораторных опытах дать оценку роли закваски из
целлюлолитических и молочнокислых бактерий при силосовании соломы
без обогатительных добавок.
Состав целлюлазного комплекса и механизм гидролиза целлюлозы
Целлюлоза в чистом виде не встречается в растительных остатках, даже в волокне хлопка, имеющей наиболее чистую форму целлюлозы, содержится до 10 . X других полисахаридов, белков и минеральных солей. В составе древесины целлюлоза связана с такими полисахаридами, как пектин, крахмал, гемицеллюлоза, а также с лигнином (76, 147).
Гемицеллюлозы, второй после целлюлозы по распространенности класс биополимеров, представляют собой гетерополимеры глюкозы, галактозы, миннозы и уроновых кислот, связанных и галактозы связаных 1-3, 1-6 и 1-4 глюкозидными связами. Гемицеллюлозы присутствуют во всех слоях растительной клеточной стенки и составляют 25-30 % 66). Они сравнительно легко расщепляются многими микроорганизмами 38, 76). Третьим главным компонентом древесины является лигнинполимер с трехмерной структурой, образованный в результате энзиматической полимеризации фенилпропановых структурных звеньев (127 j 67). Лигнин является главным препятствием для биоконверсии целлюлозы, так как он образует механический барьер пронизывая всю толщину растительно-клеточной стенки, и кроме того, образует лигнин- ; полимерный комплекс (127).
Древесина лиственных пород содержит 17-20 % лигнина, а,/ хвойных 25-32 % (81). Лигнин крайне медленно разлагается (127). V Целлюлоза представляет собой линейный полимер, состоящий из остатков d-глюкозы, соединеных 1-4#-глкжозидными связями. Число глюкозных остатков (степень полимеризации) может варьировать от 1500 (хлопок) до 8 000-10 000 (древесина) и 6 000 000 (лён) (55). В растворах молекулы целлюлоза имеет хаотическую конфигурацию. / \
Одним из основных факторов, определяющих свойства нативной N целлюлозы, является её надмолекулярная структура. До 100 молекул целлюлозы удерживаются вместе с водородными связами - и силами Вандер-Ваальса, образуя микрофибрилу диаметром около 5 нм (100). Микрофибрилы ориентированы различным образом в разных слоях растительной клеточной стенки и погружены в матрикс, состоящей из гемицеллюлоз и лигнина, образуя прочный каркас (100, 23).
Участки микрофибрил с высокой степенью упорядоченности называют кристаллическими, а участки с беспорядочной ориентацией аморфными. Однако наличие двух фаз не обязательно предпологает существование чёткой границы между ними. По мнению Роговика (55), целлюлозу следует рассматривать, как однофазную систему, обладающую значительной неоднородностью в структуре с наличием упорядоченных областей. Аморфные участки гидролизирующиеся кислотами в 100 раз быстрее, чем кристаллические, составляют лишь , (хлопка) до 13-15 % (древесина) от общего количества целлюлозы (163).
До настоящего времени в литературе рассматривались различные модели строения молекулы целлюлозы и в зависимости от этого различные модели структуры микрофибрил. На основе представлений о молекулах целлюлозы, как о линейно вытянутых жёстких структурах предлагаются несколько способов их упаковки с образованием кристаллических и аморфных районов (157f 162, 172). В последние годы интенсивно разрабатываются модели складчатых цепей (139, 140). Наиболее распространенной является модель, согласно которой в молекуле целлюлозы чередуются свободные линейные участки, сложенные "стопками" (84).
Механизм гидролиза целлюлозы оставался до последнего времени дискуссионным. Деградация нативной целлюлозы является сложным процессом, требующим участия многих ферментов.
В начале 50-х годов Риз с сотрудниками (164), выдвинул предположение, что гидролиз нативной целлюлозы до растворимых Сахаров происходит в результате двухстадийного последовательного процесса. Они установили, что некоторые микроорганизмы способны усваивать высоко упорядоченную нативную целлюлозу, в то время, как другие могут расти только на частично деградированной или растворимой целлюлозе. Предполагали, что деградация нативной целлюлозы начинается с действия гипотетического предгидролитического С фермента, роль которого заключается в нарушении структуры кристаллических участков субстрата в превращении их в аморфные. Вслед за ними в реакцию вступает Ск ферменты катализирующие расщепление аморфной или "реактивной" целлюлозы до растворимых продуктов и целлобиаза, расщепляющая целлобиозу (164, 137). В дальнейшем было продемонстрировано, что культуральная жидкость одних штаммов способна г-идролизовать нативную целлюлозу, а других нет (138).
Хотя С( , Сх концепция ферментативного гидролиза целлюлозы была общепринятой на протяжении 20 лет, природа Cf- компонента оставалось загадочной. Предположение о том, что С фермент имеет негидролитическую природу (164, 167), и функция его заключается в разрыве водородных связей между соседными полимерными молекулами целлюлозы, не нашла до последнего времени каких-либо экспериментальных доказательств.
Напротив, рентгеноструктурный анализ кристаллической целлюлозы обработанной С/ ферментами не показал никаких изменений в структуре субстрата С163). Не состоятельными оказались попытки приписать этому ферменту и способность увеличивать набухание хлопкового волокна при последующей обработке щёлочью (201), и способность к уменьшению прочности волокон целлюлозы и их ферментации С185).
Была выдвинута гипотеза, согласно которой С фермент рассматрывается как "фактор сродства", не действующий непосредственно на природную целлюлозу, но образующий активный комплекс с Сх ферментами, которые связываются с не растворимой целлюлозой и вызывает ее деградацию (131). Однако не было обнаружено никаких изменений в .адсорбционной способности С, ферментов на целлюлозе в присутствии С фермента (203).
Зриксон с сотрудниками (95), выдвинули концепцию, по которой роль С; фермента могут выполнять особые оксидазы, разрывающие водородные связи и нарушающие кристаллическую структуру, но рядом авторов было показано, что степень участия окислительных ферментов крайне мала .
Биологические способы подготовки грубых кормов к скармливанию
В качестве грубого корма для сельскохозяйственных животных используется солома. . Однако она может быть эффективно использована животными, только после предварительной подготовки или при добавлении в другие виды кормов (110, 108).
Солома по энергии сухого вещества приближается к зерну, а по питательности в 5-Є раз ниже его, бедна протеином СЗ-5 %), содержит 35-45 % целлюлозы 3, 8, 48).
Для повышения питательной ценности соломы и улучшения поедаемости скотом перед скармливанием подвергают специальной механической (физической), химической и биологической обработке 1, 8, 18, 25, 53, 5Є, 133).
Физические методы включают измельчение соломы с последующим гранулированием, брикетированием, смачиванием подсоленной водой, запариванием. Питательность такого корма повышается в 1.5 раза и более. Гранулированные корма, обеспечивающие 100 2 питательности рациона, приводит к изменению типа пищеварения и обмену веществ жвачных животных, уменьшению бактериальной массы на единицу содержимого рубца исчезновению инфузории, при этом - резко снижается переваримость целлюлозы (108).
Брикетированные и гранулированные корма удобны для транспортировки и хранения, к последующей раздаче. Но получить хорошие результаты, не нарушая процесса пищеварения, можно только І применять их постепенно, используя прежде всего другие корма, \ например: силос, сено, солому. При физическом способе обработки , соломы, необходимы специальные средства производства и ] \ дорогостоящие оборудования. \ Химические способы более эффективны, вследствие разрушения связи лигнина и целлюлозы и усиления деятельности целлюлолитических бактерии. Кальцинирование требует специальных ёмкостей, в которых имеется приспособление для запаривания. Обработка кальцинированной содой, с запариванием требует скармливания в кратчайший срок. Обработка соломы жидким аммиаком и аммиачной водой способствует повышению протеиновой и энергетической питательности. Этот приём довольно кропотливый и сложный. Известны промышленные способы гидролиза соломы,ни они приводит к частичной деградации глюкозы и образованию нежелательных примесей. Для проведения кислотного гидролиза требуется дорогое, стойкое к коррозии оборудование СИ, 39, 40, 44, 50). Биологические способы обработки соломы направлены на то, чтобы не нарушать естественного процесса пищеварения, совершающегося в рубце животных. В процессе эволюции у жвачных в их желудках целлюлоза расщепляется до глюкозы и затем превращается в другие продукты. В присутствии азота часть глюкозы превращается в микробный белок, который затем переваривается и потребляется животным. Таким образом, целлюлозные бактерии вносят вклад в обеспечение животных белком. Это означает также, что полезность этого бактериального белка доказано (78). Своеобразный процесс пищеварения жвачных, у которых популяция микроорганизмов, обитающая в рубце находится в симбиотическом отношении между собой и с макроорганизмом, и физико - химические условия в рубце являются оптимальными для роста и размножения этих микроорганизмов. О роли рубцевых микоорганизмов в специальной литературе имеется много сообщений. Особенно хорошо исследован этот вопрос в работах 33, 53, 45). Значение различных групп целлюлолитических микроорганизмов, расщепляющих целлюлозу, в рубцевом пищеварении жвачных изучались многими авторами (61, 58,). Биологические способы обработки соломы направлены на повышение вкусовых и питательных свойств. При дрожжевании соломы обязательно вносят дрожжевую закваску, а также добавки, как суперфосфат, сульфат аммония, патоку или измельчённую свёклу, способствующих развитию ферментативных процессов. Наиболее распространен метод по погруженному культивированию в Канаде и Белоруссии, имеется Канадский проект получения обогащенных белком кормов. Аналогичные исследования проводятся и в некоторых других лабораториях мира. Используются различные микроорганизмы, обычно плесневые грибы, реже бактерии p. Cellulomonas (133). Процесс силосования создает оптимальные условия для развития определённых видов бактерии, например молочнокислых, которые сбраживают сахара до молочной кислоты, тем самым повышается кислотность до РН 4-4.2. Полноценный силос остаётся основным кормом в молочном животноводстве (Є5). Силосование с целью повышения питательной ценности соломы проводят с применением обогатительных добавок и закваски из молочнокислой бактерии. В качестве добавки могут служить мука, зерна злаковых культур, кормовая патока, молочная сыворотка, азото-содержащие соли, зелёная трава, бобовые, минеральные и др. добавки, существующие в специальных рецептах для силосования соломы (45). Изменение физических свойств соломы при силосовании способствует увеличению её поедаемости и усилению активности бактерии рубца, однако питательная ценность при этом остаётся на исходном уровне. Для силосования используют ферментные препараты глюкоаваморин Пх, Амилоризин Пх, Пектоваморин Пх, разрушающие целлюлозу, гемицеллюлозу, пектиновые вещества - -и другие полисахариды, которых не используют молочнокислые бактерии. Ферментация приводит к дополнительному образованию простых Сахаров, используемых в процессе силосования и обуславливает перевод трудносилосуемых кормов в хорошо силосуемые. В силосе с добавками грибных культур (8), снижается количество гемицеллюлозы, пектиновых веществ и целлюлозы, возрастает протеин, аминный азот. О благотворном влиянии грибов на биологическую ценность соломы указывают 184). Однако, с точки зрения белка одноклеточных, грибы привлекают мало внимания по двум причинам; грибы медленно растут, они могут продуцировать микотоксины во время культивирования 78, 92). До недавного времени, дрожжи считали полезными для силосования, но сейчас доказана, что дрожжи ухудшают качество силоса за счет разложения молочной кислоты, углевода и белка. Это приводит к повышению РН, развитию гнилостных бактерий и порче силоса (184). Все способы обработки соломы, её силосование с применением различных способов обогащения соломы легкосилосующимися кормами не повышает её питательности, но увеличивают её поедаемость (18, 25), поскольку солома не деградируется. При этом силосуются обогатительные добавки.
Изучение энзиматической активности при деградации целлюлозы
Чувствительность к антибиотикам определяли методом стандартных индикаторных дисков. Результаты анализа показали, что если исследуемые бактерии чувствительны к данным антибиотикам, то вокруг дисков образовалась зона отсутствия роста. Зона менее 10 мм свидетельствовала о слабой чувствительности к антибиотику, і
В нашем случае все испытуемые штаммы проявили отрицатеьную чувствительность и устойчивость ко всем испытуемым антибиотикам. Нетоксичность бактерии p. Cellulononas были ранее выявлены рядом авторов в экспериментах со скармливанием крысам 94). Мы для изучения патогенности исследуемых культур использовали односуточную живую культуру на физиологическом растворе вводили белым мышам подкожно и внутрибрюшинно в дозе 500 миллионов клеток 3 мышам на каждый штамм. v Для определения токсичности использовали взвесь убитых бактерии, фильтрат 20 суточной культуры вводили белым мышам. Через 7 дней после заражения белые мыши были умертвлены с последующим бактериологическим исследованием, который показал об отсутствии вирулентности и токсичности исследуемых штаммов бактерий. Таким образом, изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков штаммов продуцентов целлобиогидролаз позволило получить данные, всесторонне характеризующие каждый штамм. На оснований полученных данных произвели идентификацию штаммов бактерий рода Необходимо было выявить наиболее устойчивый к РН среде штамм, для использования его в обработке соломы так как одним из основных условий консервирования силосной массы является создание кислой реакции среды. С этой целью мы использовали метод градиентных чашек для получения мутантов. Культуру наносили в зоне более кислого значения РН и из клеток, которые туда засеяны давали рост только наиболее устойчивые к низким значением РН особи. Степень их устойчивости к кислым значением РН соответствовало их положению на градиентной чашке. Все эксперименты контролировались проверкой активности выработки целлюлолитических ферментов так как, только при сохранении этого признака возможно его использование для ферментации без применения различных добавок. Каждый день просматривались посевы и на. 5 день роста, когда заметно становились зоны разложения фильтровальной бумаги, отбирали колонии, при наиболее кислой реакции и наиболее активно к тому же разлагающие целлюлозу.
В результате данного исследования получен штамм целлюлолитических бактерии Cellulomonas uda (40), обладающий целлюлазной активностью и способностью расти при кислых значениях РН среды, что соответствовал нашим изысканиям.
По прогнозам ученых США и Японии целлюлолитические ферменты займут в ближайшем будущем доминирующее положение среди ферментов применяемых в качестве добавки корма, комбикорма и премикса 24, 9). .
Разнообразие целлюллолитических ферментов и их субстратов привели к многочисленным методам анализа OS, 141). Все целлюлолитические ферменты расщепляют &- 1.4 глюкозидные связи и отличаются специфичностью к структурам, содержащим эти связи. При гидролизе различных субстратов отличия в специфичности являются скорее количественными, поэтому достаточно сложно определить активность конкретных групп целлюлолитических ферменттов (40). Поскольку ферменты не только гидролизуют одни и те же субстраты, но и действуют в синергизме, величина измеряемой активности зависит и от соотношения присутствующих целлюлоз.
Основным аспектом применения целлюлолитических ферментов является полный гидролиз целлюлозы в различных целлюлоза содержащих материалах до глюкозы. Поэтому важно знать общую целлюлолитическую активность т.е. способность определенной смеси ферментов производить глюкозу из некоторого целлюлозо содержащего материала. Такие измерения не являются определениями активности ферментов в строгом смысле. Они являются тестами на гидролиз модельного материала, объединяющими как эффекты синергизма между отдельными ферментами, так и процессы ингибирования конечными продуктами. / - » С целью исследования активности Cf и С ферментов выращивали бактерии p. Cellulomonas на средах, где источникам углерода служили фильтровальная бумага и соломенный отвар, как источник азота N N0 CNH/()e SO j и дрожжевой экстракт. До стерилизаций РН среды составил Б.8. После 4 дней инокуляции суспензию центрифугировали. Супернатантная жидкость считалась не очищенным ферментом и его использовали для дальнейшего исследования. Для построения калибровочного графика и проверки реагентов приготовили раствор глюкозы (Difco) 0.01 -0.4 мг/мл. В пробирки вносили по 0.5 мл раствора глюкозы и по 0.5 мл реактива Сомоджи Пробирки помещали на Є0 мин в водяную баню при 50 С , затем охлаждали, вносили в каждую пробирку по 0.5 мл реактива Нельсона, интенсивно встряхивали и содержимое пробирок доводили до 12.5 мл диет.водой. Светопоглощаємость определяли при 610 нм относительно 0.05 М натри-ацетатного буфера,обработанного реактивами Сомоджи-Нельсона. Величину экстинкции измеряли с использованием с-пеколы.
Линейный участок зависимости и поглощения раствора от концентрации глюкозы лежал в диапозоне 0.01-0.2 мг/мл глюкозы (График 1). Из калибровочной линии мы находили коэффицент светопоглащаемости, который равен 0.15 (средне арифметическое).
Чтобы избежать погрешности фонового раствора мы проводили эксперимент в 4-ех вариантах опыт, опыт-контроль, контроль, контроль-контроль, где вычисляли светопоглощаємость испытуемых растворов контроль-опыта из опыта, контроль-контроля из контроля, в результате чего получили итоговую светопоглощаємость исследуемой культуральнои жидкости. Получив итоговую светопоглощаемость испытуемой культуральнои жидкости мы находили количеество редуцирующих Сахаров по следующей формуле.
Выделение, отбор и идентификация штаммов целлюлолитических микроорганизмов
В последние годы стали применять добавки ферментных препаратов к силосуемой массе, что способствует накоплению молочной кислоты и повышает качество силоса. Разработан и апробирован способ силосования соломы с целюлазами и пектиназами. Установлено, что добавка в силос этих ферментных препаратов повышает амилолитическую и пектинолитическую активности в содержимом рубце (Ездаков 1985) однако этот способ дорог и кропотлив.
Силосование грубых кормов - ферментными препаратами выделенными из целлюлолитических микроорганизмов экономически себя не оправдывает, требует больших затрат. Силосование молочнокислыми бактериями не приводит к деградации целлюлозы. Мы предлагаем удешевить и усовершенствовать способ применения соломы, исключив различные добавки, за счет использования целлюлолитических бактерий, обладающих способностью разрушать целлюлозы, гемицеллюлозы и другие полисахариды до простых Сахаров.
Данные таблицы показывает, что химический состав соломы характеризуется высоким содержанием целлюлозы и лигнина," некоторым наличием протеина и жира. Из литературных данных известия, что солома бедна Са, Р, Na, но богата кремниевой кислотой. кормов, должна, аминок испотному Согласно, современным представлениям оценка проводиться не только по уровню протеина, но и по составу белка (Табл. 19). Содержание тиамина и рибофлавина в биомассе испытуемой нами культуры бактерии Cellulomonas uda N 40 было несколько ниже чем, полученные данные в институте кормления в Мюнхене (Таблица 20). Анализированные материалы об аминокислотном и витаминном составе бактерми Cellulomonas говорит о питательной ценности биомассы данной культуры и возможности их использования для кормовой цели. Для ферментации соломы испытаны бактериальная культура идентифицированная нами ранее как Cellulomonas uda ( 40) а также молочнокислые бактерии Lactobacillus plantarium. Нарезанную солому пропитывали водой (на 1 кг соломы - 1.5 л, воды) и смешивали с суспензией целлюполитических бактерий (10 клеток в 1 мл) и молочнокислых бактерии в различных вариантах (табл. 21). Контролем служила увлажненная солома без добавлении закваски. Образцы хранили при 32е С. Через Є0 дней анализировали. Вычисление статистической характеристики показало: Дисперсия 3 ) колебалось от 0.0045-0.021, коэффициент вариации CV) был -7.5-33.3%, средняя ошибка CSx) находилось от 0.007-0.084, относительная ошибка (Sx X) - 4.4-18.2 %. Обращает на себя внимание то, что значение РН во всех вариантах опыта практически одинаково и характерно для корма хорошего качества. У соломы всех образцов отмечалось высокое содержание молочной кислоты от 0,43 до 0.72 Ж, по сравнению с контрольной (0.37 %). Содержание свободной уксусной кислоты колебалось от 0.27 до 0.49 %, а в контроле 0.17 %. Масляной кислоты содержалось в пределах 0.15-0.17 %, . а в контроле отсутствовало. Если в результате ферментации общее количество свободных кислот увеличивалось почти в два раза, то количество связянных кислот в сумме уменьшалось в 1.5 раза, засчет уменьшения масляной кислоты, в то время, как уксусная кислота увеличивалась в 2 раза. Наблюдалось появление редуцирующих Сахаров, количество которых в конце опыта было порядка 1.13 X, тогда как в контроле они отсутствовали, а содержание целлюлозы уменьшилось на 8.5 Z, по сравнению с исходным табл. 23). Доверительный интервал t 0,22 В данных экспериментах была испытана доброкачественная солома, содержащая характерную для нее эпифитную микрофлору. Однако в хозяйстветой практике поступает сырье, загрязненное посторонними микроорганизмами, которые ассимилируя с образующимся свободным сахаром, могут дать процессу нежелательное направление, поэтому мы сочли целесообразным ввести в закваску наряду с целлюлолитическими также и молочнокислые бактерии. С этой целью изучили методом отсроченного антагонизма наличие антибиотических веществ и бактериоцинов. В результате убедились, что штаммы целлюлолитических и молочнокислых бактерий не образуют друг к другу бактериоцинов и антибиотических веществ, что дало возможность силосования соломы этими штаммами вместе. Через 60 дней взяли пробу ферментированной соломы для биохимического и микробиологического анализа. Результаты анализа даны в таблице 24, 25. Органические кислоты определяли по Флигу-Леппера. Редуцирующие сахара определяли по Сомоджи-Нельсона и целлюлозу по Андеграфу.
